动物营养实验技术

《动物营养实验技术》（硕士）讲稿硕士研究生实验的基本要求1、掌握的一般实验室操作技能，概略养分法和某些纯养分测定法；2、掌握消化代谢实验；3、能根据文献所提供的方法做出未做过的实验；4、能编写实验指导书；5、能指导本、专科学生进行动物营养学和饲养学实验；6、了解饲养分析实验室的要求及各实验所需仪器，药品的规格、数量等，能够进行实验用品和建立新实验室。实验室规则和安全条例1、实验前认真预习实验指导，清楚实验原理、方法及注意事项后，再进行操作；2、实验中认真负责，严格按照操作规程进行；3、.使用仪器，特别是精密仪器，必须先了解仪器性能，再进行使用；4、取用浓酸、浓碱和有毒药品时，切记用吸量管吸取，以免吸入口中，同时要防止将浓酸、浓碱等腐蚀性药品流到用具上，沾在皮肤上或洒在衣物上；如果不慎将大量酸流到桌上，可加适量的碳酸钠溶液，直到不产生气泡为止；如果大量的碱溶液流到桌上，可用适量的稀醋酸中和，然后用水冲洗桌子，再用抹布擦干净；如果酸沾在皮肤上，要用较多的水冲洗，再用3％～5％的碳酸氢钠溶液洗涤；如果碱沾在皮肤上，也要用大量的水冲洗，再用硼酸溶液洗涤；如果眼睛里溅进了酸溶液，要立即用清水冲洗，再用2％的碳酸氢钠溶液洗；如果碱溅进了眼睛里，则用饱和硼酸水洗后再用水洗；若浓硫酸沾在皮肤上，不能用水洗，否则损伤严重。5、取用易燃药品如乙醚、丙酮、石油醚、酒精等时，应远离明火，以防着火；6、药品用完后，应放回原处，不能任意改变原来的位置，节约使用药品和水电；7、爱护实验室仪器和设备，如有破损，应说明后补领；8、实验完毕后应将仪器洗净放在指定的地点，将实验台等清理干净；9、保证实验室清洁安静，室内不得吸烟和吃东西，残渣和废纸不能扔入自来水池内，酸、碱等有腐蚀性的废液不得倒入铜制水管的磁盆内，以防腐蚀；10、每次实验结束后，应检查实验室仪器、药品、水、电、暖、门、窗等，保证绝对安全；11、中午、晚上加班时，要求至少两个人在，不能只留下一个人；12、实验过程中注意事项：要用钢笔（蓝黑墨水或碳素笔），不能涂改，若写错，应在其上划“-”，并在旁边另写出正确的值（或字），小数点后四位或两位；样品名称要写清楚，样品、试剂、溶液随时贴标签、编号；计算时重量法取最低值；注意计算误差；平行测定数目一般3个；平行测定的结果如何取舍，相对偏差的要求，一般是5％。教学内容第一章动物营养实验基础一、药品的规格、合理使用和管理1、规格（详细的见附表3）表1药品的规格 等级 1级 2级 3级 4级 符号 G.R A.R C.P L.R 纯度级别 优级纯 分析纯 化学纯 实验室用 标签颜色 绿色 红色 蓝色 蓝色 纯度 最高 次之 更次之 最差 用途 精密分析用 基准物质用或分析用 一般定性或化学分析用 一般化学实验用还有光谱纯试剂、生物试剂、指示剂、层析用试剂等，有各自的要求。2、合理使用一个实验室内同一种化学药品应具备各种规格，以便按需使用，纯度低的不能代替纯度高的，否则影响实验精度；如果可以使用纯度低的，不用纯度高的，可以节约费用。另外，实验室还需准备一些工业试剂，如配制洗液，干燥用硫酸，酒精灯用酒精等。3、保管1）化学药品均应装于蜡封口的玻璃瓶或塑料瓶中保存，遇光分解的物质，应保存于棕色瓶中，放于暗室内；2）固体、液体、挥发性、易燃易爆试剂应分别放置，毒品应有专人专柜保管；3）化学药品在药品柜中要按一定的顺序排列，以便取用、查找方便，最好按照英文字母顺序排列；4）放置化学药品的库房应干燥、阴凉、无阳光直射。放置有挥发性试剂的库房应特别注意通风良好，应有灭火设备。二、烘箱等加热仪器的使用方法注意升温的控制方法，应先将温度定在需要温度的80%左右，最初升温会超温，等温度下降到暂定温度，然后将温控调到需要温度。三、容量器的使用和校正（重复做两次）目的：掌握容量器的使用和校正方法。主要有滴定管、移液管和容量瓶原理：称量容量器中所容纳（或放出）的水的重量，根据水的密度（表2）计算出容量器的实际容积。