体外定点突变技术

体外定点突变技术 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也 是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者 之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改 变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表 达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿 色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发 光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸 收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色 荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位 点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、 基因治疗等等方面。 对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。准备突 变的质粒必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回 到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增， 不会形成多个***拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质 粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没 有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的 克隆。这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有 效。另外由于Pfu聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一，堪称高保真聚合酶 的“黄金标准”，是Stratagene的看家之宝，能够有效避免延伸过程中不需要的 错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。只需 要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。这个试剂盒适用于质粒大小不超过8Kb的质粒。后来推出的QuikChange XL site-directed mutagenesis kit则是针对大于8Kb的质粒的定点突变的，通过优化试剂特别是其感受态细胞（XL10-Gold），使得较大的质粒的定点突变也一样简单。QuikChange由于操作简单快速，效率高 （ >80%）而受到普遍欢迎，光是今年的前9个月就有超过400篇发表的中用到这个产品。 定点突变的比较有特色的产品还有Clontech公司的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit，需要根据准备突变的质粒自行设计两条引物（同一方向，对 同一单链模版），一条包含计划定点突变的序列，另一条引物包含质粒上某一个 单酶切位点，不过在单酶切位点中引入突变，这样两条引物除了所包含的突变位 点，其他序列和质粒上对应位置的序列完全一致，退火后和质粒模版结合，通过 T4 DNA聚合酶延伸，延伸反应持续直到碰到另一条引物停止，两段包含突变位点 的延伸产物经T4连接成环，和模版链组成杂和环，带有两处错配。单酶切反应产 物，直接转化Ecoli BMH 71-18 mutS(错配修复缺陷株)。原来的双链质粒模版被切开而不能转化，而杂和质粒由于一条链上单酶切位点引入突变而不被切开，保 持环状质粒得以转化。转化子的杂和双链在E.coli的复制过程中分开，再经过一轮提质粒、单酶切、转化，最后得到纯和的突变质粒。这个试剂盒则是利用改造 单酶切位点使得新合成的突变质粒不被切开从而除去原来的模版质粒。虽然这个 试剂盒比上一个麻烦，但实际上是引入了两个定点突变。只不过一个用于酶切除 掉模版的反应。 有的时候研究可能需要多个位点的定点突变，比如改造酶的活性或者动力学特 性，研究蛋白之间的相互作用位点等，单点突变不能满足实验的需要，重复进行 单点突变也非常浪费时间。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。最多一次实验可以引入5个定点突变。这个试剂盒的原理和Clontech的相似，就是准备多个带突变的引物（同方向，对同一单 链模版），退火后全部突变引物（不超过5个）都结合在同一环状单链模版， PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片断经连接成环，和单链模版 组成杂和环，DpnI消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多 个突变的单链环（mutant ssDNA），得以转化E.coli，形成双链质粒。资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒，以引入3个定点突变为例，就是有40% 左右的转化质粒是带有1—2个不同定点突变的质粒（因为存在1—2个引物结合模版延伸形成单链环的可能）。这样，一次实验可以得到不同数目突变的质粒，对于研究蛋白质结 构和功能的关系也是有用的。 