e血小板聚集率24小时节律变化规律研究

河北医科大学 硕士学位论文 健康人群血小板聚集率24小时节律变化规律研究 姓名：师志芳 申请学位级别：硕士 专业：内科学 指导教师：都军;崔炜 20080301 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 一虢牺⋯名篡专篙’嘎 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发或撰 写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写， 文责自负。 研究生签名：师毛豸 导师签名：唧午 一年岁月．增Et 中文摘要 健康人群血小板聚集率24小时 节律变化规律研究 摘 要 目的：血小板在生理性止血及动脉血栓形成中起着很重 要的作用。在现代心血管病治疗中，抗血小板聚集治疗己成 为最常用的疗法。在正常的血液循环中，血小板并不粘附于 血管壁。只有当血管损伤，血管内皮下胶原被暴露时，血小 板迅速粘附于胶原上并被迅速激活。血小板激活是指血小板 在刺激物的作用下发生变形，粘附，聚集和释放反应。其中 血小板彼此粘着的现象称为血小板聚集。血小板聚集率(简 称PA)是检测血小板聚集功能的指标。目前最先进的方法 是全血阻抗法。血小板聚集率与很多因素有关，如血小板异 质性，诱导剂，及血小板膜上的各种受体。近来，针对健康 人群血小板聚集率有无24小时节律变化，国外做了一些研 究。Nubile及Malyszko等人的研究显示血小板聚集率在早晨 时达到高峰，Fujimura等人研究发现血小板聚集率呈早晨及 下午双峰。而Jafri等人研究显示血小板聚集率24小时节律 变化无统计学意义。但这些研究样本量均太小，且结论不一。 本课通过检测30例健康人24小时固定时间点的血小板聚 集率，观察其有无节律变化，为临床使用抗血小板药物时间 提供合理依据。 与方法： 实验对象选择：30例健康年轻人入选。其中男性16例， 女性14例，年龄24～29岁，(25．20±1．10)。入选标准： 中文摘要 肝肾功能正常，血常规正常，女性处于非月经期(自排卵期 至月经期期间)。排除标准：各种血液病，出血性疾病，或 有出血倾向；血小板计数大于300×109／L，或小于100× 10札；近一月内使用过阿司匹林，华法令，肝素等抗凝抗血 小板药物；吸烟饮酒者。 方法：于一天‘24小时内2：00，6：00，10：00，16：00，20：00， 抽取外周静脉血，于抽血后1小时内用全血阻抗法检测血小 板聚集率，诱导剂为胶原(2ug／mL)，肾上腺素(10lag／mL)， 花生四烯酸(0．5raM)，二磷酸腺苷(ADP)(20laM)及 二磷酸腺苷(ADP)(20uM)。用SPSSl3．0进行统计分析。 计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用重复测量设 计的方差分析。P<0．05认为有显著统计学差异。 结果：健康人群血小板聚集率在24小时内，肾上腺素 诱导下6：00最高(24．794-10．019)，2：00最低(20．344-9．088)， P=0．007；胶原诱导下6：00最高(24．79±4．003)，2：00最低 (22．83±3．263)，但是没有统计学意义(P-0．087)。ADP 及花生四烯酸诱导下虽无统计学意义，但已形成一趋势，即 10：00最高，2：00最低。 结论：本研究通过全血阻抗法检测血小板聚集率，发现 肾上腺素诱导的健康人群血小板聚集率存在24小时昼夜节 律变化，早晨6：00起床后达到高峰，此后逐渐降低，夜间 睡眠中达到低谷。其余诱导剂诱导的血小板聚集率节律变化 没有显著性意义，但显示一趋势，均在夜间睡眠中达到低谷。 关键词：血小板聚集率；诱导剂；全血阻抗法；血小板 活化；血小板异质 ——一． 英文摘要————————————————————————二_二二—～一一一 CircadianVariationinPlateletAggregationin HealthySubjects ABSTRACT Plateletplaysacrucialroleinthephysiologichemostatic co眦seandintheprocessofarterythrombosisformation．Then． anti-platelettherapyhasbecomeoneofthemostregular tnerapiesinmoderncardiovasculardisease．