2009 全国艾滋病检测技术规范全篇

第一章样品的采集和处理1范围本章规定了用于人免疫缺陷病毒〔HIV〕检测的全血、血清、血浆、细胞、唾液、尿液以及滤纸干血斑〔DBS〕样品的采集和处理方法，适用于HIV抗体咽侧、抗原检测、耐药检测，CD4+和CD8+T淋巴细胞测定和HIV别离培养。3样品种类及相应的用途3.1全血、血清、血浆、唾液、尿液以及DBS样品可用于HIV抗体检测3.2抗凝全血可用于CD4+和CD8+T淋巴细胞测定。3.3血浆可用于HIV-1病毒载量、基因型及耐药测量。DBS样品可用于HIV-1基因型及耐药检测。3.4全血、血浆、淋巴细胞富集液、外周血液巴细胞〔PBMC〕及DBS样品可用于HIV核酸的定型检测。3.5PBMC、全血淋巴细胞富集液等可用于HIV-1别离培养操作步骤4.1采样前准备根据检测工程的具体要求，确定采集样品的种类、处理、保存及运输的时限和方法，按照临采血技术的要求操作，遵守生物按照要求〔参见本标准第八章实验室生物平安〕，要监察所需物品是否已备齐，是否在有效期内，油污破损，是否足量，特点应检查受检者心里与样品容器外表的标记是否一致，并注明样品采集时间。选择适宜的室内〔外〕采血空间，受检者坐〔卧〕于适合的位置，准备采血用具、皮肤消毒用品、采血管及试管架、硬质废物容器等。样品的编号和应制订样品编码的标准操作程序〔SOP〕，规定样品编号的原那么和方法，为样品制订唯一性编码〔编号〕，保证期唯一性。采血前，先对装有样品的离心管或滤纸进行标记，核对后编码。要将标签贴在试管的侧面，最好使用预先印制好的、专门用于冷冻储存的耐低温标签。应使用专门的样品记录本或登记表记录样品，同时率如电脑保存。4.2血液.2抗凝全血：消毒局部皮肤，用加有抗凝剂〔EDTA钠盐或钾盐、枸橼酸钠、肝素钠〕的真空采血管抽取适量静脉血，或用一次性注射器抽取静脉血，转移甚加有抗凝剂的事关重，轻轻颠倒缓匀6—8次，备用。.2末梢全血：消毒局部皮肤〔成人和1岁以上儿童可训练耳垂、中指、无名指或食指。1岁以下儿童采用足跟部〕。采取血针刺破皮肤，用无菌纱布擦掉第一滴血。收集滴出的血液，备用。.3血液：将采集的抗凝全血1500—3000r/min离心15min，上层即为血液，吸出至于适宜的容器中，备用。.5淋巴虚报富集液：将采集的抗凝劝学1500—3000r/min离心15min，吸取血浆层下的淋巴细胞富集液，置于适宜的容器中，备用。.6PBMC：使用淋巴细胞别离液近来密度梯度离心，吸收PBMC层，备用。.7根据检测要求选用适当的抗凝剂，如CD4+CD8+T淋巴细胞测定可选用EDTA钠盐或钾盐、枸橼酸钠、肝素钠，HIV病毒别离、核酸定型=定量检测可选用EDTA钠盐或加盐或枸橼酸钠。.8样品采集或处理、保存、运输的时限和条件，因不同的检测工程而异，应参见不同样册工程要求。.9采血完成后的穿刺枕头必须迭起与锋利危险品容器里，妥善处理，防止发生职业暴露。滤纸干血斑.1根据需要，可将采集的的中血液样品制备成滤纸干血斑，保存、运输机检测。最常用的是用抗凝血、末梢全血和血浆制备滤纸干血斑。.2用溢液器从样品管中吸取100ul抗凝全血〔或血浆〕样品，对准滤纸印圈的中心处，将样品滴在滤纸上，或将穿刺后自皮肤伤口列出的末梢全血直接滴加在滤纸印圈的中心处。.3根据需要，连续在数个印圈上滴加样品。.2.4于师温下自然枯燥至少4小时〔潮湿气侯下至少枯燥24小时〕，不要加热堆叠血斑，勿与其他截面接触。.5血斑充分枯燥后，匠气放入密封贷中，防止血斑之间的相互濡染，同时放入枯燥剂及湿度指示卡，密封包装，保存备用。尿液和唾液.1尿液：使用听节的容器收集尿液。女性应避开月经期。尿液样品可以在2—8oc下存放。存放时间、是否冻村以及是否添加防腐剂以试剂盒说明书为准。.2唾液：使用试剂盒提供的容器收集唾液样品。存放时间和是否冻村以试剂盒说明书为准。4.3样品的保存用于抗体和抗原检测的血清或血浆样品，短期〔1周〕内坚决检测的可存放于2—8oc，一周以上应存放于-20oc以下。用于核酸检测的血液和学和保养品4天内坚决检测的可存放于4oc，3个月以内应存放于-20oc务一下。3个月以上应至于-70oc以下。椅子并言侧筛查实验室检测的筛查阳性样品应及时送确证实验室，筛查阴性样品，可根据具体需要决定保存时间，建议至少保存1—2隔越。特殊用途或专项工程的样品根据具体要求确定保存时间。艾滋病检测确实实验室受到的筛查阳性样品，以后确证结果如何，均应将生育的样品保存至少10年，特殊用途或专项工程的样品根据具体要求确定保存时间。4.4样品的运送应采用三层容器对样品坚决包装，虽样品应富有与样品唯一性便面相对应的送检单。送检单应说明受检者姓名、样品种类等信息，并应放置在第二层和第三层容器之间。.1第一层容器：直接装样品，应防渗漏。样品应至于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，说明样品的唯一性编码或受检者姓名、种类和采集时间，在试管的周围应垫有缓冲溪水材料，以免碰碎。.2第二层容器：容纳并保护第一层容器，可以装假设干个第一层容器。要求不易破碎、带盖防渗漏、容器的材料要易于消毒处理。.3第三层容器：容纳并保护第二层容器的运输用外层包装箱。外面要贴上醒目的姚谦，著名数量、收样和发件人及联系方式，同时要著名“小心轻放、防止日晒、小心水侵、防止重压〞等字样，还应易于消毒。.4用于抗体检测的血清和血浆样品应在冻存条件下运送。用于CD4+和CD8+T淋巴细胞制订的样品应在室温下〔18—25oc〕或4oc〔特殊要求时〕运送，用于病毒在两检测的样品应在-20oc以下运输，DBC样品应在室温下〔18—25oc〕运送，每一件包装的体积以不超过50ml为宜。.5运送样品必须有记录。.6特殊情况下经有关部门批准可以用特快专递邮寄样品，但必须按三层包装，将样品管包扎好，严禁使用玻璃容器。4.5样品的接受样品包裹比拟在具有处理感染性材料能力的实验室内、有经过培训的、穿戴防护衣、戴口罩、防护眼睛的工作人员在生物按照柜中翻开，用后的包裹应及时进行消毒。核对样品与送检单，检查样品关油污破损和溢漏。如发现溢漏应立即将上存留的样品溢出，对样品管和盛器消毒，同时报告实验室负责任和上一级实验室技术人员。