不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改变PCR条件提高PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全局性分析，所以有人称为饱和突变 （saturation mutagenesis）。不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁 琐，并且不会出现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有局限性。定点突变 适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比PCR随机突变更有目的性，也更为精确， 简单，同时改造基因更加“随心所欲”。由于定点突变技术在蛋白质组学中有这 非常广泛的应用前景，相信这个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展，也 必将为更多人熟悉应用。 吃力的话参考以下说明：（不同公司的，原理部分可作参考） 1.引物设计： 用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计： (1) 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。 (2) 引物的长度通常为25-45个碱基。 (3) 引物中突变位点任何一侧都必须满足4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)?45。但引物也不宜过长，否则通常会形成非常稳定的 二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右，且使两侧按照上述计算得到的数值相近。 例如引物为agtcaggccaattcgaagcagtcgaattgccaag，其中蓝色的aag为突变位点，则 左侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X7＝46?45 右侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数) ＝4X8＋2X8＝48?45 (4) 在可能的情况下，尽量把引物的GC含量控制在40％-60％。 (5) 在可能的情况下，尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。二级结构和二聚体可以通 过一些软件进行分析。 最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。 2. 引物的配制： 如果合成得到的一个引物A的量是20nmol，另外一个互补引物B的量是19nmol。在引物A中加入200微升水，配制成浓度为100μM 的溶液，在引物B中加入190微升水也配制成浓度为100μM。吸取20微升100μM引物A和20微升100μM引物B到一新的离心管中， 再加入160微升水，混匀后即可得到可以直接用于基因定点突变反应的引物(10μM each)。 3. 待突变模板质粒的选择： 选择GC含量在40-55％的待突变模板质粒，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果GC含量过高，请先把目的 基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。另外目的基因GC含量最好也在40-55％的范围，并且每一个50bp左右 的局部GC含量最好也不超过70%。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的 一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果必须使用高GC含量的质粒模板，或者有局部高 GC含量的质粒模板，请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。 必须使用从dam+的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变。常用的大 部分大肠杆菌都是dam+ 的，包括DH5α、JM109等。 4. 基因定点突变反应： (1) 如下设置基因定点突变反应体系： Nuclease-Free Water ?微升 Reaction Buffer(10X) 5微升 引物(10μM each) 2微升 dNTP Mix(2.5mM each) 4微升 待突变模板质粒(0.5μg) ?微升 总体积 49微升 按照上述顺序依次加入各种试剂。在上述反应体系中，根据待突变模板质粒的量，计算出需加入的 Nuclease-Free Water的量， 使总体积为49微升。适当混匀后，加入1微升Pfu DNA Polymerase，混匀。如果用的PCR仪没有热盖，在反应体系上加入一滴矿 物油(mineral oil)以防止蒸发。 (2) 按照如下参数设置PCR仪： 步骤 循环数 温度 时间 说明 1 1 95? 1分钟 最初变性 2 18 95? 40秒 变性 60? 1分钟 退火 68? 1分钟/kb 延伸 3 1 72? 10分钟 延伸、补全 4 1 4? 长时间保持 暂时存放 说明：上面中1分钟/kb表示，如果待突变的质粒为6kb，那么68?的延伸时间为6分钟。 5. Dpn I消化： PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1微升Dpn I，混匀后37?孵育1小时。37?孵育可以在PCR仪上进行，也可以在水浴锅中 进行。Dpn I消化完毕后可以直接用于转化，或者-20?保存备用。 6. 转化、挑克隆鉴定： 感受态细菌的转化效率必须至少在107以上，否则很难得到克隆。