【doc】 弓形虫抗体免疫印迹试剂盒的研制
弓形虫抗体免疫印迹试剂盒的研制
巾闻寄牛虫学寄,虫病杂志2005年12月第23卷6期chinaJParasit0IParasitDisDec.2005,Vo1.23,NI1.6?449.
史章编号:l000—7423(2005)一06—0449—04【实验报道】
弓形虫抗体免疫印迹试剂盒的研制
蒋守富,张述义,曹琳,潘彩娥,魏梅雄
【摘要1目的研制敏感,特肄的检测弓形虫lgM和lgG抗体免疫印迹试剂盒.方法收集人T感染RH株弓形虫
速殖_f昆【IJj系小鼠的腹腔液,提取j形虫}}色!质蛋白,采fH二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分离弓形虫可
溶性抗原,许经电泳转印至硝酸纤维膜,以无毒敏的叫【}l基联苯胺(TMB)为底物分别俭测30份弓肜虫lgM干?28份lgG
性『f1【清.40份健人m清通过比较抗原制备方法和使川剂f}{=,封闭剂,洗涤和稀释剂,T作浓度,作IN,,/问以及反应
带jf{观.选择最佳聆条什,以敏感性,特异性,You(1en指数以及稳定性作为试剂盒评价标准结果_【_}j免疫印迹试
剂盒俭30份弓形虫lgM和28份lg(m性血清,敏感性分别为90.0%(27/30)和85.7%(24/28),40份健嚎对照者咀清
的弓形虫lgM和lgG抗体均为,特异性均为100%,Youden指数分刖为0.9和0.86.试剂盒_『4cc保存约6个川的检
测结一致结论发铯疫印迹试卉lj盒敏感性和特异性均较高,且操作
简便,快速
【关键词】肜虫;免疫印迹;试剂盒;敏感性;特异性
r{1Ig1分类lj:113825
DevelopmentofImmunoblotKitfortheDetection
ofAnti-ToxoplasmaAntibodies
JIANGSI1I)u—fu,ZHANGShu—yi,CAOLin,PANCai—e,WEIMei—xi
ong
(ShanghaiMunicipalCenterfo,DiseaseControlandPrevention,ShanghaiCenter
,o,ToxoplasmosisDetection,Shanghai200336,China)
【Abstract】
0bjectiveTo(1?I?l(„I1adiagn()sti(?kitfnrthelleteeti,mofanti—lbxopht~maa
ntilm(1iesinhuum~lsera
1)yiIllllmnoHottel?hnique.Methodsl,l1(cytoplasmproteins(1fToxopla~m.gondiiwereextra(tedfronlel41e(„tPdas(,ites
inKulnningstrainuli(„Pill[i1?tedl1tat?llzoites()f.7br),J(“gondii(RHstrai~1).Toxopltt~magondiisohl1)leantigens,~Pn
separatedl?SI)S—lA(;Icele(tr(1pho~(SISall(1transle~Te(1tofl,roxylinUleln1)rau(.[!singnonpois~)nonstetramethyllJPnznP
(TMB)ashorsel?a(1ishperoxi(1ast—SllbStl?ate?rimnluno1)l()t.theoptimalexpe~imentaleunditionswPIsele(„tellthr1)ngh
(„()nl1)aris(1nofantigenepal?atim1.1?eag(ntsfi)rIAo(king()rwashing,dihlti,)nc(nleentratiou,real:tiontime,and
freltUenl?iesofrea(ringlland.Sen;it3.spelifildty.~[oudenindexandsta1)ilityWereevaluatedastilestandardforthe
kit.ResultsIn30Prawithanti一7bxoplasmafgMarltitlodiesanti28?
ithlgGantibodies.thesensitivibfilrlgM
anllIg(;antiblldydetel?ti(1nwas90.()(27/30)and85.7%(24/28)respeeti~eb?,thespeeifil:itywasall100Cl(inexamining
40heahhyeontrolsera.andthe,()lahtlinllexwas0.9anll0.86respe(„tivel}.Thekitwasstableat4~Cfi)r6m(1nths.
ConclusionTheiI1llnlm1)bhltkitsh()nalleasyoperation.fast|.eaetionantil?elia1)leresult.andmaybepra(„til?a1.