检查样品的状况，记录油污严重溶血、微生物污染、血脂给高一级黄疸等情况，如果污染过重或者认为样品不能被接受，应将样品平安废弃。并将样品情况立即通知送样人。接受样品时应填写样品接收单。第二章HIV抗体检测1范围本章规定了HIV抗体的检测方法、程序、结果报告、检测策略及质量控制。适用于各级各类医疗机构、疾病预防控制机构、检测检疫机构、采供血机构及卫生保健机构。可作为对HIV感染者诊断和检测的实验室依据。3HIV抗体检测实验室要求应符合?全国椅子并检测工作管理方法〔2006〕?中实验室人员、建筑设施和设备等条件的要求。实验室的质量保证核试验是平安防护按本标准相关章节规定执行。HIV抗体检测的目的HIV抗体检测可用于诊断、血液筛选、检测等。以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，包括临床检测、资源咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。以血液筛拴为目的的检测是为了防止输血传播HIV，包括献血员筛选核原料血浆筛查。以检测为目的的检测是为了了解不同人权XIV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。HIV抗体检测的要点根据目的的选择检测方法及检测策略。严格遵守实验室SOP。筛查试验阳性，需作确证试验。筛查试验阳性，不应做确证试验。筛查及确证实验阳性均应作好咨询工作。5以诊断为目的的检测策略5.1常规HIV抗体检测的方法和程序HIV抗体检测分为筛查试验〔包括初筛和复检〕和确证试验。筛查试验.1筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理注册批准、在有效期内的试剂，其中酶联免疫试剂应批批检合格。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。筛查样品HIV抗体筛查可采用血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液样品。.3筛查方法酶联免疫吸附试验〔ELISA〕可使用血液、唾液、尿样两品，ELISA多为单纯XIV抗体检测试剂。HIV抗原抗体联合检测试剂可同时检测血液中HIV—IPZW抗原和HIV—1/2抗体。HIV抗原和抗体包被于固相载体，参加待检样品和酶标记的HIV开元或楷体，加底物显色，用酶标仪测定结果。药效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。化学发光或免疫荧光试验这类试剂采用发功或荧光底物，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。HIV抗原或抗体包被与载体，参加待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光或荧光底物，用光或荧光仪测定结果。有效试验的，阴性和昂性对照必须符合试剂盒规定。开素检测〔RT〕及其他检测实验这类试验简便快速，适用于应急检测、门诊集镇检测。一般可在10—30分钟内得出结果。明胶颗粒凝集实验〔PA〕：是HIV血清抗体检测的一种简便方法。将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待样品作用，当待样品还有HIV抗体时，明胶颗粒与抗体发生凝集反响，根据凝集情况判读结果。PA实际有两种：同时检测HIV—1和HIV—2抗体以及分别检测HIV—1和HIV—2抗体。有效试验必须有阴性和阳性质控。免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金〔或胶体硒〕快速试验：军以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状固定在膜上，家待检样品。阳性结果在膜上抗部位显示出有色斑点。反响时间在10分钟以内。有效试验的质控点必须显色。免疫层试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线固定在膜上，待检样品〔血液或唾液〕沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位现实出有色条带。有效试验的质控带必须显色。筛查程序.4筛查程序〔1〕初筛试验根据检测目的自选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛检测，对呈阴性反响的样品，可出具HIV抗体阴性〔一〕报告：对呈阳性反响的样品，需要进一步作福建试验和确证试验。〔2〕复检试验对初筛呈阳性反响的样品，应使用原油试剂盒另外一种不同原理〔或厂家〕的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验：如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，作复查必须包括一种抗原抗体联合试剂。如两种试剂复检均呈阴性反响，那么报告HIV抗体阴性〔一〕；如军呈阳性反响，或一阴一阳，需送艾滋病清正实验室进行确证试验〔图1〕。如果抗原抗体联合试剂检测呈阳性反响，而抗体试剂检测为阴性反响，那么应考虑进行HIV—1p24抗原或核酸检测，必要时进行随访。艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反响的样品，确实实验室可以直接进行确证实验。〔3〕初筛和复检流程〔图1〕样品样品筛查试剂初筛试验阴性反响阳性反响原有试剂+另一部同原理〔或厂家〕试剂或另外两种不同原理〔或厂家〕试剂复检试验均阴性反响均阳性反响一阴一阳确证试验报告阴性图1HIV抗体筛查检测流程〔4〕筛查试验结果的报告HIV抗体筛查试验用附表1进行报告，阴性反响报告为“HIV抗体阴性〔一〕〞；阳性反响报告为“HIV抗体待复检〞。〔5〕筛查试验呈阳性反响样品的转送如需送上级时间是进行复检，需要核对身份，补充个人信息〔如姓名和身分证号码〔，必要时采集第二份学样，持HIV抗体筛查报告，送当地艾滋病筛查中心实验室，或直接送实验室复检。