氯化钙制备感受态细胞

...氯化钙法（兴湘）制备感受态细胞什么是感受态细胞？感受态细胞（competentcell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。氯化钙法（兴湘）制备感受态细胞的原理？细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物。钙离子的作用是结合于细胞膜上，是细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，使外源DNA进入。影响感受态细胞制备的因素有哪些？1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）。2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行。3．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）。4．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）。5．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA。7．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比感受态细胞制备中，加了两次氯化钙，它们的作用分别是什么？除了增加细胞通透性之外，第一次还有洗净之前一步残留的LB液体的作用。如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！精品精品精品