乳鼠肾细胞原代培养及观察

乳鼠肾细胞原代培养及观察 生 93 沈睿 2009012372 同组：古梦婷 实验日期：2011年 11月 16日 一．实验原理 1. 原代培养 原代培养也称初代培养，严格的说即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实 际上，通常把第一第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。一般持续 1-4周。此期细胞 呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活 动上相似性大。细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如 把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率很低，即 细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群 （克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似 性大，是检测药物很好的实验对象。 二．实验步骤 1. 取材 （1） 将乳鼠（3天左右）断头放血致死。 （2） 进入无菌间，清洗双手，用 70%乙醇消毒乳鼠体表，将其固定在蜡盘上。 （3） 在超净台内，将其背部皮肤剪出一个“工”字型开口，然后将皮肤拉开，固定在蜡 盘上，使其腰背部肌肉暴露出来。 （4） 用 70%乙醇消毒背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，取出肾脏，置于盛有 PBS溶液 的平皿中，除去肾膜与脂肪。 （5） 纵向将肾脏剪开，除去肾盂。将肾脏剪成数块，用 PBS溶液再洗涤一次。 （6） 吸去 PBS溶液，将肾脏剪碎（小而均匀）。 2. 组织块法 （1） 将组织小块均匀摆放在培养瓶壁上，平均间隔 0.5 cm。 （2） 翻转培养瓶，加入 1 mL 含血清 DMEM细胞培养液。 （3） 瓶口部稍向上倾斜，置于二氧化碳培养箱中（37 oC、5% CO2 ）。 （4） 2 h后，将培养瓶轻轻翻转，继续培养。 （5） 72 h后可以观察到生长晕，继续培养 3-5日，更换部分或全部培养液。 （6） 待生长晕相连后，去掉组织块，继续培养 3-4日，即可进行传代培养。 3. 消化法（实验中未采取该法，但也罗列在此） （1） 加入 0.5 mL 胰酶-EDTA溶液，于 37 oC消化 15-20 min，直至组织块变白、呈疏松 状（镜检可见分散的细胞）。 （2） 加入 0.5 mL含血清 DMEM培养基终止消化，反复“吹打”分散细胞。 （3） 去除大块组织后，1 000 rpm离心 10 min；弃上清。 （4） 加入 PBS溶液重复洗涤、离心一次。 （5） 加入 1 mL含血清 DMEM细胞培养液重悬细胞；取少量细胞悬液（20 μL），以 PBS 溶液稀释后进行计数。 （6） 将细胞悬液按比例稀释后，分装至 10mL培养瓶中（每瓶 1.5 mL，每瓶 80-100万细 胞）， 37 oC、5% CO2培养。 （7） 1-2日后，更换部分或全部培养液。 （8） 细胞生长成单层后，即可进行传代培养。 三．实验结果与分析 在本次实验中，由于在第三天到第五天我因故离开学校，所以开始几天没来得及对培养 中的细胞进行观察，当我第六天上午去看时，却翻遍了培养箱都没有找到写着我名字的培养 瓶。而且当时细胞间只有我和其他两位同学，一时也无法找到助教和老师来商量此事。所以 我决定接受这个找不到瓶子的事实，和组友交流来获得组织块法培养的进展。由于自己没有 可用照片，下文所用的照片都来自组友或其他同学，虽然有些照片不知道具体来自谁，但在 此还是表示由衷感谢。另，由于无法准确获知照片采集的时间，所以只能大致依照交流所得 与推断给照片配上大约的时间点，但总体进程的顺序应当是正确的。 由于组织块在液体较少的情况下贴壁，附着不是特别牢固，所以贴壁生长不甚旺盛，在 被培养基浸润后，相对容易从瓶壁上脱离下来。而那些没有悬浮起来的组织块，其上的细胞 则开始进行贴壁生长。而细胞生长的供养环境，即培养基，则需要定时检查，如果发现培养 基已经变色，则应当及时吸弃并换成新培养基，否则细胞在旧培养基中难以生存，最终死亡。 