HIV抗体复查试验用附表2进行报告，两次检测均阳性或一阴一阳报告为“HIV抗体待清正〞；两次检测均阳性报告为“HIV抗体阴性〔一〕；，HIV抗体复检报告需由1名检验人员和1名审核人员签字。确证试验.1确证试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。.2确证样品可采用血清、血浆一滤纸干血斑样品。.3确证方法包括免疫印迹试验〔WB〕、条带免疫试验、放射免疫沉淀试验〔RIPA〕及免疫荧光试验〔IFA〕等。.4确证流程〔图2〕使用HIV—1/2混合型试剂进行检测，如果呈阴性反响，那么报告HIV抗体阴性〔一〕；如果呈阳性反响，那么报告HIV-1抗体阳性〔+〕；如果不是阴性反响，但又不满足阳性判断标准，那么报告HIV抗体不确定(±)。结合流行病学资料，可以在4周后随访检测，如带型没有进展霍城阴性反响，那么报告阴性；如随访器件出现阳性反响，那么报告阳性；如苏方器件带型有进展，但不满足阳性并准，应继续随访到8周，如带型没有进展霍城阳性反响那么报告阳性；满足HIV抗体阳性诊断标准那么报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访，随访器件可根据需要，检测病毒核酸或P24抗原作为辅助诊断。如果出现HIV—2型的特异性只是条带，根据实际情况需用HIV—2型免疫印迹试剂再做HIV—2的抗体确证试验或HIV—2核酸检测，以进一步明确HIV—2感染状态，疑难样品送国家艾滋病参比实验室进一步分析。筛查试验阳性反响样品确证试剂阴性反响出现HIV-2指示条带HIV-1阴性反响不确定反响根据具体情况进一步检测HIV-2报告HIV-1阳性报告阴性结合流行病学资料，可以在4周后随访检测，如带型没有进展霍城阴性反映，那么报告阴性；如随访器件出现阳性反映，那么报告阳性；如随访器件带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到8周。如带型没有进展霍城阳性反映那么报告阴性；满足HIV抗体阳性诊断标准那么报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。图2HIV抗体确证检测流程.5HIV抗体确证实验结果的判定〔1〕HIV—1抗体阳性同时符合以下2条标准可判为HIV—1抗体阳性：①至少有2条env带〔gpwd和gp120〕出现，或至少1条env带和p24带同时出现；②符合试剂盒提供的阳性判定校准。〔2〕HIV—2抗体阳性出现HIV—2型特异性指示带的样品；如果同时呈HIV—1抗体阳性反响，报告HIV—1抗体阳性，不推荐进一步做HIV—2抗体确证实验：如何同时呈HIV—1抗体不确定或阴性反响，需用HIV—2型确证试剂再做HIV—2的抗体确证试验。同时符合以下二条标准，即出现至少2条env带〔gp36和gp140/gp105〕，和试剂盒提供的阳性判定标准，可潘玮HIV—2抗体阳性。〔3〕HIV抗体不确定出现HIV抗体特异带，但缺乏以判定阳性。注：1HIV—1抗体特异带包括：env带：gp160=gp120、gp41；gag带：p55、p24、p17〔或p18〕；pol带：p66〔或p65〕、p51、p31。2HIV—2楷体特异带包括：env带；gp140/gp105、gp36；gag带：piu、pzu、pdu；pol带：p68、p53、p34。〔由于使用的毒株不同，喜鹊—2env带也可谓gp125/gp80、gp36〕。〔4〕HIV抗体阴性无HIV抗体特异带出现。.6HIV抗体确证试验结果报告HIV抗体确证实验结果用附表3报告〔1〕符合HIV—1抗体阳性判断标准，报告“HIV—1抗体阳性〔+〕〞，并按规定做好检测后咨询、保密和疫情报告工作，符合HIV—2抗体阳性判断标准，报告“XIV—2抗体阳性〔+〕〞并按规定做好检测后咨询、保密和疫情报告工作。〔2〕符合XIV抗体阴性判断标准，报告“XIV抗体阴性〔一〕〞，如疑似“窗口期〞感染，建议进一步做XIV核酸检测，尽早明确诊断。〔3〕符合XIV抗体不确定判断标准，报告“XIV抗体不确定〔±〕〞，在备注中应著名“4后复检。.7发出确证报告的同时要做好检测后咨询。.8HIV抗体确证报告由检测者，复核人员和签发人员签字后，按原送检程序反响一式三份〔确证实验室一份、送检单位一份、患者一份〕。如确证对于户口不属于本辖区，确证报告应同时抄送感染者户口所在地的省艾滋病确证中心实验室。其他系统确证的地方人员，也应及时向当地卫生行政部门和省艾滋病确证中心实验室报告。.9省艾滋病确证中心实验室难以确证的样品，送国家艾滋病参比实验确证。同一受检对象的样品在不同实验室得到不一致确实证结果时由国家艾滋病参比实验室予以仲裁。5.2其他HIV抗体检测的方法和程序VCT替代检测策略除筛数常规检测程序以外，对HIV高流行地区高危人权的VCT检测，可采用替代策略。.1使用要求使用替代策略，应在确证中心实验室和确证实验室或以上实验室制订的筛查实验室进行，用临床试剂质量评估敏感性和特异性高的筛查试剂检测。使用该策略判断结果，阳性报告须由确证中心实验室和确证实验室或以上实验室认可的筛查实验室出具。.2检测程序及结果报告〔图3〕送检样品筛查试剂1〔高敏感性〕阳性反响阴性反响筛查试剂2〔高敏感性〕阴性反响阳性反响筛查试剂3〔高敏感性ELISA〕S/CO≥确证试验阴性反响阳性反响不确定随访报告阴性报告阳性图3高危人群VCT检测流程〔1〕先用第一种筛查试剂〔高敏感性〕检测，出现阴性应报告HIV楷体阴性，出现阳性反响那么报告“XIV抗体待复检〞，用第二种筛查试剂复检。〔2〕第二种筛查试剂〔高特异性〕复检，出现阴性反响进行确证实践，出现阳性反响用第三种筛查实际进行确证。〔3〕第三种筛查实际〔高特异性ELISA〕检测结果阴性那么报告HIV抗体阴性；检测结果阳性，且S/CO比值大于或等于6.0者，可以出具“HIV—1抗体阳性〔+〕〞报告，使用“HIV抗体替代策略检测报告单〞—5.9之间，须进行确证试验。按照确证试验结果报告。.3在发放检测报告的同时上报疫情，.4做好检测后咨询。HIV感染产妇所生儿童HIV抗体检测策略及流程〔图4〕.1使用范围HIV感染产妇所生婴幼儿；已满18个月的婴幼儿，其母亲HIV感染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床骇异HIV感染的儿童。.2检测程序及结果报告〔1〕婴儿满12个月进行第一次HIV抗体检测。