Inthenaturalblood circulation，plateletdoesn’tadheretonaturalvesselwall． However,whenthevesselisinjured，collagenunderthe vascularendotheliaisexposed，plateletwilladheretoitquicldv andbeactivated．TheplateletactivationmeansthatplateIet aQherestocollagen，aggregatesandreleasesmanysubstanCes whichcanpromoteabilityofplateletcoagulationandresuItin thrombosis．Sofar,theimpedancemethodformeasuring aggregationinwholebloodisthemostadvancedmethod．Manv factorshaveinfluenceonplateletaggregation，suchasthe neterogeneityofplatelet，inducers，andmanyreceptorson plateletmembrane．Recently,somestudiesondjumalvailation 1nplateletaggregationofhealthypeoplewerereported．but tnesestudieswereusuallysmallinsamplesizeandcontraversial． WnatISmore，therewerefewstudiesonChinesepopulation． NubileandMalyszkoshowedamorningincreaseinvitro plateletaggregation．Jafrieta1．showedthattherewasatrend towardcircadianvariationinvitroplateletaggregationto 英文摘要 epinephrine，butthesechangesdidn’tachievea statistical significance．Meanwhile，Plateletaggregationinresponseto4 differentaggregatingagentswereshowna bimodaldaily variationwithpeaksinthemorningandintheafternoonbv Fujimura’Sresearch．However，thesamplesizesofthesestudies aretoosmall，andtheconclusionsaredifferent．Westudy whetherplateletaggregationhascircadianvariationchangeby measuringplateletaggregationinfixedtimeofadayinhealthy Chinesevolunteersinordertoofferbasistouseanti-platelet drugsrationally． Methods：Atotalof30healthyyoungvolunteers(mean age25．20±1．10years，men16，women14)wereselected．The inclusioncriteriaincludeasthefollowings：liverandkidney functionarenormal，bloodroutineisnormal，femalearein non-menstrualperiod(fromovulatoryperiodtomenstrual period)．Thecriteriaforexclusionincludeasthefollowings： sortsofhematicdesease，hemorrhagicdiseaseandbleeding tendency；plateletcount>300×109／Lor<100×109／L．receive thetherapyofticlopidine，clopidogrel，dipyridamole，warfarin， nonsteriodal，anti—inflammatorydrugs，unfractionatedheparin andlowmolecularweightheparininfourweeks；smokersand drunkers．