根据所使用的感受态细菌，加入尽量多的 经过Dpn I消化后的突 变产物用于转化。通常每100微升感受态细菌中可以加入5-10微升经过Dpn I消化后的突变产物。按照所使用的感受态细菌的操 作方法进行操作，在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌，全部涂布到含有适当抗生素的 平板上，培养过夜。通 常会得到50个以下的克隆。如果发现克隆有上千个，那么肯定是有什么地方出了问题。 对于得到的克隆，可以先挑克隆小抽酶切鉴定。以确认得到的质粒的大小和质粒中插入片断的大小与预期 结果是否相符。 取3-5个酶切鉴定正确的克隆去测序，以最终确认得到的克隆是否是预期的突变克隆。通常大约每2个克隆中会得到一个预期的突 变克隆。但有时也可能会因为随机因素，会测序了3-5个克隆才得到一个预期的突变克隆。 QuikChange?和QuikChange? XL用于制备位点特异性突变，氨基酸置换、删除，插入单个或多个氨基 酸，但是不会造成任何意外突变。QuikChange?最适合用于小于8 kb的模板，而QuikChange? XL经优化更适合用于大于8 kb模板的突变。QuikChange? Multi采用独特的机制，能在小于8kb的模板上引入5个不同位点的突变或氨基酸置换，而且不会造成任何意外突变。 ? QuikChange?系列定点突变试剂盒采用什么方法？ QuikChange? (包括常用型和XL型)：与载体双链分别互补的一对突变引物经温度循环将突变带入新生成的 扩增产物中。由于引物经特别设计，每轮扩增开始时，都会只有新的引物与原始模板杂交。整个扩增完成 后，用Dpn I处理去除带甲基化的原始模板链。将带缺刻的突变产物转入XL2-Blue 超级感受态细胞，细菌连接酶修复缺刻后，突变质粒即可在细菌中正常复制了。铺板后，80%以上的克隆会带有突变。 QuikChange?多点突变试剂盒可以快速、可靠地在质粒DNA上同时完成5—7个定点突变。每个突变位点设计 一个相应的寡核苷酸引物，直接采用双链DNA模板，只需经1天3步的操作即可完成。 根据双链模板之一合成包括突变的引物，PfuTurbo DNA聚合酶在非链置换反应条件下进行高保真扩增，得到双链DNA分子，其中之一带有多突变位点和缺刻。缺刻随即会被试剂盒所带的特殊混和酶封闭。扩增反应 产物经Dpn I核酸内切酶消化，去除模板DNA，再转化XL10-Gold超级感受态细胞。 ? QuikChange?系列试剂盒采用什么模板？ 要求用带甲基化的DNA。大多数种类的大肠杆菌都能对质粒DNA甲基化。只要DNA不是从dcm-或dam-(甲基化 缺陷型)菌株中制备的，即可用作该试剂盒的模板。此外，模板DNA应是通过小提或氯化铯纯化制备的。 ? QuikChange?系列试剂盒使用的引物必须经纯化吗？ 经实验证明，不用SDS-PAGE纯化引物，效率会降低约20%。 ? 怎么区分突变质粒和模板质粒? QuikChange?是根据多数种类的E. coli带有dam甲基化活性，纯化自这些菌株的原模板带有甲基化的现象来 去除原模板。Dpn I是专 切甲基化和半甲基化DNA的限制性酶，因此可用于在线性扩增反应后消化原质粒 DNA，这种设计保证了突变效率高而背景极低。 ? 哪些E. coli菌株可以配合QuikChange?系列试剂盒使用？ 几乎所有的分子生物学日常操作时采用的E. coli均可以用于与QuikChange?配套。下列菌株带有 DpnI酶切 必需的 dam 甲基化，可以明显降低背景。 XL1-Blue BL21 AG1 BL21 Star? XL1-Blue MRF' BL21 (DE3) TG1 cells BL21 AI? XL1-Blue MR BL21 (DE3) pLysS ElectroTenBlue? GeneHogs? XL2-Blue BL21 Gold DH12S HB101 XL2-Blue MRF' BL21 Gold (DE3) pLysS DH10B DP50 XL10-Gold BL21 Gold (DE3) pLysS DH5α NM514 XL10-Gold Kan ElectroTenBlue? JM101 C600 SURE TKB1 NM522 AD494 SURE2 TKX1 SCS1 HMS174 ABLE C and K strains TOPP JM109 BLR -------------------------------------------------------------------------------- ? 常用型 QuikChange ?试剂盒可删除的最大片段是多少？ 从2.9 kb和5.7 kb的重组子上删除12 bp效率均达100%。 有用户从5.6 kb质粒上删除84 bp片段获得58%的效率。 ? 常用型 QuikChange?试剂盒可插入的最大片段是多少？ 从2.9 kb的重组子上插入12 bp效率均达95%。 有用户报告在8 kb 质粒上插入18bp片段获得80%的效率。 ? QuikChange? XL试剂盒最大可用多大的质粒? 经 Stratagene公司检测，QuikChange? XL试剂盒可用11 kb的质粒。 某用户成功地进行了19 kb质粒上的点突变。 ? QuikChange?多点突变试剂盒与QuikChange?、QuikChange? XL有什么区别? QuikChange? Multi是目前唯一已经商品化的能在一个质粒上同时引入5个不同位点突变的试剂盒。 与其它QuikChange?试剂盒机制不同，该试剂盒可以让你一次实验就完成5个点突变，还可以用简并核苷酸制备点 特异性文库。突变反应或制备文库均可在1天内高效完成，并获得满意结果。该试剂盒要求每个突变位点的 对应引物仅带有单个突变寡核苷酸(可使用简并寡核苷酸)。 ? QuikChange? 多点突变试剂盒可用的最大质粒有多大？ 已经在8 kb质粒上成功完成了多点突变。 