使用两种不同原理或布头床架筛查试剂进行抗体检测，两种筛查试剂检测结果均为阴性反响，包括“HIV抗体阴性〔一〕〞，可排出感染。检测结果出现阳性反响〔一种为阴性反响一种为阳性范围或两种均呈阳性反响，局部排出感染，应继续追踪随访，至儿童满18个月时再次进行HIV抗体检测。〔2〕婴儿满18个月时应再次进行HIV抗体检测。使用两种不同原理或不同厂家筛查试剂进行抗体检测。两种筛查试剂的检测结果均为阴性反响，报告“XGV抗体阴性〔一〕〞，可排出感染。言侧出现阳性反响〔一种为阴性反响一种为阳性范围或两种均呈阳性反响〕，进一步进行确证实验，根据确证试验的结果判断是否感染HIV〔图4〕。〔3〕在发放检测报告的同时上报移情。〔4〕做好检测咨询。艾滋病病毒感染产妇所生儿童12个月进行HIV抗体筛查试验阴性阳性用另一种不同原理或不同厂家生产的筛查试剂再次检测阴性阳性18个月时再进行HIV抗体筛查试验阴性阳性用另一种不同原理或不同厂家的筛查试剂再次检测阴性阳性确证试验阴性不确定阳性提供咨询，继续随访，4周后再次进行确证试验报告HIV抗体检测结果阴性报告HIV抗体检测结果阳性图4艾滋病感染产妇所生儿童HIV抗体检测流程HIV新近感染检测HIV—常规抗体检测方法可以判定感染和未感染状态，新近感染检测方法那么用于识别近期感染与既往感染。目前，检测HIV新近感染的血清学方法中，研究和应用最多的是BED—EIAHIV—1捕获EIA方法〔BED—CEIA〕，其原理是根据HIV特异性IgG占总IgG抗体的比例随着感染时间的延长而逐渐增高。应用BED—CEIA进行新近感染检测只适用于HIV阳性样品，由于个体间抗体声称的变异性，对个体而言，BED结果的预测值偏低在个体水平上，BED检测可能产生一定的假阳性和假阴性，但在人群水平上，假阳性的数目与假阴性的数目杨晋，因次可以相互抵消彼次的作用，美国FDA将BED—CEIA归为“只应用于检测目的，不能用于个体诊断和临床〞的实验方法，该方法用于检测及发病率计算的条件参见“HIV新近感染检测〞。.1新近感染检测样品的入选标准〔1〕新近感染检测必须应用诊断为HIV—1阳性的血样，简直将HIV阴性样品纳入新近感染检测。〔2〕使用替代策略近来常规检测的地区，假设将其HIV阳性样品纳入新近感染检测，对于BED—CEIA抗体梯度试验检测0D—n值<0.3的样品，需要对该样品进行确证检测，以排出潜在的HIV阴性样品。〔3〕用于新近感染检测的样品，可以使用常规检测确证为HIV阳性的剩余/库存样品，不必重新采样。样品必须按照要是保存在-20oc以下，反复冻熔次数小于三次。〔4〕每份样品量不少于0.5ml。要求清亮、无严重溶血。〔5〕没有交叉污染、个案信息全面准确。〔6〕用于新近感染检测的阳性样品数量必须占总阳性样品的80%以上，否那么不推荐纳入新近感染检测。〔7〕如果统一人在3个月内出现2份或2份以上确实证阳性样品，将第一份样品纳入新纳入新近感染检测，其余样品从总样品种删除。.2新近感染检测样品排出标准〔1〕已经向检测系统报告过的感染者的样品〔非初次诊断阳性者〕，该样品采集时间距HIV阳性检测纪律已经超过3个月。〔2〕所有艾滋病病人样品。〔3〕所有接受抗病毒治疗人样品。.3参加新近感染检测的实验室每年至少接受二次国家参加实验室组织的能力验证〔PT〕，通过考核前方可开始检测。6以检测为目的的检测策略6.1使用范围全国艾滋病疫情检测。6.2检测程序及结果报告〔图5〕先用第一种筛查试剂〔高敏感性ELISA〕检测，出现阴性反响报告“HIV抗体阴性〔一〕〞，—5.9之间，或复检结果出现阴性反响，应进一步作确证试验，按照确证试验的标准判断结果〔图5〕。发放检测报告的同时上报疫情。对报告阴性者做好检测后咨询。本程序仅用于流行病学检测和无关联检测，结果不值得报告给个人。第三章HIV—1抗原检测1范围本章规定了HIV—IP24抗原检测的方法和用途。适用于对人血液标本和病毒培养上清液中HIV—1P24抗原的检测。3HIV—1P24抗原检测的意义3.1HIV—1感染窗口期、HIV抗体不确定或HIV—1阳性母体所生婴儿的鉴别诊断。3.2第四代HIV检测试剂的阳性结果的辅助诊断。3.3检测病程进展或抗病毒治疗效果。3.4HIV分别培养，病毒复制状况的监测。4实验室要求同HIV抗体检测。5检测方法及程序5.1试剂：矿体夹心ELISA方法，应使用经国家药品监督管理局批准注册的试剂。5.2样品：血清、血浆或病毒培养上清液。5.3硬性检测5.31筛选试验按照试剂盒说明书提供的要准判断有反响或无反响。确证试验是24开元的中和试验，用于排出筛选试验的假阳性。吊检样品先与中和剂〔P24抗原的抗体〕共同孵育，如果样品中存在P24抗原，中和抗体将阈值结合形成复合物，而不能与固定载体上的捕获抗体结合。然后，用这样处理过的样品重复筛选实验的步骤，同时作一孔未中和的原始样品对照，将中和与未中和孔的0D值进行比拟，如果中和孔的0D值下降50%以上，认为样品中的P24抗原是真正的阳性；如果中和孔没有出现0尔德值下降，认为P24抗原的反响性可能是假阳性，需要作RNA言侧或随访作进一步确证。5.4定量检测将P24抗原的标准物质稀释成包含0.0和125pg/ml而二哥浓度在内的六个不同浓度的系列标准，进行检测。以横坐标为P24抗原的浓度〔pd/ml〕，纵坐标为0D值，绘制出标准曲线，侧出未知标本的0D值以后，在标准曲线上查出抗原的浓度。如果未知标本的0D值超出标准曲线上最高抗原浓度的0D值，那么需用正常人血清将表笔稀释以后再形检测。5.1结果报告和解释HIV—1P24抗原筛选试验有反响的标本必须经过中和试验确证已经才能判断阳性或阴性。HIV—2P24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助诊断依据，不能据次确认。HIV—1P24抗原阳性结果不能排出HIV感染。检测病程今人或抗病毒治疗效果应进行HIV—1P24抗原的定量检测。6质量保证和质量监控—1P24抗原检测的根底培训。