【Keywords】Toxoplasmagondii:lmmunoblot:Kit:Sensitivity;Specificity
弓形虫寄牛于有核细胞内人体感染弓形虫后大
多呈带虫状态而不发病,当机体免疫功能受损或低下
时会出现弓形虫性脑炎等严重病状,孕妇可导致流
产,或i~1fiIL致畸.I大l此,对于弓形虫感染早期诊断
和治疗十分重要.目前,主要依据实验室检测感染者
血清中的抗弓形虫抗体(IgG,IgM)进行诊断--,我
同现有的弓形虫病诊断试剂盒检测方法不够稳定,敏
感性和特异性仍不理想.本文应州免疫印迹技术
作者单位:J海I{疾病预防控制叶1心.上海lfr,j形虫病检测巾心
f?海200336
(ELIB),将四甲基联苯胺(TMB)作为底物,优化实
验条件,研制出用于检测弓肜虫IgM和IgG抗体的免
疫印迹试剂盒.
材料与方法
1血清
人体抗弓形虫标准叭清.南WHO国际生物标准
化实验室提供(500IU/ml,批号:001031)弓形虫
病患者血清购自丹麦国立血清学研究所.测试前用2
种进口弓形虫诊断试剂盒(意大利Diesse公司和美
.450.It?1日寄虫学奇叶虫痫杂忠2005年I2月第23卷第6期ChinaJParasitolParasitDisDec.2005,V(I.23,No?6
同Sorin公司)筛选tt130份弓形虫IgM和28份lgG
抗体阳性ml_清.感染弓彤虫兔lflI_清,I十1本室人丁感染
RH株弓形虫速殖子47d的家免清,直接凝集试验
的抗体滴度为l:160000.40份阴性I『I【清为上海市汽
乍驾驶员常规体检健康人清,
2抗原制备
取常规接种RH株弓形虫速稍子(1×107/鼠)3dfl~,J
小鼠(昆明系)腹腔液(90只小鼠,每鼠ll1),l000~g
离心20lnin.夫j清,加0.83氯化铵溶液l00llll
处理3nlin,lO00~g离心20lllin,沉淀川磷酸缓冲
盐溶液(PBS)洗涤3次,加适舒泰蒸水,置液氮巾
冻融,裂解.超声粉碎5次,l1O00xg离心30lllill,
t清液即为弓形虫胞质f1,分装保仔于一70备
3试纸条制备
果,L{Jf一烷磺酸钠一聚烯酰胺凝胶I乜泳
(SI)S,PAGE)及电泳转印法,分离胶浓度为l2.5%.
浓缩胶浓度为4%,交联度均为3%分圳加入l0l
低分子量标准蛋h和l00l弓形虫胞质蛋白,进行
电泳(条件为:300V,40mA,l0一,50ll/il1).取下凝
胶,覆以硝阪纤维膜(NC膜.孔f0.2m),置半f
式电泳转移仪(Hoefel一,炎Imlll(I1~11/1)内,15v转
印30nlin取tt{转印膜.对照标准赁n位置,切去相
对分子质造(Mr1>35000部分转印愤,保留的转印
膜分别川5组封闭剂封阻1h.切成3rnTn宽试纸条.
一
20冻存备,L}J,
4试剂盒操作方法
将上述制备的试纸条分别置于反应槽内,分别加
入1:100的弓彤虫阳性m清和健康对照清300l孵
育lh,洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的第
::抗体(抗人IgG或lgM),窀温振荡培育lh后洗
涤.再分刖加300l色液(F}1l:20的A,B两液调
配而成.A液为溶1二无水乙醇的四甲基联苯胺
(TMB)?:液,B液为pH5.0的柠檬酸一PBS,气溶胶
OT和H!O配制),5lllin后用dH!O冲洗以终止反应,
结果判读以}}1观蓝色反应条带判为阳性.阴性无反应
带
5实验条件的优化
影响试剂盒检洲效果的主要『大I素,包括抗原,
试纸条,洗涤剂,稀释剂,封闭剂,色剂以及反
应时间等.通过不同配比组合,选择最佳实验条件.
结果
1最佳实验条件的选择
1.1抗原制备方法和使用剂量比较用胰蛋白酶消
化法制备弓形虫可溶性抗原获得率较高,但不易破坏
宿主红细胞,川该抗原制备的试纸条,阳性反应条带
着色淡,不易辨别常规分离法(将弓形虫速殖子
经超低温冻融+超声粉碎可使速殖子内蛋白全部释放,
加氯化铵溶液使红细胞完全被破坏)所获的抗原制备
的试纸条.阳性反应条带着色明显,杂带少,易辨别
每…试纸条抗原量,根据蛋白含量进行比较,2,16g
共分8组,结果以12g/条最为适宜,低于8g色
带较浅,高于12g显色效果相差无几.
