人血清HDL载脂蛋白A—I的分离纯化

人血清HDL载脂蛋白A—I的分离纯化 人血清HDL载脂蛋白A—I的分离纯化 一7 衡阳医学院1992年第20卷第i期 人血清HDL载脂蛋白A—I的分离纯化 生化研究室李福芳李波平I/陈嘉勤滕华聂宁华 一——,Q,|f,? , 摘要甩序列超速离心法从血清中分离高密度脂蛋白(皿L),经0.5琼脂糖凝 胶电泳显示为一条区蒂.HI)L载艏蛋白(apoHDL)先妊SephadexG一200凝胶过滤柱层析, 取峰I中部洗脱液,再通过DE一52离子交换柱层析分离出戴脂蛋白A—I(apoA -- I),用0.1%SDS—PAGE证实为单一区带,分子量为28000道尔顿. 关键词HI)L;枷些震翮 近年来,疽行病学的研究表明,HDL具 有抗动际粥样硬化的作用.ApoA--I是 HI)L的主要载脂蛋自,它不仅在HI)L结构 中起着重要作用,面且还是卵磷脂胆周醇酰 基转移酶(LcAT)的激活剂,在血浆胆固醇 的醣化和运输中亦起着非常重要的作用此 外,APoA—I通过与HDL受体结合,可将 外周组织的胆圃醇转运至肝脏代谢0.为了 进一步深入研究apoA一1在抗动际粥样硬 化中的作用机理,进一步研究apoA—I对 LCAT的激活机理,研究HDL将外周组织 胆圃醇转运刊肝脏捧除体外的机理,建立一 种有效分离纯化人apoa--I的方法是必要 的- _ 材料与方法: 材料蹰备apoA一1的人血清(衡阳医 学院第二附属医院血库供应),SephadexG , 200(pharmada产品);DEAE一纤维紊一 52<Whatman产品);琼脂糖(上海东海制药 厂)}丙烯酰胺,NN亚甲基双丙烯酰胺(浙 江黄岩人民化工厂)}考马斯亮兰G一250 (Fluka进口分装){氨基黑10B(Merk产 品)}低分子量蛋白(中国科学院生化研 ?30? 究所);尿素(A?R,广东台山化工厂) 仪器80P一7型日立翻备超速离心 机;751G塑分光光度计~BS423型恒流恒压 电泳仪TH--250梯度混合器}zY系捌层 析柱;共和式真空冻结干燥机,RLE一2l型 (日本共和真空技术株式会社). 方法?’ LHDL的分离,脱脂根据Havel等. 的方法,用序列超速离心法分离人血清 HI)L.在100m|血清中用固体NaBr调密度 至L019,30000rpm,10?,离心18h,吸取 顶部呈乳白色的VLDLr下层血清的密度自 L019调至1.063,40000rpm,10?,离心 24h,吸取顶部呈黄色界面的LDL}下层血 精的密度由L063调至L21,50000rpm, l0?,离心24h,吸取顶部呈枯黄色液层的 HDL,下层为去脂血清其它蛋白质然后将 HDL移入透析袋内,透析48h,换液6,8 次.透析液是在l升去离子蒸馏水中吉 N2HP0;?O3.61克,NaC18.76克, EDTA0.1克,pH7.4.脱脂根据Scan~的方 法0,先用预冷的乙醇和乙醚(3t2体积比) 混合液脱脂6h,离心(3000rpm,15min),再 用预冷的乙醚脱酯三次,脱脂时HDL的浓 度为5rag~mr.样品和有机溶剂的比为1: 25(体积比)左右.整个脱脂过程中温度维持 在一2O?.脱脂后的HDL(aportDL)用氮气 吹干.一2O?密封保存备柱层析用. 2.Ap0A—I的分离纯化参考文献0 用SephaderG一200凝胶过滤与DE一52离 子交换柱层析相结合进行.将apoltDL溶解 于6mol/L尿素.pH8.2,0.1mol/LTris? HCl(含0.01mol/LEDTA)中,并以上述缓 冲液作平衡液和洗脱液,经SephaderG一 200层析柱(1X120em)分离,在室温下进 行,流速4mI/h,用自动部分收集器定时收 集.洗脱后丹别测定各收集管样品的O? D280nm值,可得到4个蛋白峰取峰I中 部洗脱液,对DE一52离子交换柱层析的起 始缓冲液(Tris?HC10.01mol/L,EDTA 0.001,尿素6moI/L,pH8.2)透析后,加 八DE一52离子交换层析柱(1.5×30cm), 经梯度洗脱(pH8.2,0.01,O.15moI/LTris ? HcI缓冲液,含6mol/L尿素,0.01ED— TA).洗脱速度为12ml/h,在室温下进行, 用自动部分收集器定时收集.洗脱后分别测 定各收集营样品的O?D280nm值,可得到 四个蛋白峰.再取峰I洗脱液对50mmol/L 碳酸氢铵透析后,分装于安瓶中,真空冻结 干燥机浓缩干燥,密封于一2O?保存. 0.5琼脂糖凝胶电泳根据王克勤等0 方法.0.1sDs—lO聚丙烯酰胺凝胶电 泳用垂直板状电泳槽进行0. 实验结果 HDL的分离提纯用序列超速离心法 制备的HDL,经0.5琼脂糖凝胶电泳,氨 基黑10B染色显示为一条区带(图1),未发 现有其它蛋白质污染. - 3l- 加样处C= P脂蛋白 前日脂蛋白 a脂蛋白 —? ?