Bloodsampleswereobtainedat2：00，6：00，10：00， 16：00，20：00hinoneday．Aggregationwasassessedwitha mobilefour—channelimpedanceaggregometer(Chronolog—Log Corporation)，whichallowedmeasurementofaggregationthe wholebloodinducedbycollagen(2ug／my，ADP(101．tM)， 4 英文摘要 ADP(20uM)，arachidonicacid(0．5mM)andepinephrine(10 1．tg／my．Continuousvariableswereexpressedasthemean valueplusorminusstandarddeviation(SD)．Therepeated measuresengineeredvarianceanalysiswereperformedto comparedifferencesforindividualtimepointswhenoverall significantvariationortrendsweredetectedduringthe24一hour observationperiod．APvalueof40分钟)，影响实验结果。3．样本量偏小。 结 论 本研究通过全血阻抗法检测血小板聚集率，发现肾上腺 素诱导的健康人群血小板聚集率存在24小时昼夜节律变化， 早晨6：00起床后达到高峰，此后逐渐降低，夜间睡眠中达到 低谷。胶原诱导的血小板聚集率变化虽无统计学意义，但已 有一较明显的趋势，在早晨6：00最高，凌晨2：00时最低。 ADP及花生四烯酸诱导的血小板聚集率节律变化没有显著 性意义，但显示一趋势，均在夜间睡眠中达到低谷。 研究论文 1 2 3 4 5 6 1’ 参考文献 AndrewsNP， GralnickHR，MerrymanP， et a1． Mechanismsunderlyingthemorningincreaseinplatelet aggregation：aflowcytometrystudy[J]．JAmCoilCardiol， 1996，28(7)：1789—1795 AldemirH，KilicN．Theeffectoftimeofdayandexercise 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循环中。当血流改变，血管损伤，或受到化学物质刺激时， 血小板被活化而发生一系列改变，包括血小板变形、粘附、 聚集和释放反应。其中血小板与血小板之间相互粘附形成血 小板团的现象称为血小板聚集。而血小板聚集率是检测血小 板聚集功能的指标。本文从检测血小板聚集率的诱导剂，与 血小板聚集率有关的血小板膜糖蛋白，血小板异质性，健康 人群血小板聚集率的昼夜变化规律对血小板聚集率做一综 述。 l检测血小板聚集率的诱导剂 血小板聚集可由两类不同的机制诱发：一类为各种化学 诱导剂；一类由流动状态下的剪切应变力所致【1】。血小板聚 集诱导剂按其在正常体内存在与否可划分为两类：生理性诱 导剂如花生四烯酸、腺苷二磷酸(ADP)、胶原、肾上腺素 及凝血酶等；非生理性诱导剂如细菌、病毒、免疫复合物、 某些药物如奎尼丁等。大多数的诱导剂协同作用，加深了彼 此的作用【21。在体外的血小板聚集仪测定中，常用的诱导剂 有花生四烯酸、腺苷二磷酸(ADP)、胶原、肾上腺素。以 下分别论述。 1．1花生四烯酸 综 述 花生四烯酸是一类有20个碳原子的不饱和脂肪酸。血 小板及机体绝大多数细胞都有花生四烯酸代谢过程，在不同 的生理和病理状态下起着重要的作用。细胞中的花生四烯酸 一般不游离存在，而是以磷脂的形式酯化在细胞膜中。多种 刺激因子、激素、血氧张力过低或组织损伤都可激活磷脂酶 A2，使花生四烯酸从膜磷脂中游离出来。一部分游离的花生 四烯酸在环氧化酶的作用下转变成过氧化物(PGG2，PGH2)， 再在内过氧化物异构酶的作用下进一步转变成PGD2，PGE2 与PGF2。。在血小板中有血栓素A2(TXA2)合成酶，将内 过氧化物转变成TXA2。这种产物非常不稳定，在体液的寿 命仅30秒，而迅速变成稳定产物TXB2。 