2009N01.11ⅢV⋯
·24· SerialNo.212 ChinaBrewing ResearchReport
米曲霉与酱油曲霉高酶活菌株的诱变选育
林剑青,陈晓莹,贺竹梅毒
(中山大学基因工程教育部重点实验室水产品安全教育部重点实验室,广东广州510275)
摘要:酱油酿造过程中菌株所分泌的酶系直接影响原料的利用率和最终产品的品质。实验通过紫外诱变、亚硝基胍诱变以及紫外.
亚硝基胍复合诱变方法分别对米曲霉和酱油曲霉菌株进行了诱变,采用酪蛋白透明蒯法初筛以及福林酚法和DNS法复筛,根壬}}碱性
蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、纤维素酶和ot.淀粉酶酶活水平的变化,选育出数株米曲霉和酱油曲霉高酶活菌株。并对初筛方法
的町行性和不问诱变方法对菌株改良的效果进行了探讨。
关键词:米曲霉:酶系分布;诱变筛选;高酶活
中图分类号:Q93_331 文献标识码:A 文章编号:0254—5071(2009)”—0024_04
ScreeningofAspergiHusO/yZ,船andAsojaestrainswithhighellzylneactivitybyinducedmutation
LINJianqing,CHENXiaoying,HEZhumei’
(KeyLaboratoryofGeneEngineenngofMinistryofEducation,MOEKeyLaboratoryof
AquaticProductSafe够,SunYat-senUniversity;Guangzbou510275,China)
Abstract'.Utilizationofrawmaterialsandqualityofsoysaucewasdirectlyaffectedbyellzyme$producedbyfungalstrainsused.StrainsAspergillus
oryzaeandA.sojaewereinducedmutationbyUV,NTG,orcombinationofUVandNTG.Mutantstrainswithhighactivityofellzymes,including
alkalineprotease,neutralprotease,acidprotease,eellulaseandOr.-amylase,wereselectedbylucencycircleofcaseinplate,followedwith
Foline—phenolandDNSmethod.Feasibilityofscreeningmethodsandefficiencyofmutantstrainswerealsoevaluated.
Keyw饥_ds:Aspergillusoryzae;enzymedistribution;mutationscreening;highenzymeactivity
米曲霉@spergillusoryzae)和酱油曲霉@.so#e)是酱
油酿造中常用的菌株,在酱油生产过程中,米曲霉和酱油
曲霉所分泌的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等把原料中的蛋
白质、淀粉、纤维素分别水解产生氨基酸、葡萄糖等物质,
因此,酱油酿造用菌株的酶系分布对酱油生产的原料利用
率和酱油的风味起着决定性的作用【”。然而,由于长期的
移种和保藏,菌种会出现退化,导致曲霉酶活性和代谢能
力降低,严重影响了酱油的产量和品质。因此,菌种的选
育显得非常必要[21。
在实际生产中,普遍采用物理或化学诱变的方法对酱
油酿造用菌株进行选育嗍。本实验采用紫外诱变、亚硝基
胍诱变、紫外一亚硝基胍复合诱变3种方法分别对米曲霉
和酱油曲霉进行诱发突变,通过酪蛋白透明圈法以及福林
酚法和DNS法筛选育高酶活菌株,并进一步探讨了初筛
方法的可行性和不同诱变方法对菌株改良的效果,为酱
油酿造用菌株的改良积累资料及为进一步的工业化应用
奠定基础。
1
与方法
1.1实验材料
1.1.1菌株
米曲霉@.oryzae2339)和酱油曲霉臼.so#e40255)
由中山大学刘建忠教授惠赠。
1.1.2培养基
种曲培养基:原料配比为豆粕:麸皮=8:2,拌水量为全
料的l10%。具体操作:将豆粕称好放入盆中,加定量的温
开水(80℃~90℃),用麸皮覆盖于上,保持30min,拌匀后每
个150mL_=角瓶中按lOg左右分装,121%高温灭菌备用。
酪蛋白培养基:称取酪蛋84.09,KH:P040.369,MgS04·
7H200.59,ZnCl20.0149,Na2HP04"7HD1.079,NaCl0.169,
CaCl20.0029,Tryptone0.059,琼H旨209,加蒸馏水至1000mL。
充分混匀后,12l℃高温灭菌备用。
1.1.3主要试剂
酪氨酸(北京鼎国),酪蛋白(广州威佳),Tryptone
(OXOID),福林酚试剂(北京奇华盛),N一甲基-N’.硝基-N.