表2水的密度表 温度（℃） 密度（g/L） 温度（℃） 密度（g/L） 温度（℃） 密度（g/L） 10 998.39 17 997.65 24 996.38 11 998.32 18 997.51 25 996.17 12 998.23 19 997.34 26 995.93 13 998.14 20 997.18 27 995.69 14 998.04 21 997.00 28 995.44 15 997.93 22 996.80 29 995.18 16 997.80 23 996.60 几个概念温度：量器的容积与温度有关，规定一个共同的温度293K。标称容量（293K）：量器上标出的标线和数字。量器的容量允差（293K）：允许存在的最大差值。校正要求：容量器有一定的允许偏差，如果偏差在允许偏差范围内，则不必校正。见表3和表4。表3滴定管、移液管的允许偏差范围表 容积（mL） 滴定管（mL） 移液管（mL） 5 ±0.01 ±0.01 10 ±0.02 ±0.02 25 ±0.03 ±0.04 50 ±0.05 ±0.05 100 ±0.10 ±0.08表4容量瓶的允许偏差范围表 容积（mL） 25 50 100 250 500 1000 2000 允许偏差（mL） ±0.03 ±0.05 ±0.10 ±0.10 ±0.15 ±0.30 ±0.501、滴定管的使用和校正1）使用：准备、洗涤（内壁不挂水珠）、涂油(滴定管活塞涂油的量要合适，活塞不能漏水，但也不能涂多。若出现凡士林堵塞管口，轻则用针通，重则用洗耳球吸放热洗涤液的方法疏通，再洗至纯水后使用)、检查是否漏水(练习纯水自然流出，待液面降到10mL以上约5mm处，等30S后10S内调整至10mL的操作)、读数(准确)；（特别注意洗涤酸滴定管时一定要从其下面放出洗液或水）活塞涂油时要注意：（1）活塞、活塞槽用滤纸擦干；（2）滴定管（包括活塞槽部分）平放在桌上；（3）凡士林量合适：在活塞的两头涂以少量，或在孔的两边沿圆周涂一薄层（不涂孔）；（4）活塞插入活塞槽后向同一方向转动，直到全部透明，操作时滴定管平放在桌上；（5）涂凡士林合适后，套上橡皮筋或橡皮圈，防止活塞落地打碎。活塞操作方法：（1）左手的无名指、小指放在活塞下尖嘴管的左边；（2）中指和食指拿活塞柄的两端，大拇指邦忙；（3）手腕稍向上抬[（1）、（3）的操作使活塞小头不与手掌接触，避免顶松活塞而漏水]；（4）转动活塞时稍向里扣，避免活塞松动而漏水，但不能扣得过分，否则转动困难。控制加液速度：控制手转动的程度和速度可控制加液速度准确读数：（1）滴定管垂直：用右手大拇指、食指拿滴定管上部无刻度处，让其自然下垂；（2）视线与弯面以最低点成水平；（3）读至0.01mL2）校正：在50mL滴定管中，装满蒸馏水并调节至刻度0处，放出一段水于已知重量的铝盒中，记录读数，称重。再放出一段水于同一铝盒中，再称重，如此逐段放出和称重，直到刻度50处为止。由各段水重除以实验温度时水的密度，就可以求出滴定管每一段的真实容积。以滴定管读数为横坐标，总校正值为纵坐标，将所得结果绘成曲线，便于查阅。见表5。表5记录示例表 滴定管读数 读数容量（mL） 瓶与水重（g） 水重（g） 真正容量（mL） 校正值（mL） 总校正值（mL） 10.10 10.10 39.28 10.08 10.12 +0.02 +0.02 20.07 9.97 49.19 9.91 9.95 -0.02 0.00 30.14 10.07 59.26 10.07 10.10 +0.03 +0.03 40.17 10.03 69.24 9.98 10.01 -0.02 +0.01 50.00 9.83 79.07 9.83 9.86 +0.03 +0.04校正曲线绘制（略）**注意：（1）分段校正滴定管时，滴定管每次放出的纯水体积不一定是整数，但尽量接近于整数10.00mL，20.00mL……；（2）读数准确；（3）不能超过50.00mL**校正时，外壁不能有水。校正前擦净外壁的水，校正中若手、外壁有水应擦净。内壁有水，对测定没有影响。