—一 一—一 (1)(2)+ 图l琼脂糖凝胶电泳 注:(1)正常人血清E(2)超速离心分离的 HDL HDL的脱脂在有机溶剂脱脂后, apoHDL在水相可以完全溶解,用化学方法 测定不含胆固醇和甘油三脂,磷脂含量小于 l(重量比). ApoA—I的分离纯化apoA一1经 SephadexG一200柱层析后可分为四个蛋 白质峰,依次编号为峰I,I,I和?(图 2). 峙 o ? .| 洗脱体积(m1) 图2apoHDL的Sephad~G200层折图 取峰I中部洗脱液对DE一52离子交 换柱层析进一步分离纯化,可分为四个蛋白 质峰,依次编号为峰I,I,-和?(囤3). . 1 洗脱体积(m1) 图3Ap0A—I的DE—s2离于交换层析图 取峰I洗脱液,经0.IsDs一10PAGE 显示为一条区带(图4).根据SDS--PAGE 的迁移率计算,该apoA—I的平均分子量为 28000遭尔顿,表明是纯的apoA—I. (1)(2) 图4SD6一只AGE 注:(1)用DE--52分离纯化的apoA--II(2)低 分子量标准蛋白质. a,磷酸化酶BMW=94000 b,牛血清白蛋白MW=67000 c,肌动蛋白MW=43000 d,碳酶酐酶Mw=30000 e,烟草花叶病毒外壳蛋白MW=17500 ? 32? 讨论 用序列超速离心法可将血液各种脂蛋 白组分完全分离开的虽然离心时间冗长, 但此法简单可靠,重复性好.用醇醚混台渣 脱脂的方法脂质清除率较高,和Scanu的结 果基本一致. 目前国外大多采用凝胶过滤法分离 spoA—I,缺点是apoA--I主峰的拖尾部分 常常被ap0A—I污染.因此,本文在凝脏过 滤之后再增加一次DE,52离子交换层析, 可获得较纯的apoA—I制品,为HDL和 apoA—I的分离纯化及大量制备提供了较 理想的方法. 参考文献 1,NillerGJ,ets1.Plasmahighdensity llpoproteinconcentrationanddevelop- meatofischaemicheartdiasase.Lancet 1975;(1):16 2.MadejkoJ】,eta1.ApoproteinA,1as markerofang/ographicallyassessedcots— naryarterydisease,NewEngJMed I983;309}385 3,林荫.高密度脂蛋白受体研究的新进展. 生命的化学1988;8(2):6 4,HavelRJ,eta1.JClinInvest1955;34: 1345— 5.SeanuAM,eta1.Formsofhumanserum highdensityllpoprotein.JLipidRes 1966;7:295 6.林荫,等.载脂蛋白A--I多志性研究.上 海医科大学1990}17(1):51 7.王克勤,等.人血清脂蛋白的研究Iv:人血 清高密度脂蛋白的大量分离和进一步提 纯和鉴定.中国医学科学院1979; 121 8.低分子量标准蛋白质说明书. IsoiationandPurificationofApolipoproteinA--IfromHuman SerumHighDensityLipoprotein LiFu~ang,etal Depa~’tmentofBiochemistry,HengyangMedicalCollege Humanserumhighdensitylipoproteinwanisolatedbyaprocessofsequenceu ltracen— trifugatlo~i,yieldingasinglebandon0.5agarosegelelectrophoresisandcontainednoaIbu rain.Theh/ghdensity[ipoprotelnwasdelipidatedandfraetionatedsephadexG一200chfor matographyintof0urpeaks.The2ridpeakwantakenandisolatedbyDEAE一 52ionexehan~e ehromatography.TheapolipoproteiaA--1wasshowntobepure,whichyieldedasinglehand withamolecularweight28000whenanalyzingwith0.1SDS—l0polyacylam idegdeJec— trophoresis. KeyWordshighdensitylipoprotein;apolipoproteinA—Iichromatography ?33?