【doc】小檗碱、隐丹参酮对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞凋亡相关基因的影响
小檗碱、隐丹参酮对胰岛素抵抗卵巢颗粒细
胞凋亡相关基因的影响
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小檗碱,隐丹参酮对胰岛素抵抗卵巢
颗粒细胞凋亡相关基因的影响
杨琳,祁冰,宋家欣,侯丽辉,吴效科
黑龙江中医药大学附属第一医院妇产科.哈尔滨150040
摘要通过基因芯片技术研究小檗碱,隐丹参酮对胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞基因表达的影响.选择猪卵巢颗粒细胞为体外研究对象.
利用磷酯酰肌醇一3激酶(PI一3K)特异性抑制剂——沃曼青霉素人工诱导胰岛素抵抗的细胞模型.以O.O2g/L小檗碱,隐丹参酮进行
干预,继续培养48h.以Trizol法提取总RNA,采用猪全基因表达谱芯片技术筛选出差异表达基因.将筛选得至0差异基因输入MAS
(MoleculeAnnotationSystem)中进行显着性统计分析.结果显示:小檗碱组与沃曼组比较.与细胞凋亡有关的18个基因表达发生
显着变化:而隐丹参酮组有12个.这些差异表达的基因涉及TNF家族,6c2基因家族,Caspases家族,MAPK信号通路及凋亡传导通
路,细胞循环传导通路和tgfb—smad3传导通路.通过对基因芯片上表达水平发生改变基因的分析推测,小檗碱,隐丹参酮诱导卵巢
颗粒细胞凋亡是多种途径共同作用的结果.其中Fas和Caspase途径通路上的基因以及细胞周期调控相关的基因可能发挥了主要
作用.
关键词多囊卵巢综合征;小檗碱;隐丹参酮;基因芯片;凋亡基因
中圈分类号R271,R28,Q789文献标识码A文章编号1000—7857(2008)16—0042—05
DetectionandAnalysisofApoptosis
RelatedGenesofInsulinResistance
GranularCellsInducedbythe
TraditionalChineseMedicineby
DNAMicroarray
YANGLin,QIBing,SONGJiaxin,H0ULihui,
WUXiaoke
DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstAffiliated Hospital,HeilongfiangUniversityofChineseMedicine,Harbin 150040,China'
AbstractTostudyapoptosisrelatedgenesofinsulinresistance granularcellsinducedbyBerberineandCryptotanshinoneusingDNA mieroarray,ovariangranulosecellsfromporcinefollicleswereisolated andculturedinvitro,andinsulinresistancewasinducedbytreatment withWortmannin.Thecellsweredividedinto4groups,theblank controlgroupculturedwithDMSO,theWortmanningroupcultured withwortmanninof250nmol/L,theBerberineandCryptotanshinone groupculturedwithWotrmanninof250nmol/Laswellastheonewith BerberineandCryptotanshinoneof0.02Afterbeingincubatedfor 48h.totalRNAwasisolatedformcells.andthedifferentexpressed geneswerescreenedfromthembygenechiptechnique,thenanalyzed byMAS(MoleculeAnnotationSystem)togetdifferentialgene expressionprofilesandpathwaysofthefourgroups.Comparedwith thoseinthewortnmnningroup,therewere18apoptosis-relatedgenes differentlyexpressedafterthetreatmentofBerberine,whiletherewere 12withthetreatmentofCryptotanshinone.Thosegenesbelongtothe TumorNecrosisFactor(TNF)ligandandreceptorsuper-family, Caspasefamily,bcl-2family,cyclin-dependentkinasesandinhibitors, MAPK,apoptosisandTGF'13/smadspathways.Resultsshowthatthe apoptosisprocessofgranulosacellinducedbyBerberineand
Cryptotanshinoneinvolvesmanygenesandpathways,andthegenes
amongFasandCasepasepathwaysandcellcycleregulatedgenesmay
playapivotalrole,andthusmaypromotecellapoptosisandinhibitcell
proliferation.
Keywordspolycysticovarysyndrome;berberine;cryptotanshinone;
DNAmicroarray;apoptosisgenes
收稿日期:2008—06—06
基金项目:黑龙江省自然科学基金项目(zJY0606一叭)
作者简介:杨琳.哈尔滨市香坊区和平路24号黑龙江中医药大
学,E-maihyanglinO00888love@163.COIYI;侯丽辉(通信作者),哈尔滨市香坊区和
平路24
号黑龙江中医药大学附属第一医院妇产科,教授,E—mail:xiaokewu@nju.edu.cn 42科技导报2008,26(16)
0引言
多囊卵巢综合征(PolycysticOvarySyndrome,PCOS)是生
育年龄妇女常见的内分泌疾病,不仅出现代谢异常,同时伴
有生殖障碍,其发生率占生育年龄妇女的6%,8%E",以月经
稀发,无排卵,高雄激素血症为主要特征.现代研究认为胰岛
素抵抗(InsulinResistance,IR)和高胰岛素血症在PCOS的发
病机制中具有重要的地位[21,并且PCOS患者卵巢本身存在
IRPJ.表现为胰岛素调节糖代谢信号途径受损,即"选择性胰
岛素抵抗".现代药理研究证明中药黄连的提取物小檗碱有
胰岛素增敏剂作用,丹参的提取物隐丹参酮有良好的降雄
激素作用(51.本课
组在有关PCOS的病理机制,治疗方法等
方面做了多年的研究?,为明确小檗碱和隐丹参酮对胰岛素
抵抗卵巢颗粒细胞基因表达的影响,本课题通过基因芯片技
术对其基因表达差异进行分析和研究.