1.2封闭剂比较同时对5%脱脂奶粉,PBST
(包括pH7.2的0.01mol/LPBS和0.05%Tween一20),
l%酪蛋白,5%牛m清白蛋门以及3%明胶等5组封
『于J剂进行比较.结果,以5%脱脂奶粉的封闭效果最
佳,零底呈白色,反应带为蓝色.其他封闭剂的效果
差,如PBST和酪蛋白作为封闭剂,均出现较多的
非特异性条带;川牛清向蛋门和明胶作为封闭剂,
反应条带不够清晰
1.3洗涤剂和稀释剂以pH7.2的0.01Hiol/LPBS
为洗涤剂及再加入5%脱脂奶粉作为稀释剂,另以pH8.0
的TBST(包括0.01illol/LTris—HCI,0.15nlo1/INaCI.
0.1%Tween一20)为洗涤剂,再加入5%脱脂奶粉作为
稀释剂.两者比较,TBST明显优于PBS,背景与反
应带对比清晰,而用PBS则混杂一些非特异性反应
条带.
1.4底物显色剂比较川TMB和二氨基联苯胺
(DAB)为底物,检测感染弓形虫兔血清的IgG抗体滴
度分别为1:102040和1:25600,检测国际标准抗弓
形虫人I仉清的浓度分别为0.25IU/ml和1IU/m1.表
明TMB的检测灵敏度高于DAB.显色时间.TMB只
需5min即可显示最佳反应色带,而DAB需20min
以上.用TMB作为底物优于DAB
1.5工作浓度比较将弓形虫病患者血清稀释为1:50,
1:100,1:500及1:1000,分别与T作浓度为1”.50,1:100,
1:500及l:1000HRP标记的抗人IgG进行反应.与
1:l00,1:500,1:l000及I:2000的HRP标记的抗人
IgM进行反应.出现最佳显色效果的血清稀释度为
1:100,抗人IgG为1:100或抗人IgM为1:000.表
现为主带显色清晰.背景无色.40份阴性血清按
I:50稀释,在高分子量处出现浅色的非特异性条带.
按1:100稀释,背景清晰无色带.
1.6作用时间比较血清与试纸条的孵育时间分别
I5…irl,30l『1_『?,45_llll1,Ih技2Ii果.1nilli
.…F”Lm消腹『,包t.以f随fllt!l~J闸的延f
Ini逐渐nll深.frIll101h,包妓JLii;】InI差圳
佯,1Jfl凡一i屯订人JLI1I{I止几lg~?1一llRP)6蛘
秆l5111iI1.『:rifil{1.乜l{fk.LlJi茎inn探.
45?i--l包敢了Illh旧.摹圳r?B
包时IiI【_5nilii.…IIIll1”}.IJl1椿,影啊
}圳
I7反应带出现率jL较I—I.最仆骗条件下
?川j虫患m晰|Il』互,{…腹f低舒J
处J七…I,JM…r{:l王l?P,1l35(H)【),22?f)【】相I
I【)[)c]f)处.Ig{:…il-t”l-1.h-Mt32000n130(】(1I)
处.这JI匕fn…J一举刮4I臀,8lil1丁高{,r
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图I免疫郎迹试剂盒阳性反应带
Fig1I】itireacli?】nforanli一7J”manii1~3d3
I?ytheimmunabh)lkil
2检测效果评价
!.J敏感性免疫迹试制愉删30,弓形虫【M
in【清,检17份.鼬感性为90【J:榆删18份
一
j形虫Ig(;阳性IIIL?i~J:,梳…14份,敏感?PL85.7%
!.!特异性椅沁J40份健埭人In【清形虫J?f?
lg(;抗体.均为.特勾I【H)%此外.
计3俐『幢虫摘4剜炎?濉…jm,!削丝虫痫
2倒蚌幔虫痫以驶!删鹱蚴10患ln清世行弓形
虫抗怍舱洲,.跟均尢交l芷li盹
2.3,(ILllleI/指数fj{“Y…llll指数=敏感rl+
特r{?一I”„l暂:,龟螋印迎刹随删,JJ虫】g?机
体的Y(ILII[~?II指数勾(?.』世l】试剁惫洲结果『_10符
合牢为957*:髓测r肜虫I(:~,if?ki.?Lid?指数乃
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24稳定性试制翕十一:rj【匕jifJcn:等{l{
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毁<c)J.琏书渗嘲价值
疫FIJ迹技术j集赁If堰凝脞电泳-西圩辨笨和『
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反啦步骤,K了操干1]li,.fjill水殳悔T?Ij与气溶胶
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Hn)厦i乜,色彩弛黼.于削圳.擞高r灵敞
度术增JJll反应步骤书浊?I.?IT.的敞度较DAB增
?41,I包时r闩J他I)Al{的l,4I1f同l『l_愉测弓肜
虫IM和Igq抗体.埘这I埘.Nqlc体检州的?~I)LII1指
数挺示有较高的诊断价值.尤蕻1市售IM试制
盒检删效不理的情况F,[!-4i应川价『ll:f术法
拇忭便,JI]l[~j-魉{全过程f15,宴fI]iI.强..?I.{
搿摊广伍川
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(收稿日期:2004—10—26编辑:富秀兰)
玉树县人体棘球蚴病流行病学调查
马俊英,马霄,吴献洪,张静宵,何多龙,刘王芳,刘巴睿,刘培运,
刘海青,赵延梅,蔡辉霞,王虎
玉树县地处青海吉I幸『部,青藏岛东南腹地,隶属玉树
藏族n治州,是以牧,l为主的地区.陔县辖l镇8乡,总人口
为75087人,主要以藏族为主(1fi9l%)按照《全国人体重要
寄生虫病现状渊金施细》的
和方法,作者等于2002
年5月对树县结占镇和巴塘乡开展J人体棘球蚴病悯查.结
粜
如F
1调查对象和方法
1.1调查对象根据《全I叫人体重要寄十虫病现状调查实施细
则》进行分层整群随机抽样,抽取2乡(镇)4个行政村作捌查
点,分别为结?镇的果青村,解放村和巴塘乡的上巴塘村,相
古村.调查对象为2岁以上的常住居民,每点凋查500人以上.