**旋开活塞任水自然流出，要待液面降到10mL以上约5mm处，关闭活塞等30S后，在10S内调整至10mL（这是规定的滴定管等待时间，使残留在内壁上的水相等）。**若放水超过50mL，重新装水至40mL，校正40～50mL段**处理滴定管下端的悬滴:（1）初读前的悬滴去掉；（2）校正时，加10mL水的锥形瓶称量后发现滴定管下端有悬滴，则靠在锥形瓶内壁，继续进行下一段的校正；（3）滴定管下端有悬滴，白瓷板上有少量水，则靠去悬滴，擦去白瓷板上的水，滴定管重新读数记录后，进行下一段的校正；（4）白瓷板上水多，这说明活塞漏水严重，滴定管须重新涂油，检漏后再进行校正。2、移液管的使用和校正1）移液操作：特别注意液面的调节，（1）微松食指使液面缓缓下降，才能控制液面随需而停；（2）眼晴视线与液面水平，液面最低点与刻线相切。溶液自然流出后，等待15S。2）校正：用移液管吸取蒸馏水至刻度处，放于已知重量的铝盒中，称重，计算真实容积，偏差如果不在允许范围内，则需校正。例如：如果真实容积小于规定容积，说明刻度线偏下。贴方格纸于刻度上方，再装水到一定位置（方格的格数），然后放出水，再称重，计算容积，求出每一格所代表的水的容积，在规定容积的方格处标上记号。如果真实容积大于规定容积，说明刻度线偏上，相似的方法。3、容量瓶的校正直接称量法：①将要校正的容量瓶清洗、烘干，称重；②将室温（室温1小时以上）的蒸馏水注入容量瓶，定容，称重；③测定水温，查该水温下的密度，计算体积是否与容量瓶一致；④若不一致，根据体积和密度在已知重量的容量瓶中秤水的质量；⑤在校正体积的液面（下）贴一圈纸条涂蜡，用针在纸条上划圈，涂上氢氟酸，几分钟后洗去氢氟酸，除去纸条和石蜡，就有新刻度；⑥重复①②的做法，取平均值，算出体积，标允差。间接称量法：取一只容量大于被检量器的空容器，放在天平上进行空秤量平衡；准备检定用的纯水或蒸馏水，检查水温与室温之差，应小于2℃；将检定用的水注入被检量器中，到达标定线后倒进空容器中进行称量，得到纯水的质量值m0；用温度计测量水温t，参照规程附录求其质量值m按公式式计算被检量器在20℃时的实际容量。四、实验室常用洗涤剂的配制1.铬酸洗液15g研细的工业用重铬酸钾或重铬酸钠用水湿润后，溶于500mL工业用浓硫酸中。保存在加塞的密封玻璃瓶中，可除去玻璃仪器的油污和有机物，可以反复使用（当颜色变绿时，说明被还原成三价铬离子的硫酸根络合物，表示已经失效，必须重新配制）。使用时要防止该洗涤液与有机溶剂接触。2.碱醇洗液120g粗氢氧化钠或氢氧化钾溶于120mL水中，用酒精（燃烧用）冲到1000mL，混匀备用。可除去油脂类污垢。四、指示剂的配制1、0.1％甲基红乙醇指示剂0.1g甲基红+100mL95％乙醇。称取0.2000g甲基红；在玛瑙研钵中研细，倒入一定量的酒精，研磨后，将清液过滤到200mL容量瓶中，反复几次，直到研钵中的甲基红全部冲入容量瓶。注意：过滤是防止杂质和没有研细的颗粒进入，影响浓度，然后用酒精冲洗滤纸3次，最后定容。2、0.5％溴甲酚绿乙醇指示剂0.5g溴甲酚绿+100mL95％乙醇。3、0.05%甲基橙指示剂0.05g甲基橙溶于100mL蒸馏水中4、0.5%酚酞乙醇指示剂0.5g酚酞溶于100mL95％乙醇五、标准溶液的配制1、配制1）直接法：溶质为基准物质在分析天平上准确称取一定量的已经干燥的基准物质，溶于水，转入已经校正的容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即可。**作为基准物质的条件：纯度在99.99％以上；组成与化学式完全相符；稳定性好，不易吸水，不易被空气氧化等；物质的量大，可以减少称量误差。**常用的基准物质有：邻苯二甲酸氢钾、草酸钠、硝酸银2）标定法很多物质不符合基准物质的条件，如浓盐酸中的氯化氢很容易挥发；固体氢氧化钠很容易吸收空气中的水分和二氧化碳；高锰酸钾不易提纯等。这些物质不能直接配制标准溶液，可以使用标定法来配制，具体方法为:先用这些物质配制成近似所需浓度的溶液，再用基准物质标定其准确浓度。