1材料与方法
1.1研究对象及药物
选择猪卵巢颗粒细胞为体外研究的对象.药物:小檗碱 (上海融禾医药科技有限公司,批号:070928,20mg/支,粉针 剂);隐丹参酮(上海融禾医药科技有限公司,批号:070815,20 mg/支,粉针剂).
1.2方法
1.2.1原代猪卵巢颗粒细胞培养
将新鲜的猪卵巢放入预先注入高浓度双抗(青,链霉素 各含80万U/500mL)的无菌PBS缓冲液中.于37?条件下1 h内带回实验室,用此种缓冲液反复冲洗猪卵巢数次,在无菌 条件下剥离卵巢外膜,然后用1mL注射器抽吸卵泡液.将卯 泡液注入装有PBS的离心管中,以1500r/min的速度离心 10min,弃上清,用此种PBS缓冲液洗涤细胞2次.离心后弃 上清,用预先配好的DMEM/F12培养基(含10%FBS)稀释细 胞并计数,以10~mL的细胞浓度接入培养瓶中,在5% CO:,95%空气,饱和湿度,37?培养箱中培养48h. 1_2_2胰岛素抵抗细胞模型的建立及实验分组
细胞培养48h后换液,随机分为4组,分别按实验
图1溶剂组基因表达芯片扫描图
Fig.1ProbearrayscanogmmofDMSOgroup
eview
加入药物.溶剂组:加二甲基亚砜(DMSO);沃曼青霉素组:加 入沃曼青霉素,其在细胞培养液中的终浓度为250nmo]/LI9];
小檗碱组:同时加入沃曼青霉素,其在至细胞培养液中的终 浓度为250nmol/L和小檗碱,其在细胞培养液中的终浓度为 0.02g/L:隐丹参酮组:同时加入沃曼青霉素,其在细胞培养液 中的终浓度为250nmol/L和隐丹参酮,其在细胞培养液中的终 浓度为0.02g/L.加入相应的干预因素后继续培养48h. 1.2.3Trizol法提取总RNA
细胞干预48h后,弃上清,并用PBS缓冲液冲洗细胞1 次,在细胞沉淀(细胞浓度为106/mL)中加入2.5mLTrizol,彻 底匀浆后用细胞刮刀轻刮,室温静置10min.在倒置显微镜 下观察,细胞悬浮.转至1.5mL无酶的离心管.4组标记后, 在低温条件下(干冰)邮寄至北京博奥生物有限公司,进行猪 全基因组基因芯片分析.
2结果
2.1总RNA抽提结果
从4组细胞中分别提取的总RNA质检显示:?01igoB2, Poly—AControls,HybridizationControls等阳性对照信号正常; ?看家基因信号值及3/5比值正常;?平均背景值与噪音 值较低;?PresentPercent数值正常;?Test3芯片结果正 常.各质控指标符合要求,证实已抽提出高纯度的总RNA. 2.24组基因芯片扫描结果
4组基因芯片扫描图像分别见图1,图4.质控芯片扫描 图像见图5.沃曼青霉素组/空白对照组,小檗碱组/空白对照 组和隐丹参酮组/空白对照组细胞的基因表达荧光信号散点 图,分别见图6,图8.其差异表达基因分布在远离散点图对 角线(y)的位点上.
2.3差异表达基因的筛选
小檗碱组和隐丹参酮组基因信号值分别与沃曼青霉素 组相比,筛选出比值大于1.5倍,或小于0.75倍的数据项.将 筛选得到差异基因输入MAS中进行路径和作用的显着性统 计分析,发现差异基因涉及细胞凋亡,细胞周期等信号通路 上的成员.小檗碱组与沃曼组比较,与细胞凋亡有关的l8个 图2沃曼组基因表达芯片扫描图
Fig.2ProbearrayscanogramofWortmaningroup
科技导报2008,26(16)43
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国墨譬互墨
图3小檗碱组基因表达芯片扫描图
Fig.3ProbearrayscanogmmofBerberinegroup
图5质控芯片扫描图
Fig.5GenechipTEST
l0100t0(】ol0?
游棚螂信哮值
图7小檗碱组/溶剂组基因表达散点图
Fig.7ScaRerdiagramofBerberineVSDMSO 基因表达发生显着变化:隐丹参酮组有12个.这些差异表达 的基因涉及TNF家族,bcl-2基因家族,Caspases家族,MAPK信 号通路及凋亡传导通路,细胞循环传导通路和tgfb-smad3传导 通路.见表1,表2.