6.2定型检测时，内部对照应满足试剂盒规定的条件，还可以使用含有中等浓度HIV—1P24抗原的质控品〔血液或病毒培养上清液〕作为外部对照，按照常规的质控方法，绘制质控图，进行外部质控。中和试验应使用试剂盒提供的中和抗体，使用P24抗原阳性的样品作为阳性对照，阳性对照的中和孔，0D值应下降50%以上。6.3定量检测时，0.0和125pg/ml六六二个浓度的O1值应在试剂盒说明书规定的范围内。第四章HIV核酸检测1范围本章规定了HIV核酸定型和定量检测〔病毒载量〕的意义、实验室要求、检测方法、质量控制及结果判定标准，适用于HIV—1核酸的定型检测和病毒载量的测定。3核酸检测的意义3.1早期诊断婴儿的早期诊断HIV感染母亲所生小雨18个月龄的婴儿，不同时间的两次HIV核酸检测均为阳性即可作出诊断。18个月龄以上而且诊断与成人相同：有极性HIV感染综合症或流行病学史，且不同时间的两次HIV核酸检测解决均为阳性，即可诊断。也可使用多样品吉诃德方法，对采供机构的原料血浆以及HIV抗体阴性的告慰人群样品进行集合核酸检测，及时发现窗口期感染，降低“剩余危险度〞，减少二代传播。3.2疑难样本的辅助诊断在一般情况下，HIV抗体检测足以对HIV感染与否作出正确诊断，但在特殊情况下，单纯HIV抗体检测解决不能进行明确的诊断，如在感染早期或疾病终末期出现抗体不确定反响时，RNA的层定解决可帮助提供HIV感染早期或重末期的证据。由于试剂的灵敏度、接受有效的抗病毒治疗后以及存在长期低水平病毒的少数感染者等原因，应对其他检测数据和样品背景情况近来综合判断。3.3遗传变异监测可用于HIV分子流行病学检测，包括HIV—1和HIV—2感染的鉴别诊断、HIV感染传播链的分析、HIV基因亚型和充足病毒的鉴定和分析以及人群HIV遗传编译趋势的检测。3.4耐药性检测可用于HIV耐药检测和监测，知道公共卫生医生了解耐药性病毒株流行的态势和知道临床医生判断开并度治疗效果和修改开对度治疗方案。3.5病程监控及预测HIV感染发生后病毒载量病人具有一定规律，这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。因次定期进行病毒载量检测有助于确定疾病开展的阶段，以确定相应的治疗方案。HIV病毒载量与6年发病率的关系为：病毒在两<500c/ml时发病率5.4%；501—3，000c合ml时为16.6%，3，001—10，000c/ml时为31.7%，10，001—30，000c/ml时为55.2%，>30，000c/ml时那么为80%。HIV感染者CD4+T细胞计数<200ul无视，病毒载量与3—6个月开展至AIDS的危险为，病毒载量<10，000c/ml时并并吕薇4.9%，10，000—29，999c/ml时为12.7%，30，000—/ml时为17.7%，>/ml时为22.4%。3.6知道抗病毒治疗及疗疗效通常在病毒载量大家一定水平后〔如>35，000—50，000c/ml〕抗病毒治疗才现实良好的治疗效果。治疗后，通过病毒水平的检测能力确定治疗是否有效。通常在治疗6个月后病毒水平降低0.5log以上才被认为临床有效。4HIV核酸检测实验室要求HIV核酸检测应在适宜的实验室中进行，应建立与实验和实施言管理相关的标准操作指导书和制订严格的#管理#，工作人员比拟充分了解各项规定并严格遵照执行。4.1实验室分区和功能实验室应设置两个独立的工作区域：核酸扩增前区和核酸扩增后区。核酸扩正前区包括试剂准备区和样品处理去，设在不同房间或区域；核酸扩增后包括扩增区和扩增超分析区，设在不同的房间或区域。歌曲的功能是：试剂准备区：扩增试剂的储藏、配制和分装。样品处理去：样品等级、处理和粉状；核酸提取、保存和使用，PCR扩增的第一轮家养。扩增去：核酸扩增。如果再次区进行套式PCR的第二轮家养，应在PCR防护找内进行。扩增产物分子区：扩增产物的电泳、杂交、成像、序列测定、结果分析、等级及报告。在满足以下要求的前提下，核酸扩增前区或核酸扩增后区可设在一个房间内：.1核酸扩增前区实验室内设置两个不同位置的实验区，试剂配制在超净工作台中操作，样品矗立在生物平安介内操作。.2在核酸扩增后区使用权封闭的扩增和检测系统时，如实时荧光PCR仪等。.3每个实验人员使用各自的试剂、耗材、移液器和盛放污染物的盛器。.4在实验前后对操作区域和共享器具进行情节及消毒。.5各区域的试剂、器具、仪器和设备为该区专用，不得交叉使用。4.2实验室人员和要求近来HIV核酸检测的人员须具有艾滋病检测实验室的上岗资格，接受过省级以上的实验操作技术及艾滋病实验室生物平安培训及厂家的培训。4.3实验室设施和设备根据检测工程配备相应的设施和设备。各区域的设施和设备为专用，应根据实验要是在相应区域配制。试剂试剂准备去：配置冰箱、超净工作台、普通离心机、加样器、振荡器、废气物容器、可移动紫外灯。样品处理区：配制-80oc冰箱、生物平安局、高速制冷离心机、加样器、制冰器或制冷模块、恒温水浴或干浴、上下水设备、废弃容器、紫外灯。扩增区：配制核酸扩增仪、普通冰箱、无层流PCR操作柜或超净工作台、微型离心机、加样器、废弃物容器、紫外灯。扩增产物分析区：配制电泳仪、电泳槽、加样器、自外透射仪、摄影/像设备、普通冰箱、普通离心机、恒温水浴、微波炉、上下水设备、废气容器、紫外灯等。测序仪可安置在其他专门实验区。各区域应使用专用或一系列工作服、孢子、口罩鞋及袖套、配制房紫外线眼镜。4.4实验室生物平安必须符合艾滋病实验室的通用生物平安要求。4.5防止实验室核酸剩余〔Carry—ovnr〔污染设施。严格执行实验室分区社制度仪器、设备、材料、设施均应按工作区域近来师表、不得交叉昏庸。单向工作流向制度.1实验室的气流应从扩增前去流向扩增后去，不得逆向流动。建议扩增前去保持弱正压状态，扩增后去保持弱负压状况。.2实验人员单向工作流向应该为：试剂准备区—样品处理区—扩增区—扩增产物分析区，不得逆向流动。原那么上实验人员在扩增后区工作后当天不能再返回扩增前去工作。.3实验用品单向工作流向应该为：试剂准备区…样品处理区…扩增区扩增产物润色区，不得逆向流动。实验用品包括实验材料〔试剂、样品和扩增产物〕、实验器材〔容器、板架、实验服、帽子、口罩、手套、鞋套〕、办公用品〔记录纸、笔等〕、以及清洁材料等。