即准确称取一定量的基准物质，溶于水后用待标定的溶液滴定，至反应完全，根据所消耗的待标定溶液的体积和基准物质的质量，计算出待标定溶液的准确浓度。标定要同时作2～3个平行，取平均值。2、常用标准溶液1）0.02mol/L盐酸溶液：浓盐酸的含量36%，比重1.18，分子量36.5，根据容量瓶的体积计算取样配制粗溶液。再用碳酸钠或碳酸氢钠基准物质标定，或者用碱标准溶液标定。2）0.1275mol/L硫酸溶液（测定样品中粗纤维）：理论值是7mL浓硫酸稀释至1000（浓硫酸加入水中，切忌相反）；也可以先配成浓的硫酸溶液再稀释成所需浓度，然后再标定。用已经标定好的氢氧化钠溶液标定，指示剂为甲基红，当溶液由黄色变成橙红色即为终点。但实际很难配制到要求的浓度，只能先配制浓度高的硫酸标准溶液（如2或3M）,标定后再稀释要求浓度的稀标准溶液。3）0.313mol/L氢氧化钠溶液（测定样品中粗纤维）：首先粗配浓度高的氢氧化钠溶液（如3M）。然后根据溶液的大致浓度确定称量（滴定是20-30mL）邻苯二甲酸氢钾（先在100～105℃烘1小时，干燥器中冷却30分钟），加入蒸馏水100mL，用酚酞作指示剂，用氢氧化钠溶液滴定，当无色变为淡红色即为终点，计算其标准浓度。再稀释成需要浓度。4）0.05mol/L高锰酸钾溶液：称取高锰酸钾约1.6g，溶于1000mL蒸馏水中，煮沸10分钟，冷却，静置过夜，用玻璃丝过滤（最初的数滴废弃），保存于棕色瓶中。标定时将分析纯草酸钠约10g，130℃烘1h后，放在硫酸干燥器中冷却，准确称取3份草酸钠，每份重0.1g，放在两个250mL的三角瓶中，各加入50mL蒸馏水，再加1：3的硫酸溶液10mL，加热到75℃～85℃，用配制的高锰酸钾溶液（酒精灯保温）滴定至出现淡红色，半分钟不褪色为好，滴定完后，溶液温度应该仍在60℃以上。同时做试剂空白实验。注意：KMnO4溶液可用还原剂作基准物来标定。H2C2O4.2H2O、Na2C2O4等都可用作基准物。其中草酸钠不含结晶水，容易提纯，是最常用的基准物质。浓度的确定：配制0.05M的溶液，称取1.6g（1摩尔是158.03g，反应中Mn由正7价转变为正2价，转移5个电子，配制时计算高锰酸钾的量=158.03*0.05/5=1.58g≈1.6g）溶于1000ml水中，然后标定。标定的条件：温度：在室温下此反应的速度缓慢，因此应将溶液加热至75-85℃；但温度不宜过高，否则在酸性溶液中会使部分H2C2O4发生分解。酸度：溶液保持足够的酸度。一般在开始滴定时，溶液的酸度约为0.5-1mo1/L。滴定速度：滴定开始时，加入的第一滴KMnO4溶液褪色很慢，所以开始滴定时滴定速度要慢些，在KMnO4红色没有褪去以前，不要加入第二滴。等几滴KMnO4溶液已起作用后，滴定速度就可以稍快些，但不能让KMnO4溶液像流水似地流下去，否则加入的KMnO4溶液来不及与C2O42-反应，即在热的酸性溶液中发生分解。应用示例：钙的测定Ca2++C2O42-===CaC2O4(碱性)+酸→C2O42-2MnO4-+5C2O42-+16H+＝2Mn2++10CO2+8H2O3、标准溶液配制、标定及使用注意事项**酸标准溶液和碱标准溶液的配制和标定必须在无酸气和无氨气的环境中进行；**盛酸标准溶液的玻璃瓶用严密玻璃塞塞好，盛碱标准溶液的玻璃瓶用橡皮塞塞好，高锰酸钾标准溶液需装于棕色玻璃瓶中，保存于不见光的柜中；**标准溶液必须放置于阴凉而空气清洁的实验室；**标准溶液取用前，必须使劲将瓶中的溶液摇匀。使瓶颈上的水汽与溶液混匀；**标准溶液倒出后，切勿倒回原瓶；**盛标准溶液的玻璃瓶上必须贴上标签，写明标准溶液的名称、浓度、标定日期以及标定者姓名；**标定过程中加入的指示剂量，不能超过必需之量，以保证有一鲜明变色；**标准溶液的有效日期：即标定过的标准溶液过一定时间后需重新标定。几种标准溶液的有效日期如下：各种酸溶液（各种浓度）：3个月氢氧化钠溶液（各种浓度）：2个月高锰酸钾溶液（0.05mol/L）：1个月硝酸银溶液（0.10mol/L）：3个月**标定时，基准物质的取量应依据最后的滴定量所决定。