我涉及的领域理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向 进化的基本先决条件. 所谓酶的体外定向进化（directed evolution of enzyme in vitro）, 又称实验分子进化（experimentally molecular evolution）, 属于蛋白质的非合理设计（irrational design），它不需事先了解酶的空间结构和催化机制［1］，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进 化机制（随机突变、重组和自然选择），在体外改造酶基因, 并定向选择出所需性质的突变酶. 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解 决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其 生命力. 1 定向进化的原理 在待进化酶基因的PCR扩增反应中, 利用Taq DNA多聚酶不具有3′?5′校对功能的性质, 配合适当条件, 以很低的比率向目的基因中随机引入突变, 构建突变库, 凭借定向的选择方法, 选出所需性质的优化酶（或蛋白质）, 从而排除其他突变体. 定向进化的基本规则是,“获取你所筛选的突变体”［2］. 简言之, 定向进化=随机突变+选择. 与自然进化不同, 前者是人为引发的, 后者虽相当于环境, 但只作用于突变后的分子群, 起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行 的. 2 随机突变的策略 2.1 易错PCR 易错PCR（error-prone PCR）［3，4］是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配, 导致目的基因随机突变. 然而，经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR（sequential error-prone PCR ）策略. 即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板, 连续反复地进行随机诱变,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变. Chen等人［5，6］用此策略使在非水相（二甲基甲酰 铵, DMF）溶液中定向进化枯草杆菌蛋白酶E的活性获得成功，所得突变体PC3在60%和85%的DMF中, 催化效率kcat/Km分别是野生酶的256和131倍, 比活性提高了157倍. 将PC3再进行两个循环的定向进化［2］, 产生的突变体13M的kcat/Km比PC3高3倍(在60%DMF中), 比野生酶高471倍. 在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部, 故属于无性进化（asexual evolution）. 它较为费力、耗时，一般适用于较小的基因片段（<800 bp）. 此外, 使用该方法易出现同型碱基转换. 2.2 DNA改组和外显子改组 DNA改组（DNA shuffling）［7，8］又称有性PCR(sexual PCR)，原理如图1所示. 该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会, 导致更大的变异, 最终获取最佳突变组合的酶. 在理论和实践上, 它都优于“重复寡核苷酸引导的诱变”和“连续易错PCR”. 通过DNA改组, 不仅可加速积累有益突变 ［9］, 而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体［10～15］. 外显子改组（exon shuffling）［16，17］类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换， 前者尤其适用于真核生物. 在自然界中, 不同分子的内含子间发生同源重组, 导致不同外显子的结合, 是产生新蛋白质的有效途径之一. 与DNA改组不同,外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动, 而DNA改组不受任何限制, 发生在整个基因片段上. 外显子改组可用于获得各种大小的随机肽库. 2.3 杂合酶 杂合酶（hybrid enzyme）［18］是把来自不同酶分子中的结构单元（二级结构、三级结构、功能域） 或整个酶分子进行组合或交换, 以产生具有所需性质的优化酶杂合体. 有许多途径可以产生杂合酶，如定 位诱变、DNA改组、不同分子间交换功能域，甚至整个分子融合. 杂合酶可用于改变酶学或非酶学性质, 是了解酶的结构-功能关系、以及相关酶的结构特征的有力工具，不仅如此，它还可以扩大天然酶的潜在应用， 甚至可以产生催化自然界不存在的反应的新酶分子. 杂合酶方法的有效性和实用性已得到了实验的证实 ［19～25］. 2.4 体外随机引发重组 体外随机引发重组（random-priming in vitro recombination, RPR）［26］以单链DNA为模板, 配合一套随机序列引物, 先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段, 由于碱基的错配和错误引发, 这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中, 它们互为引物进行合成, 伴随组合, 再组装成完整的基因长度. 如果需要, 可反复进行上述过程,直到获得满意的进化酶性质（图2）.该法优于DNA改组法的特点在于：（1） RPR可以利用单链DNA为模板, 故可10～20倍地降低亲本DNA量; （2） 在DNA改组中, 片段重新组装前必须彻底除去DNase ?, 故RPR方法更简单; （3） 合成的随机引物具有同样长度, 无顺序倾向性. 