实验室防止核酸剩余污染的处理程序—1%次氯化钠或涂布与操作台器具外表，两分钟后用纸巾擦净。.2实验前移如所需试剂、耗材、样品以及盛放污染的物盛器。.3用与定型与定量核酸—1%次俗话那溶液涂布与操作台和器具外表，两分钟后用纸巾擦净；翻开紫外灯照射至少1小时。—1%次氯化钠情节，用紫外灯进行台面和空气消毒。定期〔每月〕对移液器进行情节。.5定期〔每月〕监测和报告实验室核酸痰盂污染情况，监测部位包括核酸检测前后区域各实验室以及共同走廊等。.6每次试验后，将同批试验样品的DNA序列以及遇上一批试验样品的DNA序列一起进行遗传进化树污染分析。4.6废气物处理制度所废弃物应按照HIV污染物品处理。化学物品如溴乙啶处理的琼脂糖凝胶应该按有关方案处理。5HIV核酸检测方法及程序5.1HI〞核酸定型检测方法和试剂.1方法〔1〕渐次方法为商品化试剂盒核实验室自建方法，商品话试剂应严格按说明书操作，下面介绍的方法是实验室自建方法，供参考。〔2〕检测血浆或血清样品使用逆转录〔PCR〕RT—PCR〕方法，建议第一路PCR扩增使用RT—PCR无一步法；检测血细胞或组织样品使用PCR方法。一般使用扩增两轮的套式PCR方法。〔3〕设立阳性、阴性及空白对照。阳性对照为与待侧样品统质、含有目的的基因的样品；阴性对照为与待测样品统质、不含有目的基因的样品。阳性的阴性对照样品应与待样品处理程序一致。阴性对照的设置数量应根据实验样品的数量设置在不同的位置。.2实际〔1〕PCR引物：一般使用扩增HIVgad和/或pol和/或env和/LTR等引物。进行REA逆转录时可使用下游特异性因或随机引物。引物涉及可参考文献或自行，应剂量涵盖常见的HIV流行毒株，也可使用兼并性引物。〔2〕主导试剂：包括核酸提取纯化、逆转录、PCR所需试剂。使用商品化核酸提取春花试剂、逆转录酶反响试剂和PCR扩增试剂。〔3〕扩污染试剂：实验室自建检测方法可使用抗污染试剂，参考尿嘧啶DNA糖基化霉抗污染方法。扩增目的基因判断.1样品的采集和处理见第一章“样品的采集和处理〞。.2核酸提取可使用硅胶柱离心、词性硅胶颗粒别离方法以及自动化一起等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA使应置于-20oc保存，RNA和需长期保存的DNA应置于-80oc保存。.3逆转录合成cDNA使用商品化石印并按说明书操作。逆转录cDNA合成反响需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA霉的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在对顶的温度和时间下近来逆转录反响。建议使用商品化RT—PCR一部法实际进行第一轮扩增反响。.4PCR扩增反响使用商品化试剂按说明说操作。PCR反响需使用一物、dNTPS、DNA聚合酶霉〔如Tap酶等〕、缓冲液、和适量无RNA/DNA酶超纯水、以及模板〔DNA或〕cDNA〕，在扩增仪中，按照设定的程序进行扩增。一般使用二次扩增的套式PCR扩增方法。扩增产物分子及结果报告.1扩增产物分析扩增产物常用分析方法是琼脂糖凝胶电泳法，与分子量标准比拟，判断扩增片断是否在预期的分子量方位内。其他扩增产物分析方法还有限制性内切酶酶切分析、特异性探针杂交分析已经DNA序列分析等，自动化核酸扩增仪使用酶联比色分析或荧光探针造价等原理测定。.2解决判定和报告〔1〕实验成立的条件：法一次检测需同时做两个阳性对到、两个阴性对照，只有阳性对照扩增出与其的片断、阴性对照没有扩增出任何片断、双份平行样品结果一致的情况下实验才成立，可以作出核酸阳性或阴性反响解决的判定。〔2〕HIV核酸检测阳性：使用商品化检测试剂，发现核酸阳性反响，应该重复采集样品进行复测，复测解决呈核酸阳性反响那么判定为核酸阳性，复测解决为核酸阴性反响那么判为不确定结果，需进一步随访检测。〔3〕HIV核酸检测阴性：只可报告本次实验结果阴性。〔4〕应在完成检测后7个工作日内发出检测报告。5.2HIV核酸定量检测方法HIV核酸电量检测主要基于靶核酸扩增RT—PCR和信号放大扩增两种方法。国内常用的方法，NucliSensNsayQHIV———1.0国际单位。不同的方法的管理与HIV的亚型有关。试剂必须使用经中国药品生物只要监督管理局注册批准的商品化试剂并严格按说明书操作。.1靶核酸扩增试剂和性能〔1〕RT—PCR扩增试剂1〕AmplicorHIV—1MonITORV3.5〔RT—PCR微孔板捕获或比色分析法〕，核酸手工提取〔异丙醇沉淀〕，比色分析测定。扩增靶核酸位置是dad基因区，可扩增HIV—1M组的A—和基因亚型。标准发的检测线性范围是400—750，000；超敏法的现行范围是50—100，000RNA拷贝/毫升。2〕COBASAmpliprepHIV—1Monitorv1.5，核酸手工提取〔异丙醇沉淀〕，仪器测定。扩增靶核酸位置是GAG基因区可扩增HIV—1M组的A—H基因亚型，标准方法的检测线性范围是400—7500，000；超敏方法的现行方位是50—100，000RNA拷贝/毫升。3〕COBASAmpliprep/COBAS/AmplicorHIV—DMonitorv1.5〔COBASAmplicor分析仪〕，仪器提取核酸，仪器测定。扩增靶矽酸位置是gag基因区，可扩增HIV—1M组的A—H基因亚型，标准方法的检测线性范围是400—1，000，000；超敏方法的现行方位是50—100，000RNA拷贝/毫升。以上三中世纪均采用基于PCR扩增靶核酸检测法，仅在设备的使用、自动化程序和样品制备的方法不所不同。4〕COBASAmpliprep/COBASTapMaeHIV—1Test〔实时荧光探针RT—PCR分子法〕，仪器提取核酸，实时荧光探针PCR扩增一起测定。扩增靶核酸位置是gag基因区，可扩增HIV—1M组的A—H基因亚型。检测线性范围是40—10，000，000RNA拷贝/毫升。比上述一种方法的检测线性范围要宽，样品可不经稀释一次完成检测。以上四中世纪均使用一个内部定量并准品，1个阴性、1个假设阳性和1个强阳性外部外部质控品。均使用dUTP/UNG防污染试剂。5〕LCxXIVREAQuaetitativnAssay〔竞争性RT—PCR微颗粒酶免疫分析法〕，手工或仪器提取核酸〔火花硅胶柱春花〕，仪器测定。