3讨论与结论
中医学中的"证"是疾病发展过程中某一阶段的整体概
括,基因表达谱是疾病某一阶段特征性差异表达的所有基
因.用基因芯片进行中草药提取物对体外培养细胞基因影响 44科技导报2008,26(16)
图4隐丹参酮组基因表达芯片扫描图
Fig.4ProbearrayscanogramofCryptotanshinonegroup
图6沃曼组/溶剂组基因表达散点图
Fig.6ScaRerdiagramofWortmaninVSDMSO 0O10lll0l00l0(X)100tlO0伽0
溶捌缎情母值
图8隐丹参酮组/溶剂组基因表达散点图
Fig.8ScaRerdiagramofCryptotanshinoneVSDMSO
的研究,筛选显着差异表达的基因,得到相对集中的传导途 径,将有助于阐明药物作用的分子机制,为中药的研究提供 量化指标.
PCOS的中医发病机理比较复杂,是先天禀赋与后天因 素共同作用的结果[91.侯丽辉将PCOS的核心病机归结为肾, 肝,脾功能失调导致的"痰瘀胞宫",其痰瘀壅滞于胞宫表现 为闭经,不孕,卵巢呈多囊性改变等症状,而痰浊阻塞肌肤则 可表现为肥胖,多毛.PCOS根据其临床四联症(闭经,不孕, 肥胖,多毛)可以确定其病位主要是在胞宫,肌肤和脂肪.中
兼
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表1小檗碱组/沃曼组细胞凋亡相关基因的差异表达l…鼻j able1Apoptosis~relSted籍怡删D,纫嬲Wo~manin|| 药黄连,丹参有活血化瘀,祛痰湿的作用,现代中医多用此两 味中药改善PCOS患者的胰岛素抵抗和高雄激素血症. 本课题利用基因芯片技术来研究小檗碱,隐丹参酮对胰 岛素抵抗卵巢颗粒细胞基因表达的影响可以说是一种新的 尝试.中药干预组与造模组比较,筛选差异表达的基因,经生 物信息学分析后发现:FAS,BAX,J,CASPASE等促凋亡 基因上凋;J和PCNA等抑凋亡基因下调.分析推测.小 檗碱和隐丹参酮诱导颗粒细胞凋亡,其机制是多种途径共同 作用的结果,其中Fas和Caspase途径通路上的基因以及细 胞周期调控相关的基因可能发挥了主要作用.本研究从基因 分子水平探讨了小檗碱,隐丹参酮对胰岛素抵抗卵巢颗粒细 胞凋亡相关基因的影响,初步揭示了诱导凋亡的机制. 有实验证实运用沃曼青霉素诱导颗粒细胞胰岛素抵抗. 其葡萄糖摄取功能下降.糖代谢通路障碍,并且导致MAP通 科技导报2008,26(16)45
eVlew
路放大,MAPK,PCNA分子表达水平上调,表现出卵巢颗粒细
胞增殖分裂亢进l101.根据本研究结果进一步推测,颗粒细胞在
胰岛素抵抗状态下,胰岛素受体信号转导通路糖代谢通路受
损的同时,其促分裂通路放大,应用中药提取物小檗碱,隐丹
参酮后,达到抑制细胞增殖,促进凋亡的作用.中医理论认
为,痰,瘀是在脏腑功能失调过程中形成的病理产物.课题组
选用活血祛瘀的中药,恢复其正常气血运行,使胞宫恢复经,
孕,产的功能,达到化痰祛瘀生新的目的,并且为中医药临床
治疗PCOS提供科学依据
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(Or任编辑王芷)
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学术动态?i
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??中国光学学会2008年
学年会''正在征文
25日在福建省泉州市举行.中国光学学会2008年学术年会将于2008年11月20—
该会议由中国光学学会主办,华侨
大学,泉州市人民政府和福建省光学学会联合承办
会议将设如下专题:工程光学和光学制造;生物医学光子学;光电技术与系统;光学薄膜技术新进展;光纤与集成光学
理论,器件及应用;精密光学测量新进展;光传感器技术及其应用;非线性光学与介观光学;光纤传感和光通信;激光物理,
技术与应用;激光制造技术及产业化;激光在医学领域中的应用与研究;全息与光信息处理;瞬态光子学;新型光学材料及
其应用;颜色科学与成像技术;原子相干性及其应用;部分相干光学及其应用. 参会者可通过会议指定网站递交摘要,经专家评审录用后提交全文.摘要字数限制在300宇之内.会议指定《光学学
报》,《中国激光》,《光子》,《中国激光医学杂志》为会议优秀论文的收录发表期刊(正刊或增刊).凡申请刊登在上述4
个期刊上的文章摘要截止日期为7月30日,全文截止日期为9月10日;凡不要求在上述期刊上刊登的文章,摘要和全文
截止期为1O月15日.被录用会议宣读发表的论文审议结果将分批刊登在中国光学学会网页上.本次会议录用发表的全部
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?有关会议的相关信息,泉州市情况介绍见中国光学学会网站WWW.cncos.org.? +
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46科技导报2008,26f16)