在理论上，PCR扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相似的频率发生突变; （4） 随机引发的DNA合成不受DNA模板长度的限制. 2.5 交错延伸 交错延伸（stagger extension process, StEP）［27］原理的核心是, 在PCR反应中把常规的退火和延 伸合并为一步, 并大大缩短其反应时间(55?, 5 s), 从而只能合成出非常短的新生链, 经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸. 此过程反复进行, 直到产生完整的基因长度, 结果产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子(图3). StEP法重组发生在单一试管中, 不需分离亲本DNA和产生的重组DNA. 它采用的是变换模板机制, 这正是逆转录病毒所采用的进化过程［28］. 该法简便且有效, 为酶的体外定向进化提供了又一强有力的工具. 2.6 酶法体外随机-定位诱变 为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题, 我们曾以类胰岛素样人参多肽基因和天冬氨酸酶基因为模 型, 探索了一种酶体外诱变的新途径, 即酶法体外随机-定位诱变(random-site-directed mutagenesis) ［29～32］. 该方法的内涵与酶的体外定向进化类似, 对目的基因既采用随机突变增加突变位点, 以快速产生优质酶,又让其突变受到一定限制, 以减少筛选突变体的工作量. 实际上, 该法也是体外模拟自然进 化. 不同点在于，通过控制DNA合成的底物种类和浓度比例实现碱基对的错配. 从上述策略不难看出,随着分子生物学技术的发展, 可以更灵活、快速和简便地改造目的基因. 从功能出发, 先获得某优化的突变体, 一方面可快速将其推向应用, 另一方面将对蛋白质的理论研究起到更大的 推动作用. 图1 DNA改组原理 图2 体外随机引发重组原理 图3 交错延伸原理 3 定向进化的选择策略 尽管用上述方法可向人类提供新的有价值酶,但酶的功能突变常常被埋没在众多的中性突变和不利突 变群中. 采用回交（back-crossing）法，将已进化的子代突变酶基因与野生酶基因重组［33］, 可排除这种干扰. 这样, 出现中性突变的频率只是50%, 可全部去除不利突变. 在定向进化中, 尽管突变具有随机性, 但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势, 加之控制实验条件, 限定突变种类, 降低突变率, 缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量, 更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度. 通常, 筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关［34，35］. Venekei等人［36］报道了快速、有效地筛选蛋白水解酶突变体的方法和最佳筛选条件, 主要是利用蛋白酶选择平板初选, 再配合活性染色（activity staining）和X-光片消化分析（X-ray film digestion assay）加以验证, 并检测其活力, 快速筛选了44 000个突变株. Roberts等人［37］用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性酯酶结合力更强的抑制剂. 从含有4 900个突变体的基因库中，获得与该酶的结合能力高于野生蛋白质3.6×106倍的突变体, 比已报道的任何一个相应 的抑制剂高50倍［38］. 另有一些其他的筛选方法［39，40］, 如加入能产生可见光信号的底物［17］或利用绿色荧光蛋白的 荧光性质［41］等. 总之, 选择在酶的体外定向进化中至关重要,直接关系到其成败. 4 定向进化的优势、现状和未来 较之蛋白质分子的合理设计, 酶的体外定向进化属于非合理设计（irrational design）. 其突出的优点是, 不需事先了解酶的空间结构和催化机制. 它适宜于任何蛋白质分子, 大大地拓宽了蛋白质工程学的 研究和应用范围. 特别是它能够解决合理设计所不能解决的问题［11，42～44］，使我们能较快、较多地了 解蛋白质结构与功能之间的关系，为指导应用（如药物设计等）奠定理论基础.此外,该技术简便、快速、耗资低且有实效. 总之, 酶的体外定向进化是非常有效的更接近于自然进化的蛋白质工程研究的新策略. 它不仅能使酶进化出非天然特性, 还能定向进化某一代谢途径; 不仅能进化出具有单一优良特性的酶, 还可能使已分别优化的酶的两个或多个特性叠加, 产生具有多项优化功能的酶，进而发展和丰富酶类资源; 完全在试管中进行的酶（或蛋白质）的体外定向进化使在自然界需要几百万年的进化过程缩短至几年［10］，这无疑是蛋白质工程技术发展的一大飞跃. 目前，对一些酶（或蛋白质）(表1）、砷酸盐解毒途径［45］、抗辐射性［46］、生物合成途径［47］、对映体选择性［48］、抗体库［49］以及DNA结合位点定向进化［50］ 的可喜成果令众多的相关科学家为之振奋. 可见, 进化能发生在自然界, 也能发生在试管中，它与合理设计互补, 将会使分子生物学家更加得心应手地设计和剪裁酶（或蛋白质）分子, 将使蛋白质工程学更加显示出强大的威力和诱人的前景. 