一般最后的滴定量在20mL～30mL之间为宜，则基准物质的取量（g）＝25*C待标定溶液*MB（基准物质的毫物质的量）标定酸碱的基准物质见附表1。第二章饲料样品的采集与制备一、样品的采集目的：主要是为了分析结果具有代表性。要测定某些饲料的营养成分，在实验室仅用很少量的样品，为使测定结果有能代表饲料成分，必须按要求严格采样。采样应满足的条件：①原始样品应尽量由大饲料堆中，在不同方位、不同深度处采集，采集点一般不少于5个；②原始样品采取后按四分法均匀取舍，得出分析样品；③分析样品干燥后的重量不少于200g，细度通过40～60目筛；④分析样品应保存在干燥阴凉处。方法：不同饲料样本的采集应根据采集样品的种类、分析目的等区别对待。主要是几何法和四分法。采样的仪器设备：麻袋采样器、剪刀、切刀等。1）粉料和颗粒料，用采样器分点或样品的堆放形状选几何点取样；2）油饼（粕）类，几何形状分点采样；3）新鲜青绿饲料，地形划区分点采样；4）水生饲料，水面及生长状态，对角线等距离多点采样；5）青贮料，分层取样；6）块根、块茎和瓜果类饲料，多个样品的不同几何形状和部位取样；7）粗饲料，堆垛几何形状分层取样；8）糟渣类，装运形态分层取样；9）液体原料，“抓取法”；10）动物性饲料，与1）相似。二、样品的制备制样的目的：样品的制备是对采集到的样品分取、粉碎、混匀、装瓶等过程。样品制备的目的是保证样品的均匀性。制样的仪器设备：粉碎机、碾槽、研钵、筛子等。风干样品的制备：主要内容为制样过程和方法。风干法（没有烘箱或样品太大时）：采样后先称重，然后阴干（薄层，防止发霉），直至重量不变时称重。半干样品的制备（初水分测定）**烘干不回潮法：在洗净、烘干并已知重量的磁盘中称200g～300g的鲜样，放入100℃～130℃的烘箱中烘15分钟灭酶（防止酶分解），然后迅速将磁盘转移到60℃～70℃烘箱中烘8～12小时，在室温下冷却30分钟，称重，再烘2小时，称重，直至恒重（±0.5g）。**烘干回潮法：在洗净、烘干并已知重量的磁盘中称200g～300g的鲜样，放入100℃～130℃的烘箱中烘15分钟灭酶（防止酶分解），然后迅速将磁盘转移到60℃～70℃烘箱中烘8～12小时后，放于室内24小时，充分回潮后，再称重，再放入60℃～70℃烘箱中烘2小时，充分回潮后，再称重，直至恒重（±0.5g）。样品的粉碎粒度：常规饲料营养成分分析要求过40目筛（0.45mm），但粗纤维除外，粗纤维GB/T6434-94要求过18目筛（1mm）。三、样品的登记与保管样品的来源、采集时间等等。第三章饲料营养成分分析一、饲料干物质（水分）的测定原理：样品在105℃烘干，烘掉吸附水，其原因是非游离的水分在100℃以下不能烘干。但是象水果和糖类等含糖多的样品不宜在105℃烘，因糖在高温时容易分解，尤其是果糖。所以测定含糖多的样品时都采用减压低温烘箱干燥法，用烘干法测定的水分中还包括有少量芳香油、醇及有机酸等物质。步骤：盛样器的处理：（铝盒）洗净，在105℃烘箱中烘1h，干燥冷却30´，称重。称样：在已经恒重的盛样器（铝盒）中准确称取2g左右（准确至第四位小数点后）样品，放入105℃烘箱中烘5～6h，干燥冷却30´，称重，然后放入105℃烘箱中再烘1h，干燥器中冷却30´后称重，直至恒重（±0.002g）。注意：不同样品所需的时间和条件不同。如粮食可以在130℃烘1h，结果与105℃烘4h一样；而鲜果和糖必须在50～100mm汞柱的减压烘箱内干燥。测定粘稠品，如蜂蜜、油脂等的水分时，可以采用1：1盐酸浸后洗净的大粒砂子掺入样品中，并用玻璃棒在烘干的时候时常搅拌，才能得到好的结果。用减压低温测定水分的时间比空气烘箱烘的时间长，一般第一次都在10h以上。平行样品的测定值相差不得超过0.2％，否则应重做。二、饲料样品中粗灰分测定原理：待测样品在550℃～600℃高温条件下有机物灼烧掉，剩下的为无机物，主要是氧化物和盐类还有砂石等杂质，称粗灰分，如下图。