1.2调查方法B超检查肝,脾,双肾及腹腔和盆腔脏器等
(用AlokaSSD一500型B超机.日本,探频率3.5兆赫);用
ELISA检测l缸清抗棘球蚴lgG抗体『试刹盒购一珠海海泰生物制
药有限公一j(批号0203l0)1,以吸光度(4值)??3s为阳性判
定标准
2结果
2l患病率及血清阳性率B超共检查l070人.棘球蚴病检
}}1率为3.0%(32/1070),其f}l检查藏族1065人.32例阳性
血清学检查781人,阳性率为20.6l%(161/781).共检m细粒
棘球蚴病(CF)患者28例,泡球蚴病(AE)患者4例,患病率分别
为262%,0.37%
2.2性别分布男,女棘球蚴病检…率分别为2.1%(10/471)
和3.7%(22/599),两者差异无统计学意义(x=2.18,P>0.05);
男,女血清阳rk率分别为l6-3%(55/338)和23.9%(1061443),
女性高于男性(x=6.87,P<0.05).
2-3职业分布不同职业人群棘球蚴病检H{率,血清阳性率不
同牧民,农民,家庭妇女和其他职,的检llJ率分别为4.1%,
6.7%,3.5%和3.2%,牧民,农民,半农半牧,家庭妇女,学生,
学龄前儿童,行政干部和其他职业血清阳性率分别为24畅,
作者单位:青海省地方病预防控制所,西宁8ll602
【简报】
22.5%,2.2%,20.7%,29.4%,30.0%,28.6%和l1.1%?
2.4年龄分布除l0,l9岁组外.其他各年龄组均查见棘球
蚴病患者,以50,,60,岁两组人群检率为高,分别为
7.0%和7-4%
2.5地区分布结古镇和巴塘乡居民的棘球蚴病检出率分别
为4.8%和1.4%.血清阳性率分别为27.0%和l3.4%.结古镇
棘球蚴病俭率和血清阳性牢均高于巴塘乡(P<0.05)
3讨论
本次调查结果显示,玉树县为细粒棘球蚴病和泡球蚴病交
叉混合流行,但主要以细粒棘球蚴病为主,多房棘球蚴病为
辅.1994年曾报道玉树州囊型棘球蚴病患者自l980年以来高
达ll70例.牛,羊棘球蚴感染率分别为38-3%和47.0%,
本次渊查棘球蚴病患病率为30%,m清学阳性率为207%.
本次调查结果显示,人群中女性细粒棘球蚴血清阳性率较
高,职业中农,牧民血清阳性率较高,与该性别,职业人群参
加牛产劳动,接触犬的机会较多所致.棘球蚴病患者中最小年
龄者9岁,最大者84岁,而高年龄组出现较高的患病.可能
与当地缺医少药,不能及时诊治及棘球蚴病具有漫长的潜伏期
等有关.
与玉树县一河之隔的称多县分别于l992年和l997年
两次人群棘球蚴病流行病学调查,患病率高达5.0%和8.5%.
两县作为玉树藏族自治州及”三江源”的交通大动脉.经济贸易
频繁,人员流动性大,近年来随着经济贸易不断扩大,大量疫
区犬和家畜向省内外不断地输出,必会加重全省乃至其他地区
棘球蚴病的流行.应加强对该地区的棘球蚴病防治和控制,防
止再度蔓延
参考文献
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16(4):67.
(收稿日期:2005.O1.17编辑:盛慧锋)