表1 酶的体外定向进化应用实例 酶 性 质 突变方法 参考文献 枯草杆菌蛋白酶E 有机相活性/稳定性 易错PCR ［2, 26, 27］ β-内酰胺酶 总活力/底物专一性 DNA改组 ［7］ 枯草杆菌蛋白酶BPN′ 稳定性 盒式诱变 ［51］ 对硝基苯酯酶 底物专一性/有机相活性 易错PCR/DNA改组 ［9,10］ 胸腺嘧啶核苷激酶 底物专一性 盒式诱变 ［52］ β-半乳糖苷酶 底物专一性 DNA改组 ［17］ 绿色荧光蛋白 荧光 DNA改组 ［41］ 核酶 底物专一性 易错PCR/DNA改组 ［53］ 天冬氨酸酶 活性与稳定性 随机/定位诱变 ［29～32］ 药物和疫苗 活性/专一性/最佳表达 DNA改组 ［54］ 应强调的是, 为了提高酶体外定向进化的成功率, 需注意以下几个关键问题:（1） 确定目的酶在所需功能方面的进化程度和潜力; （2） 选择一个最接近人们需要的酶分子作为起点（包括用作下一循环的起 始突变体），这涉及将酶引入单一的进化途径，如果选择失误, 便可能中途“夭折”; （3） 若用于理论研究, 应控制较低的突变率，只有选择最佳进化策略，保证库中所有克隆只含有单一氨基酸取代(每代只有一个氨基酸变化), 那么从一代到另一代的功能变化便能与突变表型一一对应起来; （4） 建立有效且灵敏的选择方法, 确保检测出由单一氨基酸取代而引起的功能变化. 目前, 已建立了一些酶（或蛋白质）的体外定向进化的有效方法, 但还应探索扩展定向进化潜力的最佳途径和提高对突变的控制能力. 选择方法尚待开发与完善, 有必要发展小型化分析和高度自动化的大规 模选择模式, 特别是对那些无明显可借鉴表型的突变体的选择, 可能是今后该领域科学家切实努力的目 标. 来点自己的经历 一两年前，突然想：只用一条PCR引物能否引入突变？查文献没查到。于是自己动手，针对puc19 lacZ中的kpnI位点设计了一段突变突变用引物，如果work那么kpnI位点会被消除，同时引入终止密码子导致细菌不 显蓝色而显白色。用puc19质粒为模板，就加入这么一条引物，扩增了3、40个循环，然后直接转化coli。转化混合液直接液体氨苄培养基培养，第二天提取质粒然后用kpnI筛选，酶切产物再直接转化，涂布IPTG-Xgal平板。有白色菌落。酶切以及测序证明work.白/兰=2%左右。 当时非常高兴，想着可以发一篇sci小文章了。 于是再搜索相关文献。nnd，一个美国佬已经发在biotechniques上了，而且是2000年，我先前搜索没查到。吐血n升后，我向这位美国人要来了全文，发现他的方法更好：一条引物PCR后，纯化，然后用DpnI处理（质粒模板是coli生产的，因此带有甲基化，会被DpnI去除），然后转化。突变效率不错。 各位看官也许会问：DpnI处理后，PCR产物不只剩下线状新生单链了吗？美国人的解释是：还会存在痕量模 板，很可能这些痕量模板与线状新生单链成环，于是被coli接受。 全文如下： Makarova et al. Biotechniques 2000.pdf (41.99k) 怎么去掉模板呢？再简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般 都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型 的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不会那么凑巧吧，哈哈。 关于第三个问题： 直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，呵呵，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序 （这个就不用我多说了吧），验证突变结果，一般都没问题的啦，我做了几十个突变了，到目前为止还没有 做不出来的，呵呵，不要砸我啊。 下面讲一下具体的实验步骤以及一些实验中要注意的事情： 1、 根据现有基因设计引物； 2、 合成引物并准备好模板； 3、 PCR， 4、 DpnI处理酶切产物； 5、 转化酶切产物； 6、 筛选 阳性克隆； 7、 送测序并测全长。 最后就是庆祝啦，呵呵，没什么复杂的。 引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。 那种Quick change试剂盒分为几种不同的类型 什么QuikChange? Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange? XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。 另外，DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净， 哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。 实验板长出来的菌有两种可能 一种是质粒DPNI没处理干净长出来的（模板），一种是PCR产物转化出来的 （突变体） 不过这两种菌长得一模一样^_^，即使提出质粒来也是一样（酶切和PCR都无法区分），除了测序，是分不出来的， 做PCR时也最好做一个负对照（不加引物）， 实验管由于PCR时有引物，所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产物，而对照管由于PCR时没放引物， 所以在DPNI处理前里面只有模板。 如果两者都拿去DNPI处理 就能够证明模板已经被去除干净。 若实验顺利的话应该是：正对照长菌负对照不长菌。 如果出现正负对照都长菌，那么就是DpnI没处理好， 如果正负对照都不长菌，那么有两种可能，一种是PCR阴性，也就是说PCR出问题了，另外一个可能就是转 化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了问题，那就做个转化的对照，拿试剂盒的对照实验去试 感受态，马上就能知道转化有没问题。 如果正对照很多菌，负对照有几个菌，那么就是DPNI处理得不干净，这个时候就得靠运气了^_^ 大家有什么问题我们可以继续讨论。 另外，如果大家既没有DpnI酶也没有好的PCR酶和BUFFER的话，那也有其它办法进行定点突变，只是麻烦一 点，如果大家有需要的话，我会把方法贴上来。 