前列腺素类物质主要是通过对血小板与血管壁的作用 调节止血与血栓形成过程。在某种程度上PGG2，PGH2， TXA2，与PGE2是血小板激活剂。其中TX．A2是目前己发现 的最强的缩血管物质与最强的血小板聚集剂之一。 诱导剂花生四烯酸代谢分解成TXA2，与血小板膜上的 血栓素A2受体(TXA2R)结合，引起快速的不可逆的血小 板聚集及ADP的释放【3】o 作为诱导剂花生四烯酸常用的浓度是O．5mg／mll41。用比 浊法测定健康人血小板聚集率时，如果结果小于50％，就应 该重做实验，并且确定在再次实验之前确保实验对象没有服 用任何处方或非处方药品【51。 1．2腺苷二磷酸(ADP) 血小板中80％的ADP贮存在致密颗粒中。ADP是比较 弱的诱导剂，它诱导血小板聚集的机制主要是通过TXA2的 形成及颗粒中ADP的释放【7】o而ADP又可进一步引起血小 综 述 板活化和聚集。这是一个级联反应。 低浓度的ADP(O．1～11．tmol／1)诱导的血小板聚集反应 是可逆的(第一相聚集)，聚集后很快解聚。在中等阈值浓 度的ADP(1～21．tmol／L)诱导的血小板聚集反应则为不可逆。 在此浓度下，可见到两个时相的聚集曲线，第二相聚集为释 放反应的产物所致。在高浓度的ADP(5lamol／L)作用下， 聚集反应是不可逆的，由于第一相反应和第二相反应相继发 生，因而形成单一的聚集波。 临床及实验室常采用51．tmol／L、10umol／L及20lamol／L 的浓度来检测血小板聚集率【4，6】。 ADP易受血浆PH值、抑制物及标本温度的影响。 1．3肾上腺素 肾上腺素通过13和Q．肾上腺素能受体的介导可引起双 相血小板聚集，其机制也是通过TXA2的形成及颗粒内容物 的释放【71。其作用浓度为0．1～10lamol／L。肾上腺素可促进细 胞外的钙内流，磷脂酶A的轻度活化及胞质“碱性化”，还 能增强其他诱导剂的血小板作用。 肾上腺素的作用浓度为0．1～10lamol／L。其有较强的温度 依赖性，O．51．tmol／L的肾上腺素在25℃只能诱导一相聚集。 在20％～30％的健康人中，发现由。肾上腺素诱导的血小 板聚集率是降低的【8】o因此如果发现肾上腺素诱导的血小板 聚集率降低，而其他诱导剂诱导的结果正常，则应该结合临 床来评定实验结果。 1．4胶原 血管壁有多种胶原成分，包括I、III、Ⅳ、V、Ⅵ、Ⅷ 和XIII型。血管壁、血小板与胶原间作用是一个复杂的过程， 综 述 因为胶原不仅是很强的强诱导剂，也是粘附蛋白。胶原诱导 的血小板聚集呈不可逆聚集，在聚集出现前有一个延缓期， 至少20一30秒，随后形成一个单相聚集波，在外形改变后聚 集和释放反应同时发生。胶原诱导的聚集是通过ADP的释 放和前列腺素．血栓素系统的代谢产物形成的【9，10】。这可以由 以下证明：环氧化酶抑制剂如阿司匹林，ADP受体拮抗剂如 氯吡格雷，这些药物很好的抑制了胶原诱导的血小板聚集 【11】。致密颗粒中缺乏ADP的贮水池疾病的患者，其胶原诱 导的血小板聚集率明显减弱。 当血小板被胶原刺激后，70％。90％的Q颗粒和致密颗粒 内容物释放。其中致密颗粒释放的产物如ADP可进一步引 起血小板活化和聚集；Q颗粒释放的产物如FN、vWF、TSP 和纤维蛋白原则参与粘附聚集反应。 2与血小板聚集率有关的血小板膜糖蛋白 血小板膜含有多种蛋白质，这些蛋白质往往连接有大量 碳水化合物支链而成为糖蛋白。这些糖蛋白不但对维持血小 板形态及完整性至关重要，并且构成了血小板的各种受体， 使血小板发挥止血及有关的功能。 2．1血小板膜糖蛋白IIb／IIIa(GPIIb／IIIa) 2．1．1GPIIb／IIIa是血小板膜上最丰富的受体，静息血小板中 其分子数为8000～100000个／plt，另有20000～40000个存在于 血小板内，包括Q颗粒，致密颗粒和OCS(开放管道系统) 膜上。当血小板被激活时，这些细胞内受体能在血小板膜表 面表达。GPIIb和GPIIIa在膜上以1：1构成复合物。该复 合物为一完整的功能单位，如复合物解离，其受体功能则丧 失。同时GPIIb／IIIa复合物的空间构型改变而暴露纤维蛋白 综 述 原受体结合部位，导致纤维蛋白原与GPIIb／IIIa相互识别， 导致GPIIb／IIIa进一步的构象改变，而纤维蛋白原的构象亦 发生改变，使纤维蛋白原与GPIIb／IIIa亲和力加强，并引起 跨膜信息传递，血小板进一步活化。 GPIIb／IIIa受体的特异性不强，可与多种配体结合，包 括纤维蛋白原、懈、FN、VN及蛇毒蛋白、凝血酶原等。 GPIIb／IIIa