亚硝基胍(NTG)(SIGMA),酒石酸钾钠、三氯乙酸(天津
福晨),羧甲基纤维素钠(天津光复)。
1.2实验方法
1.2.1种曲制备方法
装有109种曲培养基的150mL--角瓶,121%高温灭菌
20rain,冷却后,接入2环菌种孢子。30℃培养18h后摇瓶一
次,再培养6h后摇瓶一次,继续培养至菌丝充分生长,形
成结饼状之后(培养约48h后)扣转(使底部曲料充分接触
空气),成曲,全程约需3d。
1.2.2酶液的制备
收稿日期:2009-06.18
基金项目:广东省科技计划项目(2008A010900001):国家人才培养基金(基地)项目(]0730638)
作者简介:林剑青(1986-)。男,在读硕士研究生:贺竹梅·。教授,通讯作者,研究方向为微生物遗传学与植物生物技术。
万方数据
研究报告 中 国酿造
2009年第11期
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称取29种曲,充分研磨后,加入100mL蒸馏水,40%水
浴中浸提lh,每隔约15min用玻璃棒搅拌1次,然后抽滤去
掉固体残渣,即得酶液。
1.2.3诱变方法141
紫外诱变:在直径为9cm的无菌培养皿中加入2mLl04
efu/mL的孢子悬浮液,在距15W紫外灯30em处照射5min,
将诱变之后的曲霉孢子悬液涂布于酪蛋白固体培养基上,
每个平板涂布2001xL。
亚硝基胍诱变:在2mL离心管中加入500斗L1.0mg/mL
NTG溶液和5001山L2x105efu/mL的孢子悬浮液,30℃、200
r/min振荡30rain,用生理盐水稀释100倍以终止反应,将诱
变之后的曲霉孢子悬液涂布于酪蛋白固体培养基上,每
个平板涂布200斗L。
复合诱变:在2mL离心管中加入5001xL1.0mg/mL
NTG溶液和5001_LL2x105cfu/mL的孢子悬浮液,300C、200
r/rain振荡30rain,用生理盐水稀释100倍以终止反应;取化
学诱变后的曲霉孢子悬液10mL于直径为9era的无菌培
养皿中,在距15w紫外灯30cm处照射5min,将诱变后的
曲霉孢子悬液涂布于酪蛋白固体培养基上,每个平板涂布
2001xL。
1.2.4筛选方法
初筛方法:采用酪蛋白透明圈法【习进行初筛。将诱变
后孢子悬液涂布于酪蛋白平板,48h后测量透明圈直径D
和菌落直径D0,挑选K值(D/Do)最大的10株进行复筛。
复筛方法:碱性蛋白酶的测定采用福林酚试剂法网。
400C,pill0.0,每分钟水解酪蛋白产生l斗g酪氨酸为1个酶
活单位(U)。
中性蛋白酶的测定采用福林酚试剂法17]。400C,pH7.0,
每分钟水解酪蛋白产生llxg酪氨酸为1)b酶活单位(U)。
酸性蛋白酶的测定采用福林酚试剂法嘲。40qc,pH3.0,
每分钟水解酪蛋白产生l斗g酪氨酸为1个酶活单位(u)。
纤维素酶的测定采用DNS试剂法翻。50℃,pH4.8,每分钟
水解羧甲基纤维素生成1斗g葡萄糖为Vi"酶活单位(u)。
d.淀粉酶的测定采用DNS试剂法【l珥。50℃,pH4.8,每
分钟水解淀粉生成1斗g葡萄糖为1个酶活单位(U)。
2结果与分析
2.1米曲霉和酱油曲霉出发株的酶系分布
米曲霉和酱油曲霉出发菌椭.oryzae2339和A.sojo昭
40255的酶系分布见表1。从表l可以看出,米曲霉所分泌产
生的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、纤维素酶的活