步骤：①坩埚的处理：将坩埚洗净，在105℃的烘箱中烘干，然后在550℃～600℃高温炉中灼烧30分钟，待高温炉的温度降到200℃后将坩埚取出，置于干燥器中冷却30分钟，称重，直至恒重（±0.001g）；②样品的处理过程：称样2g左右（准确至1/1000或0.0001g）于已知重量的坩埚内；炭化；在550~600℃的高温炉中灰化5~6小时；降温；干燥器中冷却30分钟；称量；恒重（恒重时，两次的称重误差在±0.001g）。注意：在坩埚上编写号码时用0.5％的氯化铁墨水溶液（0.5gFeCl3·6H2O溶于100ml蓝色墨水中）灰化时间4～6小时，主要由坩埚中灰分的颜色决定，而不是固定的。应该全部为白色为好，如果是灰白色，则说明有碳质，还须继续灼烧；如果是红色，说明含有铁，如果是蓝色，说明含有锰，不须再灼烧；灼烧温度不得超过600℃，否则磷酸盐会熔化，凝结为固形物，其中所含的碳粒不易氧化。温度过高，钾、氯等元素也能挥发，使所得的结果产生误差。粗灰分含量在5％以上时，允许相对偏差为1％；在5％以下时，允许相对偏差为5％。三、饲料粗蛋白质测定原理：饲料中的有机物在催化剂的作用下，用浓硫酸消化使其中的氮转化为氨气，并被浓硫酸接收转化的硫酸铵。然后消化液在浓碱中反应放出氨气被硼酸溶液接收，并转化为四硼酸按，然后以甲基红和溴甲酚绿为指示剂，用盐酸标准溶液滴定，根据盐酸溶液的用量求出氮含量，再转化为粗蛋白的量。步骤：消化：称取0.5～0.8g（准确至万分之一g）样品装入消煮管中，然后加入按比例混合好的无水硫酸钠和硫酸铜的混合物2.6g左右(一牛角勺)，玻璃珠两粒，再加入浓硫酸10ml，将消煮管放在消煮炉上进行消化。开始时将温度调到100℃左右，待泡沫停止产生以后，再将温度调到300℃以上，直至消煮管中的液体澄清（消化时应经常转动消煮管）。消化完毕后，将消煮管冷却，加入蒸馏水，转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水冲洗消煮管数次，转移到同一容量瓶中，定容，同时应做空白。蒸馏：在三角瓶中，加入10ml1％的硼酸溶液，再加入甲基红和溴甲酚绿指示剂各一滴，将三角瓶置于冷凝管下，管口浸入硼酸溶液中。然后在反应室中加入40％或50％的氢氧化钠溶液，蒸馏3分钟，冷凝管口离开液面再继续蒸馏1分钟，蒸馏结束取下三角瓶时用蒸馏水冲洗冷凝管口外壁；滴定：用0.02mol/L的盐酸溶液滴定，记录盐酸的用量。样品的取量，根据样品中粗蛋白质的含量（平均含量，查表可知）确定，见表6。表6饲料中蛋白测定时定容量、蒸馏量与盐酸标准溶液用量的估计 风干样品中CP(%) 样品取量（g） 消化液冲淡量（ml） 蒸馏消化液取量（ml） 滴定盐酸预期量（ml） 1～10 0.5 250 20 0.4～4.4 10～20 0.2 250 20 2.2～4.4 20～40 0.2 250 10 2.2～4.4 40～70 0.2 500 10 2.2～4.4 70～90 0.2 500 10 2.9～4.0催化剂及其作用：无水硫酸钠（或无水硫酸钾）的作用是提高浓硫酸的沸点，使消化效力提高，纯硫酸的沸点是317℃；加入无水硫酸钠（或无水硫酸钾）后，沸点可增加到325℃～341℃。硫酸铜为催化剂，并可在蒸馏时做碱性反应的指示剂。无水硫酸钠2.5g，新版的资料变为6g，硫酸铜0.13g，新版的资料变为0.4g，但最早的资料用量更少，无水硫酸钠0.3g，10%硫酸铜溶液2ml。无水硫酸钠（2.5g）和硫酸铜（0.13g），磨细，按比例混合；浓硫酸；硼酸溶液（1％）；氢氧化钠溶液（40％或50％）；标准盐酸溶液（0.02mol/L，1.67ml浓盐酸加蒸馏水至1000ml）。