对于多点突变技术及较长片段的缺失插入技术，同样的，如果大家有需要的话，我会把方法贴上来。 不过，如果你有钱的话，那就去买那个试剂盒吧，其中QuikChange? Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange? XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）的原理我上面已经说了，只是补充了一些我认为的注意事项。如果你更有钱的话，那么你可以叫其它公司帮 你做定点突变服务，大约是改一个点1000元左右。如果有需要我可以提供公司的联系方式。 我现在遇到的问题是：我最开始是用QuikChange?II Site-Directed Mutagenesis Kit做的。送去了一个 结果没有突变！ dingo8369 您好：做点突变有三步最重要，其它的并不是很关键 第一点就是引物要设计好，也就是说要确保要突变的那个点在引物的中间，如果只是突变一个碱基，那么 两边各15个BP那肯定没问题，如果是突变三四个碱基，那么两边 就要适当地加长，如加长到18个BP甚至更长。 第二点就是要PCR，如果PCR做不出来，那实验肯定失败，虽然PCR阳性的话跑胶并不一定能够跑出来，但是 如果跑胶能跑出来的话那么肯定就是PCR阳性。一般情况下跑胶跑不出来也可能是因为循环数做得太少。一 般情况下?II Site-Directed Mutagenesis Kit配的Turbo那个扩增酶保真性能挺好的，也是PFU酶嘛，所以循环数可以多一点没关系，二十五个应该没问题的，不会有新的点突变的。这样跑胶就能看出来阳性阴 性。同时做PCR时要做负对照。 第三点就是DPNI处理了。这个不要说了，如果处理得不干净，那么模板质粒长出来，那么一测肯定就是没 突变过来了。 dingo8369 我猜可能你是DPNI没处理好，我的建议是你取1uLPCR产物去做DPNI处理就行了（加上BUFFER和DPNI，最后体系10UL），早上放去酶切，下午两三点拿去转化，按我的经验它可以将PCR产物的模板去除得非常干净。 由于你说的不够具体，所以我不能做进一步的帮忙。 airforce8128 ： 你稍等一下吧，写这个挺费神的，我会尽快把它写出来的。 下面我以一个例子为例来讲100个bp以下的碱基插入缺失或者改变实验。其实这种方案并不是那么好的，只不过考虑到大家一般都没有TYPEII限制性内切酶或者UDG and NTHIII（另外两种方法）， 所以才打算先介绍这种方法。 首先先说明一点，这种 方法在原理上存在一定成功机率，也就是说有运气成分。而定点突变则一般都是百 分之百成功的，而这种100bp以下的插入缺失或者碱基改变可能要测几个克隆才能挑到一个好的克隆，大家如果要用请慎重考虑。 同样的，我只变那几十个碱基，并没有改变载体及其它地方，所以我还是依赖于DPNI酶。 举例： Homo sapiens FzE3 是一个人类基因，其含有32个氨基酸的信号肽MRDPGAAAPLSSLGLCALVLALLGALSAGAGA， 后面是成熟肽QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDI AYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPC RSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYP TAPYLPDLPFTALPPGASDGRGRPAFPFSCPRQLKVPPYLGYRFLGERDCGAPCEPGRAN GLMYFKEEERRFARLWVGVWSVLCCASTLFTVLTYLVDMRRFSYPERPIIFLSGCYFMVA VAHVAGFLLEDRAVCVERFSDDGYRTVAQGTKKEGCTILFMVLYFFGMASSIWWVILSLT WFLAAGMKWGHEAIEANSQYFHLAAWAVPAVKTITILAMGQVDGDLLSGVCYVGLSSVDA LRGFVLAPLFVYLFIGTSFLLAGFVSLFRIRTIMKHDGTKTEKLEKLMVRIGVFSVLYTV PATIVLACYFYEQAFREHWERTWLLQTCKSYAVPCPPGHFPPMSPDFTVFMIKYLMTMIV GITTGFWIWSGKTLQSWRRFYHRLSHSSKGETAV，想在信号肽和成熟肽之间插入一个FLAG标签并在标签前面加上一 个Leucine。即在信号肽和成熟肽之间插入一段序列：TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG（一共三十个bp） 实验设计： 信号肽： ATGCGGGACCCCGGCGCGGCCGTTCCGCTTTCGTCCCTGGGCTTCTGTGCCCTGGTGCTG GCGCTGCTGGGCGCACTGTCCGCGGGCGCCGGGGCG 成熟肽： CAGCCGTACCACGGAGAGAAGGGC ATCTCCGTGCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATC GCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGC CTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCCCGAACTCCGCTTT TTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCCATCCCGCCGTGT CGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTC CAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGTGCGGGCGAGATCTGC GTGGGCCAGAACACGTCGGACGGCTCCGGGGGCCCAGGCGGCGGGCCCACTGCCTACCCT ACCGCGCCCTACCTGCCGGACCTGCCCTTCACCGCGCTGCCCCCGGGGGCCTCAGATGGC AAGGGGCGTCCCGCCTTCCCCTTCTCATGCCCCCGTCAGCTCAAGGTGCCCCCGTACCTG GGCTACCGCTTCCTGGGTGAGCGCGATTGTGGCGCCCCGTGCGAACCGGGCCGTGCCAAC GGCCTGATGTACTTTAAGGAGGAGGAGAGGCGCTTCGCCCGCCTCTGGGTGGGCGTGTGG TCCGTGCTGTGCTGCGCCTCGACGCTCTTTACCGTTCTCACGTACCTGGTGGACATGCGG CGCTTCAGCTACCCAGAGCGGCCCATCATCTTCCTGTCGGGCTGCTACTTCATGGTGGCC GTGGCGCACGTGGCCGGCTTCTTTCTAGAGGACCGCGCCGTGTGCGTGGAGCGCTTCTCG GACGATGGCTACCGCACGGTGGCGCAGGGCACCAAGAAAGAGGGCTGCACCATCCTCTTC ATGGTGCTCTACTTCTTCGGCATGGCCAGCTCCATCTGGTGGGTCATTCTGTCTCTCACT TGGTTCCTGGCGGCCGGCATGAAATGGGGCCACGAAGCCATCGAGGCCAACTCGCAGTAC TTCCACCTGGCCGCGTGGGCCGTGCCCGCCGTCAAGACCATCACTATCCTGGCCATGGGC CAGGTAGACGGGGACCTGCTGAACGGGGTGTGCTACGTTGGCTTCTCCAGTGTGGACGCG CTGCGGGGCTTCGTGCTGGCGCCTCTGTTCGTCTACTTCTTCATAGGCACGTCCTTCTTG CTGGCCGGCTTCGTGTCCTTCTTCCGTATCCGCACCATCATGAAACACGACGGCACCAAG ACCGAGAAGCTGGAGAAGCTCATGGTGCGCATCGGCGTCTTCAGCGTGCTCTACACAGTG CCCGCCACCATCGTCCTGGCCTGCTACTTCTACGAGCAGGCCTTCCGCGAGCACTGGGAG CGCACCTGGCTCCTGCAGACGTGCAAGAGCTATGCCGTGCCCTGCCCGCCCGGCCACTTC CCGCCCATGAGCCCCGACTTCACCGTCTTCATGATCAAGTGCCTGATGACCATGATCGTC GGCATCACCACTGGCTTCTGGATCTGGTCGGGCAAGACCCTGCAGTCGTGGCGCCGCTTC TACCACAGACTTAGCCACAGCAGCAAGGGAGAGACCGCGGTATGA 插入序列 TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG 通过引物3端大于或等于18个碱基的匹配使引物与模板质粒搭配，再通过引物5端的序列来补上那三十个碱 基，先用PNK酶把引物磷酸化，再用下面这两条引物把整个质粒给扩增出来，上游和下游引物就刚好把那三 十个碱基给补上了，再参照引物的设计原则做一些润色，细心的朋友可以具体分析一下这两条引物。扩出 来后再用DPNI酶把模板质粒去掉，再用连接酶把PCR产物的两端连接起来（虽然是平端连接 ，可是由于是 同一条PCR产物的两端连接，效率会很高），转化后，测序验证，OK。 设计引物 forward primer:GGACTACAAAGACGATGACGACAAGCAGCCGTACCACGGAGAGAAG 88.5 reserve primer: ATTAACGCCCCGGCGCCCGCGGACAGT 86.9 但是由于引物的合成是由3端向5端合成，而且每合成多一个碱基的效率最多也是百分之九十九点几而不是 百分之一百，所以我们拿到手的引物其实是一个混合物，比如说我们合成一条长二十个碱基的引物，实际 上拿到手的是一个混合物，里面即含有二十个碱基的引物，也含 有一定比率的十九个、十八个、十七个……碱基的引物。 所以我们用这种方法做PCR时，如果连上的是足额长度的引物，那么实验也就成功了，如果连上的是少一两 个碱基的引物，那么实验就失败了，不过引物当中主要的仍是足额长度的引物，所以成功机率还是蛮高的。 不过送测序时就要做好准备，可能要测三五个才能拿到一个好的。 如果觉得这样不好的话，我稍后会附上用TYPEII酶或者UDG，NTHIII做的方法，它们是通过互补粘端来连接，就不存在这个问题。 下面附上详细实验过程： 第一步：设计引物；其实只要符合一般引物设计原理就行了，顺便说一下，引物一般的话，越长其质量 就………… 第二步：引物PNK处理，一般合成的引物其三端是没有磷酸化的，所以我们要自己进行磷酸化，一般可以让 其磷酸化过夜，不磷酸化的话最后一步连接就连不上哦。 第三步：PCR，跟基因定点突变一样，要用好的扩增酶和BUFFER，因为要把整个环高保真的圹增出来嘛； 第四步：DPNI处理，跟基因定点突变一样，要把模板去除干净。 第五步：连接，加上连接BUFFER和连接酶连接， 第六步：转化。 OK 大家如果有什么疑问，我们可以一起继续讨论。 楼主您好！ 我感觉做短片断的定点突变，是否是先把目的片断定点突变好后，然后再连入载体好些呢？我的感觉是， 要是整个质粒太大，用再好的酶，也难保PCR扩增的保真性。因为虽然好多公司制作出了号称扩增多少个kb 也没有突变的酶，但是在实际操作中，我们会发现，这些酶的保真性并没有想象那么好。 另外，在您所讲的方法之后测序时，测序会比较麻烦，因为要测整个质粒的序。 我的方法是： 1.设计定点突变的引物 2.扩增目的片断 3.目的片断和质粒的双酶切 4.双胶连 5.转化 6.鉴定