性均分别大于酱油曲霉对应的酶活性:而叶淀粉酶则是米
曲霉比酱油曲霉低。在2种曲霉的3种蛋白酶中,中性蛋白
酶活性略低于碱性蛋白酶活性,而远高于酸性蛋白酶活性。
2.2米曲霉高酶活菌株的诱变筛选
2.2.1米曲霉的紫外诱变筛选结果
表1 米曲霉和酱油曲霉出发菌株的酶系分布
Table1.EnzymedistributionofA.oryzaoandA.soiao
菌株 碱性蛋白酶中性蛋白酶酸性蛋白酶纤维素酶d-淀粉酶
米曲霉孢子在距15W紫外灯30cm处照射5min,其致
死率为99.44%。由表2可以看出,K值最大的10株突变株
(编号为OUI--OUlo)的各种酶的酶活性均有不同程度的改
变(升高或降低),其中仅有菌株OU3的大部分酶活性提高,
且其中性蛋白酶、纤维素酶、(It.淀粉酶活性有较大幅度提
高,但碱性蛋白酶活性最高也仅提高13%(OU3),而酸性
蛋白酶活性则大部分有所下降。总体上看,紫外线对米曲
霉的诱变效果并不理想。
表2絮外谚翌后K值iit大的10株米曲霉酶盾铡趸结果
Table2.EnzymeaetMtyofthetop10A.饼弘强estrainswithlargest
鉴!璺坐!竺!!竺!竺!!型虫
项目繁oulOU2oU3oU4OU5OU60U70U8OU90U10
耋畿1.000.92o.841.13o.89o.73o.98o.82o.98o.721.05
审件
客赢L001.221.091.651.190.861.341.4 0.590.850.94
嘉熟⋯舶n伽肌们㈨s蝴o.舢mn呲鹏
纤篓素1.001.22o.891.5 1.091.021.141.571.16o.961.26
甜鋈粉1.001.1l1.021.44o.921.07o.971.26o.961.091.14
2.2.2米曲霉的亚硝基胍诱变筛选结果
米曲霉经终浓度0.5mg/mLNTG处理孢子悬浮液30
min后,致死率为95.05%。由表3可以看出,初筛K值最大得
到的lO株突变株(编号为ONl-43N10)的中性蛋白酶和纤
维素酶活性均有不同程度的提高,其中ON5的中性蛋白酶
活性比原始株提高了54%,ON7的纤维素酶活性比原始株
提高了60%。综合考虑各种酶活性以及其在酱油发酵过程
的重要性,ON3和ON5的诱变效果较好,但这2株菌株的酸
性蛋白酶活性降低较多。
2.2.3米曲霉的复合诱变筛选结果
米曲霉经亚硝基胍和紫外线复合诱变,致死率为96.80/0。
由表4可以看出,在最大初筛K值的lO株突变株中(编号为
ONUI,--ONUl0),碱性蛋白酶、中性蛋白酶、纤维素酶、舡
淀粉酶活性均获得提高的有8株(ONUl、ONU3--ONU8、
ONUl0)。综合考虑,ONu3和ONU7的诱变效果最好,其各
种酶的活性均有较大程度的提高。
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表3亚硝基胍诱变后K值最大的10株米曲霉酶活测定结果
Table3.Enzymeactivityofthetop10A.oryzaestrainswithlargest
KvaluesafterNTGmutation
项目譬ONION2ON3oN4oN5ON6ON70NgON9ONl0
表4复合诱变后K值最大的10株米曲霉酶活测定结果
Table4.Enzymeactivityratioofthe10A.oryzaestrainswithlargest
KvaluesaftercombinationofUVandNTG
