HPLC法测定多维片中痕量维生素D3的含量
HPLC法测定多维片中痕量维生素 D3 的含量
王乔飞
(江苏江山制药有限公司,江苏 靖江 214500)
摘要:建立了运用 HPLC法对痕量 VD3 进行含量测定的分析方法。实验中采用菲罗门硅胶(silica)柱,以异丙醇:正己烷
(0. 5:99. 5)为流动相,流速:2ml /min,紫外检测波长:264nm,柱温:30℃。实验表明:VD3 在 0. 1μg /ml ~ 0. 8μg /ml 范围
内,其色谱峰面积与质量浓度呈良好线性关系,r = 0. 9999(n = 5) ,平均回收率为 99. 04%,进样精...
HPLC法测定多维片中痕量维生素 D3 的含量
王乔飞
(江苏江山制药有限公司,江苏 靖江 214500)
摘要:建立了运用 HPLC法对痕量 VD3 进行含量测定的
方法。实验中采用菲罗门硅胶(silica)柱,以异丙醇:正己烷
(0. 5:99. 5)为流动相,流速:2ml /min,紫外检测波长:264nm,柱温:30℃。实验表明:VD3 在 0. 1μg /ml ~ 0. 8μg /ml 范围
内,其色谱峰面积与质量浓度呈良好线性关系,r = 0. 9999(n = 5) ,平均回收率为 99. 04%,进样精密度为 1. 26%。本法操
作简便、快速,准确,适用于痕量成分的含量测定。
关键词:维生素 D3 ;高效液相色谱 ;含量测定
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:1009 - 7961(2010)03 - 0082 - 03
Determination of Trace VD3 in Multi - vitamins with HPLC
WANG Qiao - fei
(Jiangsu Jiangshan Pharmaceuticals Co. Ltd.,Jingjiang Jiangsu 214500,China)
Abstract:An analytical method is established for detecting trace vitamin D3 in multi - vitamins tablets with
HPLC. In the experiment,the chromatographic column of Phenomenex silica is used,and hexane (0. 5:99. 5)
is in the mobile phase;the flow rate is 2. 0ml /min,the UV detective wavelenth is 264nm and column tempera
ture is 3 0 ℃ . A good liner correlation is found between the peak areas and the concentrations in the range of
0. 1 - 0. 8 ug /ml of VD3(r = 0. 9999,n = 5). The average recovery is 99. 04%;the precision is 1. 26% . The
method proves to be rapid,accurate and applicable for the determination of the trace in vitamin D3 .
Key words:vitaminD3;HPLC;determination
收稿日期:2010 - 05 - 21
作者简介:王乔飞(1970 -) ,男,江苏靖江人,执业药师和执业中药师。
多维片是综合营养保健品,其成份极其复杂,
不但包括各种水溶性和脂溶性维生素,还有多种
补充的微量元素,其中 VD3 是一种脂溶性维生素,
其含量极低,样品中仅约含 2. 5ug /g,且性质不稳
定,遇光和空气均易变质、降解,而且其它杂质对
其稳定性和检测都有影响和干扰,其含量测定一
直是个瓶颈难题。
有关资料提供的方法,主要采用添加碱液进
行皂化反应,然后采用石油醚、乙醚多次萃取,再
用氮气流吹干处理。不但操作过程繁琐,而且样
品的回收率不稳定,操作的重现性很差。有的方
法在对样品中 VD3 充分溶出作了考虑,但在处理
过程中缺少抗氧、防吸附,减少干扰等措施,致使
成分仍有损失而回收率偏低。有文献报道,采用
反相色谱系统测定,但对于脂溶性维生素采用反
相系统,样品回收率不满意。
本文提供了一个实用、易操作的检测方法,无需
进行皂化处理和反复萃取等繁琐操作,而是针对
VD3性质不稳定,制剂成分复杂的情况,分别采取了
避光、抗氧,抗干扰分离手段,取得了较好效果。特
别适用痕量 VD3的准确测定。该方法未见报道。
1 仪器与试药
1. 1 仪器
Agilent 1200 HPLC系统,配紫外检测器。
1. 2 色谱条件
色谱柱:菲罗门 luna 5um silica 柱 250 * 4. 6
mm;流动相:异丙醇:正己烷(0. 5:99. 5) ;流速:2
ml /min;检测波长:264 nm;进样体积:75 uL。
1. 3 试药
对照品:VD3:USP standance,Cat no:13100,
Lot:MOB157
第 19 卷第 3 期 淮 阴 工 学 院 学 报 Vol. 19 No. 3
2010 年 6 月 Journal of Huaiyin Institute of Technology Jun. 2010
试剂:正己烷、异丙醇、二甲亚砜为色谱纯;氯
化钠、抗坏血酸、吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(AP-