1.生长晕 图 1 生长晕 在显微镜下观察到如图 1中红框圈出的组织块生长晕。产生原因是倒置显微镜只能在一 个观察平面内聚焦，而组织块相对较厚，难以在同一平面内被观察清楚，所以在视野中呈现 黑色，如图 1的右上部；但是在组织块周围的一圈生长晕则拥有清晰的界面。我的组友在 48小时时的观察表明，那时的生长晕宽度较窄（约 10 μm），而到了 72小时则能够观察到 组织块与组织块的生长晕们相连接，所以推断图 1采集的时间介于培养 48小时至 72小时之 间。 2.生长晕连接 图 2 生长晕连接成片 组友在培养 96小时后观察到生长晕连成片的现象，这里引用了组友的照片。生长晕本 质就是成片向外扩散的贴壁细胞，所以经过若干天的培养，会与相邻生长晕接壤，从这个意 义上说，生长晕与细胞岛的边缘有异曲同工之处。在图 2中可以发现，细胞长势良好，所以 组友决定进行细胞传代。先洗出培养液，移除悬浮起来的组织块，再用 PBS洗培养瓶。在 传代之前，有一步消化，所以需要先把组织块洗下来，但这一洗会导致细胞大量的损失，因 为贴壁细胞是从组织块衍生出来的，所以有不少贴壁细胞与组织块仍然相连，组织块一旦被 洗去，贴壁细胞也就随之大为减少了，这也是我足有后来没有用自己做的原代细胞进行传代 的原因。也就是因为这一点，把组织块法和消化法区别了开来。 3.去除组织块 图 3 组织取出后显微照相 组友在去除组织块后，视野中贴壁细胞很少（较图 3中更少），而图 3中所示，虽然远 不及 80%的覆盖要求，但是如果以此细胞再培养些许时日，应该能满足传代对贴壁细胞数 量的要求。 对于原代培养后的传代，我就不再写了，因为实在是没有经手的实验，纯凭交流所得和 想象是无法构成实验的，而且再多借用别人的结果来写实验，着实愧疚。 四．实验体会 1.方法的选择 本实验做原代细胞培养，有两种方法供选择。消化法成功率高，但步骤略繁琐；组织块 法操作很简单，但结果可能不甚理想。当初选择用组织块法时，主要考虑的是其操作及其简 便而且步骤少，虽然后来在实际操作过程中遇到了一点小麻烦。这次所做的选择是针对已知 结果且已经过多年设计完善，写入教科书的实验，如果是以后做科研该如何选择呢？个人认 为，在时间条件允许的情况下，把可行的几种选择都做一遍，这样才能比较出效果的优劣。 有时候，看似繁琐的步骤可能恰恰是得到精准结果所必需的，所以在方法的繁易和未知结果 中要摸索出一个平衡点，而这个平衡点或许并不平衡，结果若好，则立即移向结果好的方法。 2.关于放置组织块 在用眼科剪把乳鼠的肾剪成约 1 mm3的小块后，就要用镊子把它们放入培养瓶了。但是 刚开始做这一步时没有找到合适的方法，组织块总是黏在镊子的尖上不下来，这样就没法把 它们铺在瓶里了，所以在一块组织块上就会纠结很长时间。加了两块后想到了一个办法，即 先把组织块蹭在瓶口，然后用镊子把它推到瓶壁上设定的位置。这样果真非常迅速，放一个 组织块估计只要十几到二十几秒的时间。在这个放法中，因为组织块先附在了瓶口，顺着瓶 口滑到瓶壁的路上它与瓶的黏附一直较强，所以不会被镊子尖掠走。 3.关于本次实验的反思 首先，长期观察型实验是一个整体，虽然这次是确实有急事需回家处理，但是破坏了实 验的连贯性史不争的事实。第二点，做实验需要随机应变，当我发现培养瓶不见时，要及时 制定应对，如向其他同学借一些组织块等，以此来做一些补救。第三点，关于为何会找 不到培养瓶，可能是最初在我只在瓶子的一侧标记了自己的名字，而没有考虑到，当一个同 学来到培养箱前取自己培养瓶时，可能会手捏一堆瓶子的侧面查看是否是自己的，人多了， 久而久之，自己很可能就被磨掉了，所以，实验中，哪怕是做标记这个细节，也要多一些关 注。让我想起自己在实验室里涂的平板们、配的摇瓶们和取的 EP管们，数量众多，但由于 有清楚且相互之间有差别的标记，总能认得很便捷。在实验课上，由于同时做同一个实验的 不只有自己一个人，所以更要清楚地做好标记，比如在这个例子中，我应该在瓶子横放后的 上面也做上标记，事实上，很多其他同学也就是这么标记的。 五．致谢 在这里，感谢在处死、解剖乳鼠等操作中助教和老师的恰到好处的指点，同时非常感谢 我的组友古梦婷同学，我们关于此实验有过不少交流，我受益匪浅，还有我引用的照片的我 不知道名字的原拍者同学，谢谢！ 六．参考文献 王宏英 吴逸 常智杰 王伟《细胞生物学实验指导》（第二版）清华大学生命科学学院 2011 年 2月