扩增靶子核酸位置是pol/整合酶〕基因区，可扩增HIV—1基因M组的A—1亚型和0组病菌，尤其可检测M组C基因雅型和一些充足病菌。检测现行及范围是IIO—1，000，000RNA拷贝/毫升。使用一个月内定量标准品6〕RealTimeHIV—1Assay〔实时荧光探针RT—PCR分子发〔，使用独特的双链荧光探针。手工或仪器提取核酸〔词性颗粒纯化〕，仪器测定。扩增靶子核酸位置是pol/整合酶〕基因区，扩增HIV—1基因亚型是M组的A—D雅型和0组以及E组病菌。检测线性范围是40—1，000，000RN拷贝/毫升。使用一个内部定量标准品。检测结果与LCxHIVRNAQuaetitctiveAssay解决高度相关。〔2〕基于核酸序列扩增试剂〔NASBA扩增根底〕：以等温方式直接扩增HIV—1RNA。NvcliSensEsayQHIV—1v1.1〔实时荧光探针分析发〕，使用荧光标记的分析信标探针根底检测扩增子。手工或仪器提取核酸〔硅胶春花，异丙醇沉淀〕，仪器测定。扩增靶核酸位置是191基因区，扩增HIV—1基因雅兴型是M组的A—G雅型。检测现行范围是50—3，000，000RNA国际单位/毫升；使用一个内部定量标准品，没有阴阳性外部外部质控品。每次检测8的整数倍样果有着高度的阳关性。国际商已经推荐使用V2.0试剂盒。.2信号放大扩增试剂和性能VersantHIV—1RNA3.0.bDNA〔分根底DNA探针造价微孔板捕获比色分析无法〕，利用分支状DNA舵机信号放大原理。以需RNA春花和PCR扩增步骤。离心浓度病毒子并用去垢剂核蛋白酶K消化病毒释放病毒RNA，仪器测定。扩增靶核酸位置是pol基因区，扩增HIV—1基因雅型是M组的A—H雅型，检测现行范围是50—500，000RNA拷贝/毫升，使用个外部定量标准品，1阳性、1个弱阳性和3个强阳性外部外部质控品。每次可检测12的整数倍样品。以上试剂均可使用EDTA和ACD作为样品的抗凝剂，NucliSencHIV—1QT和NucliSensEsayQHIV—1v1.1以及VersantHIV—1RNA3.0.bdna试剂还可以使用肝素作为囊凝剂。如果比拟使用经肝素处理的血浆样品进行RT—PCR扩增，那么必须在样品中直接加肝素酶消化肝素。.3实时荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反响体系中参加荧光基屯，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。每个反响管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数Ct值与该模板的起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起来拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值〕，因次，只要获得未知样品的Ct值即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR扩增的实验检测过程可分为：〔1〕样品制备，抽提和浓缩目标RNA分析，并出去可能存在的抑制因子。〔2〕Real—timePCR，检测PCR的产物使用荧光标记的寡核苷酸探针。检测的原理急于荧光信号增长曲线与玄幻数相关。〔3〕RT—PCR反响，病毒RNA利用逆转录酶将RNA逆转录为cdna，然后通过DNA聚合酶对替代片断进行扩增。〔4〕扩增产物的检测，基于检测阈值设定，当病毒载量高时，低云换树即能检测到荧光信号，当病毒载量低时，高循环数时才能检测到荧光，循环数与样品载量成线性关系。利用标准品制作循环数与载量的标准曲线就能对样品载量进行定量检测。5.3集合核酸定型检测〔PoolingPCR〕使用集合核酸扩增检测技术和方法，利用核酸检测方法的高度敏感性，高度骇疑心感染人群且抗体阴性的样品进行集合核酸检测，可及时发现窗口期感染者，该方法较单份样品的核酸检测具有高度的本钱效益。样品集合程序.1根据语处理样品量，计算语形成一级和二级集合数量，在等级表格上记录一级和二级集合及对应的原始样品编号。.2吸取130ul样品，移入标记二级集合的离心管中；10份样品形成一个1300ul的二级集合样品，充分涡旋振荡混匀。.4从每隔一、二级集合管中西区500ul集合样品，分装至另一相应标记的离心管，用超敏感核酸检测试剂进行检测。.5制备阴性集合外部质控品：使用50份HIV抗体和核酸阴性样品，按上述步骤，分别集合成5个阴性二级集合外部质控品和一个一级集合外部质控品。.6制备阳性集合外部质控品：从7份HIV楷体和核酸阴性样品和一份至少还有HIVRNA103c/ml阳性样品中，分别移取130ul参加离心管中，形成一个1300ul的阳性二级集合外部质控品。再分别从4个已制备好的阴性二级集合外部质控品合上书阳性二级集合外部质控品中，移取210ul至标记为一级阳性集合外部质控品品的离心管中，形成一级阳性集合外部质控品。.7一级和二级阴阳性集合外部质控品分别用于RT—PCR中每一论一级和二级集合样品的检测。集合样品的检测和分解路线使用商品化核酸检测试剂，应严格按照试剂说明书操作。按照各商品化核酸试剂集合PCR的方案进行检测，集合样品的属于根据各试剂方案操作。方法减数如下：.1用HIVRNART—PCR超敏检测方法对一级集合样品进行检测，阳性反响的一级集合样品进入下一检测步骤。.2用HIVRNART—PCR超敏检测方法对所有组成阳性一级集合的二级集合样品进行检测，阳性反响的二级集合样品进入下一检测步骤。.3用HIVRNART—PCR标准检测方法检测所有组成阳性二级集合样品的的10份单个样品，确定核酸阳性的单个样品。5.4婴幼儿HIV感染核酸检测HIV感染产妇所生婴幼儿在出生后18个月内可应用HIV核酸〔DNA或RNA〕检测进行早期的HIV感染诊断。监管HIVRNA检测敏感性在感染早期较高〔出生后3个月内〕，但是HIVDNA检测不受母亲产期抗凝转录病毒医疗和人乳汁中抗逆转录病毒药物以及婴幼儿预防性抗逆转录病毒治疗的感染而影响早期诊断。