项目繁ol:lu掣鼍∞:u掣ON6∞N7uON8UON9UOlNoU
综合3种诱变方法对米曲霉的诱变改良效果,亚硝基
胍诱变和复合诱变的效果较好。综合考虑各种酶活性以
及其在发酵过程中的重要性,筛选出ONU3、ONU?菌株。
将这2个菌株接种于PDA培养基上,传代3代后,制备种曲,
分别测定其酶活,2菌株绝大部分酶活性较原始株提高的
程度均保持稳定,具有较好的遗传稳定性,但2菌株的酸性
蛋白酶活性的遗传稳定性较差,其原因进一步探讨。
2.3酱油曲霉高酶活菌株的诱变筛选
2.3.1酱油曲霉的紫外诱变筛选结果
酱油曲霉经过紫外线诱变,致死率为99.4%。由表5可
以看出,初筛K值最大得10株诱变株(编号为SUI~SUl0)
中,除SU6之外,其他菌株的碱性蛋白酶活性均有不同程
度的提高;除SU2之外,其他菌株的中性蛋白酶活性均有
不同程度的提高;大部分诱变株其他酶类的活性也有不同
程度的提高。综合考虑,SU3、SU8、SU9、SUl0的诱变效果
较好,其中SU9的改良效果最好,其中性蛋白酶、纤维素
酶、仅.淀粉酶活性比原始株分别提高了44%、35%、45%。
2.3.2酱油曲霉的亚硝基胍诱变筛选结果
表5紫外诱变后K值最大的10株酱油曲霉酶活测定结果
Table5.Enzymeact.Ⅳ时ofthetop10A.sojaestrainswithlargest
KvaluesafterUVmutation
酱油曲霉经过化学诱变剂亚硝基胍诱变,致死率为
96%。由表6可以看出,初筛K值最大的10株诱变株(编号
为SNl~SNl0),综合考虑,仪SN3的诱变效果较好,其碱性
蛋白酶、中性蛋白酶、纤维素酶酶活性比原始株分别提高
了47%、35%、53%。部分菌株的酸性蛋白酶酶活性出现负
值,这是由于
曲线的截距为正值且大于所测0D值所
导致的误差。
霞6业伯墨胍呖鲨后K但霞大即10髁酋拥圃霉两省测疋绍罘
Table6.Enzymeactivityratioofthetop10A.sojaestrainsw胁
largestKvaluesafterNTGmutation
项目 繁sNlsN2sN3sN4sN5sN6SN7SN8sN9SNl0
觜1.000.97o.621.471.301.291.15o.900.87o.961.06
鬻1.00o.851.081.351.241.20o川.011.14o.91l-13
磊觜L舢历n坞⋯.so-o.sso.跎⋯Ⅳo.oso.ss
纤篓素1.001.18o.951.53o.851.041.09o.991.231.331.47
”莲粉1.00o.93o.921.221.02o.90o.93o.981.321.151.30
2.3.3酱油曲霉的复合诱变筛选结果
酱油曲霉经亚硝基胍和紫外线复合诱变后,致死率为
97.3%。由表7可以看出,初筛K值最大的10株诱变株(编号
为SNUl一SNUl0)中,大部分诱变株的各种酶(包括酸性蛋
白酶)活性均有不同程度的提高。综合考虑,SNU3和SNU9
的诱变效果较好,且酸性蛋白酶活性有较大幅度的提高。
综合3种诱变方法对酱油曲霉的诱变改良效果,紫外
诱变和复合诱变的效果较好。考虑各种酶活性以及其在
发酵过程中的重要性,筛选出SU9、SNU3、SNU9菌株。将
这3株菌株接种于PDA培养基七,传代3代后,制备种曲,分
别测定其酶活性,3株菌株绝大部分酶活性较原始株提高