硼酸溶液的体积要求不严格，也可以免用移液管量取；蒸馏所加碱量应比消化时所用的浓硫酸量多4倍，一般出现棕色为止，Cu离子在过量碱中的颜色；标准盐酸溶液滴定时三角瓶中溶液变色应是蓝色变为瓦灰色；蒸馏时3分钟后冷凝管口离开液面，目的是管口里面的液体在1分钟内流入三角瓶中，冷凝管口外壁再用蒸馏水冲洗；浓硫酸的量（1g糖、蛋白质、脂肪各消耗浓硫酸7.3g、8.1g、17.8g）；消化时若消煮管壁上有黑渣，待冷却后用少量蒸馏水冲洗再继续加热，如果仍不能完全消化，则待冷却后，再加入少量浓硫酸，继续加热，直至消煮管中溶液澄清，消化才完毕；蒸馏装置中，加入氢氧化钠溶液后，如果反应室中溶液的颜色没有变成棕色，可能的原因是：①消化时加入的浓硫酸量过大；②加入的催化剂硫酸铜不够，或硫酸铜和无水硫酸钠的比例不合适，应补滴硫酸铜溶液数滴；粗蛋白质含量在25％以上时，允许相对偏差为1％；粗蛋白质含量在10％～25％时，允许相对偏差为2％；粗蛋白质含量在10％以下时，允许相对偏差为3％。指示剂：溴甲酚绿+甲基红酒红色(酸色)绿色(碱色)pH=5.1时，甲基红、橙色、溴甲酚绿两者混合互补呈浅灰色， 溴甲酚绿 4.0绿 5.6蓝 甲基红 4.4橙 6.2黄 混合指示剂 酒红 5.1浅灰 绿四、饲料粗脂肪测定原理：乙醚等有机溶剂可以溶解脂肪。饲料样品中的脂肪、有机酸、磷脂、脂溶性维生素、叶绿素等脂溶性物质经浸提溶于乙醚后再分离，测得粗脂肪。方法：索氏浸提法（脂肪瓶增重法和脂肪包减重法）步骤：浸提管和脂肪瓶均洗净，烘干，脂肪瓶恒重，浸提装置准备好。将脱水样品包脂肪包，长度不超过虹吸管的高度，放入浸提管中，加入适量乙醚浸泡数小时；然后再加乙醚（超过虹吸管高度，使之能回流到脂肪瓶中），在60~75℃的水浴条件下浸提（开冷凝水，回流8～10/小时左右），直到浸提干净（当浸提管中的乙醚流入脂肪瓶时，用干净表面皿接最后一滴乙醚，等乙醚挥发完没有痕迹）；取出样品包，让乙醚空回流一次，然后回收乙醚；最后取下脂肪瓶，外壁用蒸馏水冲洗并用滤纸擦拭干净，烘至恒重（±0.002g，先4h，然后1h）。注意：①测定脂肪的样品必须充分磨碎和烘干，因为颗粒大时，溶剂不易穿透；水分不烘干时，影响乙醚的沸点；②1小时回流6～8次，总回流次数不能少于36次；③乙醚的沸点是35℃，易燃烧，在提取时注意防止着火；④包脂肪包时应将手洗净；⑤如果用含水的乙醚，则可能将样品中的糖和无机物抽提出，造成误差；⑥处理无水乙醚的方法是，采用工业用无水硫酸钠或无水石膏50g，放入1L工业乙醚内摇荡数次，静置过夜，蒸出沸点低于35℃的蒸馏液即可应用。工业乙醚的价格是化学纯乙醚价格的一半以上；⑦用索氏浸提法所测得的脂肪为游离脂肪，用酸水解法测得的脂肪为总脂肪，即游离脂肪和结合脂肪。一般谷物类和蔬菜类用索氏浸提法，加工食品用酸水解法。粗脂肪含量在10％以上（含10％）时，允许相对偏差为3％；粗脂肪含量在10％以下时，允许相对偏差为5％。五、饲料粗纤维测定原理：用一定浓度的酸、碱，在一定的时间内，对脱脂样品进行处理，再用乙醇进行处理，这样将样品中非纤维类有机物除去，剩余物质经灼烧失重则为粗纤维。步骤：将高脚烧杯、250ml量筒、布氏漏斗、古氏坩埚、滤布、玻璃棒、牛角勺、表面皿等洗净，烘干（或晾干），备用。同时准备洗瓶、电炉等，将酸、碱和蒸馏水煮沸；将脱脂样品无损失的转移到高脚烧杯中，加入200ml煮沸的0.1275mol/L硫酸溶液，记录时间，1分钟内煮沸（电炉上），然后转移到电热板上，保持微沸30分钟；取下高脚烧杯，过滤，用热的蒸馏水洗涤，直至中性（用蓝色石蕊试纸检查不变红色）；将滤布上的残渣无损失的转移到高脚烧杯中，加入200ml煮沸的0.313mol/L的氢氧化钠溶液（如果滤布上有残渣时，可以用氢氧化钠溶液冲洗直至干净）；1分钟内煮沸（电炉上），然后转移到电热板上，保持微沸30分钟；取下高脚烧杯，过滤，用热的蒸馏水洗涤，直至中性（用红色石蕊试纸检查不变蓝色）；将滤布上的残渣无损的转移到已经铺好石棉的古氏坩埚中，浸满95％的乙醇，浸泡3~5分钟，抽滤干；将古氏坩埚在105℃的烘箱内烘干至恒重；再碳化、灰化，至恒重。注意：在强制条件下进行，包括酸碱的浓度、温度、时间，尤其强调加入酸和碱后在1分钟内煮沸；粗纤维含量在10％以上（含10％）时，允许相对偏差为4％；粗纤维含量在10％以下时，允许相差（绝对值）为0.4。