另外，考虑母亲血液污染因素，不推荐使用脐带血进行HIV核酸检测，婴幼儿的抗体检测流程和结果判断见第二章〔HIV抗体检测〕使用范围未满183月的HIV感染产妇所生营业而：未满18个月的婴幼儿，其母亲HIV感染状况不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床疑心HIV感染者。检测程序及结果报告〔图6〕.1于婴儿出生后6〔42天〕采集第一份学样本〔学样本可制备成DBS或EDTA抗凝全血〕，送检。.1假设第一份学样本检测呈阳性反响，尽快再次采集第二份血样本进行检测，假设凉粉栎阳本检测均呈阳性反响，报告“婴儿HIV感染早期诊断检测结果阳性〞，诊断儿童HIV感染，及时对HIV感染儿童进行追踪和病情检测，匠气转介到儿童抗病毒治疗医疗效劳机构，并为期提供时机性感染预防等效劳措施：假设第二份学样本检测呈阴性反响，待而影满3个月再才采集学样本进行检测。.3假设婴儿满3个月再次检测呈阴性反响，报告“婴儿HIV感人早期诊断检测结果硬性〞，按照未感染儿童处理，继续提供儿童保健随访效劳，与儿童满12个月时，按照“HIV感染搀扶所生儿童HIV抗体进侧流程〞〔图4〕，开始HIV楷体检测，组中确定儿童感染状态。假设婴儿满3个月，再次检测呈阳性反响，尽快再次采集学样本进行检测。第三份学样本检测呈阳性反响，报告“婴儿HIV感染早期诊断检测结果阳性〞，假设第三份学样本呈阳性反响，报告“婴儿HIV感染早期诊断检测结果阳性〞，分别按照前述流程提供相应效劳。.4不同时间“婴儿HIV感染早期诊断〞检测均呈阳性反响的喂哺母乳的儿童，应在完全停止喂哺母乳后的6和3个月/假设6时检测结果为阳性可尽快〕再次采样进行核酸定型检测，进行早期诊断。儿童满18个月后那么可直接进行抗体检测。.5如果婴儿第一次采血时已满3个月，但未满12个月，那么应尽快在不同时间蔡季良份学样本，同时将凉粉学样本送检，按照签署流程进行检测。如果儿童第一次采血时已满123月，那么应首先按照“艾滋病感染产妇所生儿童HIV楷体检测流程〞〔图4〕进行而却楷体检测。假设两种不同原理或厂家生产的HIV抗体检测试剂检测结果均为阴性，那么排出儿童感染；假设HIV抗体检测试剂检测解决呈阳性反响，不能通过抗体检测确定儿童感染状况，那么可在不同时间采集两份血学样本，按照签署流程进行“婴儿HIV感染早期诊断〞检测。如果儿童第一次采血时已满18个月，那么应按照HIV抗体检测流程〔图1〕进行HIV抗体检测，无需进行“婴儿HIV感染早期诊断〞检测。HIV感染产妇所生婴儿出生后6周采集第一份血样本〔可制备成滤纸片干血斑〔DBS〕，或EDTA抗凝全血〕送检呈阳性反响呈阴性反响婴儿满3个月，再次采集月样本，送检尽快采集第二份血样本，送检继续随访呈阳性反响呈阴性反响呈阳性反响呈阴性反响尽快再次采集血样本，送检报告阴性报告阳性呈阳性反响呈阴性反响图6艾滋病感染产妇所生儿童HIV感染早期诊断检测流程6质量保证和质量控制量控制要考虑从样品接收到发出报告整个过程每个环节的管理过程，包括：〔1〕人员；〔2〕实验室分区和环境；〔3〕仪器；〔3〕检测过程〔试剂、操作过程，外部质控品使用〕。所有相关检测人员需经操作培训，能独立熟练地操作，并经考核合格，持证上岗。6.1实验室分区和环境HIV病毒载量检测实验室原那么上应分为三个独立工作区：试剂准备区、样品处理区、扩增产物分析区，并设在不同房间。严格要求三曲的空气流向：从实际准备区到样品处理区，然后到扩增产物分析区，不能逆向流动。6.1仪器设备质量控制加样器、温湿度计须经计量部门校准，每年一次，HIV—1病毒载量检测仪、实时荧光PCR仪、离心机可以委托公司校准，每年一次。冰箱、水浴箱用校准合格的温度计测量温度，并做好记录。6.3检测过程质量控制保证所有试剂盒有效并经国家食品药品监督管理局注册，使用无DNA和RNA酶的水；严格执行仪器和实际的标准操作程序〔SOP〕，不得擅自修改。每次实验需同时使用试剂盒内的外部质控品以及一个HIV—1RNA为5000—15000拷贝=毫升的外部外部质控品；每次实验按照试剂盒说明书的要求使用试剂盒提供的外部质控品，并满足外部质控品要求。6.4外部质量控制国家艾滋病产比实验室每年组织两次病毒载量的能力验证工程，每次5个样品，具体解释详见本章标准第九章。第五章HIV—1耐药检测1范围本章规定了HIV—1耐药积极检测的实验室条件、方法、结果片定及质量控制，适用于血浆、血清和滤纸干血斑样品的HIIV—1耐药基因型确定。3HIV—1耐药检测的意义3.1耐药进侧用于HIV—1感染人群和抗病毒治疗人群的耐药性检测和检测。用于新近感染人群的南要性检测，了解耐药毒株流行的情况，并采取矿质措施，用于治疗前人群的检测，知道之一线抗病毒治疗方案；用于抗病毒治疗人群的乃小性检测，进行HIV—1乃小发生、开展趋势以及影响因素的分析，指导和完善大规模公共卫生模式抗病毒治疗的程序，以及制订二线治疗方案。4HIV—1耐药检测实验室要求4.1实验室功能分区实验室原那么上应分为4个独立工作区：实际准备区、样品处理区、扩增区、扩增产物分子区，并设在不同房间。前两个为扩增前去，后两区。见第四章“HIV核酸检测〞，4.2人员进行HIV—1耐药基因型检测的人员须具有艾滋病检测实验室的上岗资格，接受过省级以上艾滋病实验室生物按照培训，须具有国家级实验操作技术培训合格证。4.3设施和设备根据检测工程配备相应的设施和设备。见第四章“HIV核酸检测〞，其中扩增产物分析区增加测序仪等设备。HIV—1耐药基因型检测实验室应之严格的管理制度，工作人员必须充分了解各项规定并严格遵循执行。见第四章“HIV核酸检测，〞5HIV—1耐药检测方法及程序5.1方法HIV—1太要检测的可分为两大类，一类是基因型检测法，另一类是表型检测法。HIV—1脑要基因检测法急于对耐药相关基因图表的检测，利用耐药基因型解释活系统判断是否耐药以及乃小的程度；HIV—1乃邀标型检测法急于体外培养技术，通过检测以致病毒省长所需的药物浓度〔IC50或IC90〕并与参考株进行比拟，判断病毒对药物的敏感程度，常用的HIV—1耐药检测方法为技术型检测法，其有时在于周期短、操作简便、中伏性好，且化肥焦烧。本章主要介绍HIV—1耐药基因型检测方法。通常使用逆转录PCR〔RT—PCR〕和测序方法，商品化试剂盒一般采用一论PCR扩增，实验室自建〔In—house〕方法一般使用套式PCR方法两轮扩增。5