DC)为分析纯。
2 实验方法与结果
2. 1 各试液的制备
对照品贮备溶液:精密称取 60. 0mg ± 0. 1mg
维生素 D3 对照品于一 250ml 棕色容量瓶中,立即
用正己烷溶解并稀释至刻度,此溶液浓度为
0. 24mg /ml。
对照品标准溶液:精密吸取上述对照品贮备
溶液用正己烷溶剂再分步稀释 500 倍后,得对照品
标准溶液。
样品溶液制备:取 5g APDC 和 1 g 抗坏血酸,
溶于 1000mL DMSO中,具塞,避光保存,作为萃取
溶液;取 20 片样品磨细,精密称取约 5. 0g 细粉于
一 200mL棕色具塞锥形瓶中,加 25mL 萃取液,上
述溶液于超声水浴机中 60 ± 3℃超声 15min,取出
放冷至室温,加入 25. 0mL正己烷,强烈振摇,再加
15mL18% NaCl溶液,缓缓摇动,具塞放冷。高速
涡旋混匀约 5min,再静置 5min,吸取上层液体于一
50mL离心管中,高速离心约 5min,取正己烷上清
液过滤后注入 HPLC液相色谱仪。
2. 2 系统适应性试验
分别制备对照品标准溶液和样品溶液,各取
75μL注入液相色谱仪,分别
对照品标准溶液
和样品溶液色谱图(如下图所示) ,结果 VD3 和其
它杂质峰的分离度大于 2. 0,理论板数按 VD3 峰计
算大于 2500,表明该系统适应性良好。
图 1 对照品标准溶液色谱图
图 2 样品溶液色谱图
2. 3 线性关系
精密称取维生素D3对照品,配制浓度为
0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8μg /mL 的溶液,分别进样,
记录色谱图,色谱峰面积分别为:9 . 40,18 . 64,
37. 81,57. 30,75. 77。对照品峰面积与进样浓度作
线性方程:A = 97. 521C - 0. 191,C 表示浓度,单
位:mg /mL。(n = 5,r = 0. 9999) ,样品溶液浓度范
围为 0. 1 ~ 0. 8μg /mL。其关系如图 3。
图 3 工作曲线
2. 4 精密度试验
2. 4. 1 进样精密度试验
取对照品溶液连续进样 6 次,记录峰面积,分
别为:48. 2,48. 3,48. 2,48. 0,46. 7,47. 7,计算精密
度,平均峰面积为 47. 85(n = 6,RSD =1. 26%)。
2. 4. 2 重复性试验
取本品,照样品溶液制备方法处理,进行含量
测定,重复测定 6 次,峰面积分别为 53. 86,53. 25,
53. 66,53. 45,54. 07,53. 59。平均峰面积为 53. 59
(n = 6,RSD = 0. 62%)。重复性试验表明,本法的
重复性较好。
2. 4. 3 中间精密度试验
在不同时间,由化验室同事照同法操作,用美
国 Waters 600 液相色谱系统进行检测,记录色谱
图,计算 VD 3平均含量,得 VD 3平均含量为
2. 540 ug /g,RSD为 0. 41%。
2. 5 溶液稳定性试验
取 2. 4. 2 项下样品溶液,在 0h、1h、2h、4h、6h、
8h时各进样一次,记录色谱图,得 VD3 峰面积的
RSD为 0. 36%,但杂质峰的总峰面积在 6 小时后
第 3 期 王乔飞:HPLC法测定多维片中痕量维生素 D3 的含量 83
有所增加。
2. 6 回收率
分别制备含 80%,100%,120%维生素 D3 的
样品,测试回收率。结果见表 1。
表 1 样品回收率结果
加入量(IU /g) 峰面积 测得量(IU /g) 回收率(%) 平均值% RSD%(n = 9)
80 38. 6 78. 72 98. 40
80 38. 8 79. 14 98. 93
80 39. 0 78. 52 99. 40
100 52. 6 100. 82 100. 82
100 51. 0 100. 02 100. 02
100 52. 0 100. 08 100. 08
120 56. 2 117. 68 98. 07
120 55. 2 117. 30 97. 75
120 55. 4 117. 44 97. 87
99. 04 1. 11
在配方量的 80% ~ 120%范围内,测定平均回
收率为 99. 04%,RSD为 1. 11%(n = 9) ,说明该测
定方法准确度较好。
3 结论
由于产品中 VD3 含量很低,能将其充分溶解
出来是实验成功的关键,本法采用万能溶剂二甲
亚砜,并进行超声水浴处理,保证其充分溶出。
针对 VD3 遇氧不稳定,准确测量痕量 VD3 含
量,提高其回收率,关键是处理过程中要增加稳定
手段,同时,由于组分复杂,为减少干扰损失,须采
取适当的分离方法。为此,本法采取了以下措施
方法:(1)加入少量抗坏血酸酸抗氧化降解;(2)加
入吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(APDC)对杂质离子
进行络合,防干扰;(3)加入氯化钠溶液,使高分子
絮凝,减少吸附损失; (4)采用正已烷对其充分萃
取,起到较好的抗氧化保护作用。
通过实验显示:VD3 在低于 80℃时,对热稳
定。故本法可采用 60℃水浴加热。
由于 VD3 对光照不稳定,因此,在整个操作过
程中均用棕色容器,避光操作。
本法测定复杂组分中的痕量 VD3 含量,操作
简便易行,方法重现性好,回收率基本接近 100%,
结果准确。
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(责任编辑:毛善成)
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