六、饲料无氮浸出物计算（略）七、饲料钙测定原理：样品经灰化或消化分解掉有机物，灰分用强酸（硝酸、1：3的盐酸）溶解，钙以离子的形式存在，然后用过量草酸铵沉淀其中的钙，使其转化为草酸钙，再用稀氨水洗涤沉淀，用过量硫酸溶液溶解沉淀，是草酸钙中的草酸根以草酸的形式存在与溶液中，用高锰酸钾标准溶液滴定，过量高锰酸钾溶液指示终点。试剂：浓硝酸；盐酸（1：3）；氨水（1：1）、氨水（1：50）；硫酸（1：3）；草酸铵溶液（4.2％）；标准高锰酸钾溶液（0.05mol/L）。步骤：灰化液的制备：灰分好的坩埚中，用少量水浸湿灰分，再加入几滴浓硝酸，再用1：3的盐酸溶液40ml加热溶灰于100ml容量瓶中，定容，同时应做空白；钙离子的沉淀：准确吸取20ml～25ml灰化液加入已经洗净的500ml烧杯中（灰化液取量应根据样品中含钙量而异，如玉米等低钙饲料取量应在50mL，而磷酸氢钙、石灰石粉等取10mL即可），加入2滴甲基红指示剂，然后滴加1：1氨水直至溶液颜色变为橙色，再滴加1：3盐酸使溶液复红（pH值为2.5～3.0），加50~150ml蒸馏水。将烧杯放在电炉上煮沸，加入10ml热的4.2％草酸铵溶液（注意速度，先慢加，过半后稍微快些），继续煮沸3分钟（如果溶液颜色变为橙色，补加1：3盐酸使溶液复红），静置12小时以上(过夜)；沉淀的洗涤与处理：过滤沉淀，然后用1：50的氨水洗涤沉淀直至无草酸根离子（检查方法：用洗净试管从漏斗下端接取滤液3ml～4ml，加入1：3硫酸2滴，加热至75℃～80℃，再加入0.05mol/L高锰酸钾溶液1滴，溶液在半分钟内不褪色为好），然后加10ml热的硫酸（1：3）于滤纸上，使其与草酸钙充分反应生成草酸存在于溶液中。滴定：用约0.05mol/L的高锰酸钾标准溶液在80℃的条件下滴定，终点为烧杯中溶液的颜色变为粉红色且半分钟不褪色为好，记录高锰酸钾的用量，计算。注意：滴定时将滤纸捅破，加入10ml热的1：3硫酸溶液将沉淀冲到烧杯中，将滤纸转移到烧杯中（贴附在烧杯壁上），用50ml蒸馏水冲洗漏斗至烧杯中。将烧杯放在电炉上加热至75℃～80℃，用0.05mol/L的高锰酸钾溶液滴定，至溶液颜色变为粉红色后将滤纸放入溶液中，再滴加几滴高锰酸钾溶液，直至溶液颜色变为粉红色且半分钟不褪色。如果直接把滤纸放入溶液中时，因滤纸的影响，使高锰酸钾溶液的用量增加，尤其滤纸搅碎后，影响更大。含钙量在5％以上时，允许相对偏差为3％；含钙量在5％～1％时，允许相对偏差为5％；含钙量在1％以下时，允许相对偏差为10％。八、饲料总磷测定（与钙套做）原理：有机物灼烧后，在酸性溶液中，钼酸铵—偏钒酸铵与P生成黄色物质钼酸铵—偏钒酸铵—磷酸复合物，其颜色的深浅与样品中磷的含量成正比，根据标准曲线和通过比色测定样品的磷含量。试剂：钼酸铵—偏钒酸铵试剂：将25g化学纯钼酸铵和1.25g化学纯偏钒酸铵加入到300ml蒸馏水中，加热溶解，冷却转移至500ml容量瓶中，定容。如果浑浊，则需要过滤；5mol/L盐酸溶液：根据盐酸的纯度、摩尔质量等计算，通常将215ml浓盐酸稀释至500ml。标准磷溶液溶液（50ug/ml）：将磷酸二氢钾（优级纯）在105℃烘1小时，干燥器中冷却30分钟，准确称取0.2195g，溶解于蒸馏水中，定量转入1000mL容量瓶中。直接配制，不需标定。步骤：样品的灰化和溶灰同钙的测定（略）。准确吸取1ml～2ml灰化液加入50ml容量瓶中，加入5ml5mol/L的盐酸溶液和5ml钼酸铵—偏钒酸铵溶液，用蒸馏水定容，静置30分钟后在723分光光度计420nm处比色，用空白调零。标准曲线的制作：吸取0、2、4、6、8、10mL的标准磷溶液（50ug/mL），置于50ml容量瓶中，加入5ml5mol/L的盐酸溶液和5ml钼酸铵—偏钒酸铵溶液，用蒸馏水定容，静置30分钟后在723分光光度计420nm处比色，用该数据制作磷标准曲线。根据样品测定的光密度值在标准曲线上查磷浓度，计算样品中的磷含量。注意：含磷量在0.5％以上时，允许相对偏差为3％；含磷量在0.5％以下时，允许相对偏差为10％。半干（风干）样品干物质吸附水100～105℃半干（风干）样品粗灰分有机物550～600℃_1120243593.unknown