PCR产物的T载体连接和转化演示课件

PCR产物的T载体连接和转化PCR产物的A尾巴和T载体连接酶T4DNALigase1967酶连将4.5μLPCR产物转移到无菌微量离心管中，加入0.5μLT载体，加5μL2×连接buffer，16℃连接反应12小时以上。转化取200ulE.coliDH5α感受态细胞转移至无菌离心管中，每管加2ul酶连产物，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min，将离心管放到预先加热到42℃的循环水浴中，恰恰放置90秒，不要摇动试管。快速将离心管移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟，每管加800ulLB培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将离心管转移至37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且达质粒编码的抗生素抗性基因。已转化的感受态细胞转移至20mmol/LMgSO4和相应抗生素的LB琼脂平板上，将平板于室温至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养，12-16小时后可出现菌落。