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且稳定,并具有较好的遗传稳定性,但酸性蛋白酶酶活的
遗传稳定性较差,相对于原始株其比值有较大的波动。
襄7复合诱变后K值最大的10株酱油曲霉酶活测定结果
Table7.Enzymeactivityratioofthetop10A.sojaestrainswith
largestKvaluesaftercombinationofUVandNTG
项目 繁SNUSN2uSN3USN4UsN5USN6USN7USN8uSN9USNloU
鬻⋯00.27o.981.351.06o.971删.961.201.351.11
觜㈣1.15o.371.291.37o.861.321.241.031.12o.81
嘉鬻L呲mm沁刚.加。.so,埘¨¨~筋2舶
纤篓素1.ooo.87o.731.31o.91o.741.151.561.101.191.47
”鋈粉1.00o.99o.931.26o.85o.9lo.9l1.391.Ol1.401.32
3讨论
酱油发酵过程中,曲霉所分泌的蛋白酶起了最重要的
作用,酱油发酵菌株的蛋白酶活与菌体生长速度和个体菌
的比产酶速度有关。蛋白酶能够分解酪蛋白产生透明圈,
通过酪蛋白透明圈D与菌落直径D0之比可了解其产酶的
速度。张玉涛等⋯l报道可以通过酪蛋白平板培养粗略估计
菌株发酵酱醅的综合酶活;吴华昌等旧也证实,酪蛋白透
明圈法可以初步估算曲霉蛋白酶的相对酶活性高低,从而
大大减少复筛的工作量。实验结果表明,K值与米曲霉和
酱油曲霉的酶活性(尤其是在pH7时测定的中性蛋白酶活
性)呈一定正相关性,然而,K值大小并不与酶活性大小呈
线性关系,仅能作为初步筛选高酶活菌株的一个标准,酶活
性大小的最终确定应当以复筛测定结果为准。
比较紫外诱变、亚硝基胍诱变2种诱变方法发现,对于
米曲霉来说,亚硝基胍诱变的效果要比紫外诱变的效果
好,而对于酱油曲霉来说则相反:而复合诱变用于2种曲霉
高酶活菌株的诱发突变,可以获得各种酶类活性均有很大
提高的诱变株。因此,在实际生产中,为了获得较好的诱变
效果,采用2种诱变方法结合的复合诱变较好。
由于米曲霉和酱油曲霉酸性蛋白酶的酶活性本身很
低,且标准曲线的截距为正值,因此,所测oD值的少量误
差就可以引起酶活很大的变化,导致不同批次测量中突变
株相对于原始株酸性蛋白酶酶活的比值有较大的波动。例
如,ONU3第l代的酸性蛋白酶活性为原始株的117%,传代
3代后降低到原始株的95%:ONU7原来较原始株大幅度提
高到730%,传3代后酶活为原始株的169%。因此,对于酸
性蛋白酶活性的测定需进一步优化,以提高其准确性。
实验通过3种方法对2种酱油发酵用菌株进行诱变,筛
选出2株米曲霉高酶活菌株和3株酱油曲霉高酶活菌株,为
进一步的工业化应用奠定了基础,对其进行进一步优化后
将具有良好的应用前景。
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万方数据
米曲霉与酱油曲霉高酶活菌株的诱变选育
作者: 林剑青, 陈晓莹, 贺竹梅, LIN Jianqing, CHEN Xiaoying, HE Zhumei
作者单位: 中山大学基因工程教育部重点实验室,水产品安全教育部重点实验室,广东,广州,510275
刊名: 中国酿造
英文刊名: CHINA BREWING
年,卷(期): 2009(11)
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