生物大分子分离纯化技术 之疏水作用层析（19页）

疏水作用层析一概述二原理三介质四影响因素五实验方法一、概述疏水作用层析(hydrophobicinteractionchromatography)是利用蛋白质在非变性状态下与非极性物质的非特异性亲和力来分离纯化蛋白质的一种层析技术。此法较适合分离盐析后或高盐洗脱下来的物质。疏水作用层析的优点是与蛋白质结合容量高(10-100mg/ml)，且具有温和的洗脱条件。二、基本原理疏水作用(疏水力)是浸在一种极性液体(如水)中的非极性物质为避开水而被迫相聚的自然趋势。蛋白质分子中有许多非极性的氨基酸，如色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等。暴露于球形蛋白质面的非极性氨基酸侧链可以密集在一起形成疏水区域。疏水作用层析是以介质疏水基团和蛋白质表面疏水区域的亲和作用为基础，利用在载体的表面偶联疏水性基团为固定相，根据这些疏水性基团与蛋白质分子疏水区之间相互作用的差别，对蛋白质类生物大分子进行分离纯化。三、介质在疏水层析中，介质(又称吸附剂)一般由载体(基质)和配体(疏水性基团)两部分构成。其中基质有亲水性和非亲水性之分，而配体为大小不等的疏水侧链(烷基或芳香基)，它们对疏水性物质有一定的吸附力。四、影响疏水性吸附的因素1.配体的类型疏水性吸附剂的吸附作用与配体的密度成正比，配体密度过小则疏水作用不足，但密度过大则洗脱困难。增加碳氢链长度，其疏水性增强，(例如苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏水性低)，只有少数疏水性强的蛋白质可被吸附，但由于疏水作用太强，需用极端方法洗脱，可能导致蛋白质变性。2.基质的类型（1）亲水性基质其基质为交联琼脂糖(SepharoseCL-4B)，配体是苯基或辛基化合物。这类吸附剂不耐高压，一般只适用于常压层析系统。（2）非亲水性基质其基质有硅胶和树脂等，配体为苯基、辛基和烷基。这类吸附剂耐高压，机械性能好，特别适用于高压层析及常压层析。3.盐的种类和浓度蛋白质的疏水性吸附作用可因离子强度的增大而提高，随着盐浓度的增高，结合蛋白质的容量也不断增大，而且接近正比关系。但若盐的浓度过大则引起蛋白质的沉淀，使结合容量下降。通常在分离过程中主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等盐溶液为流动相。4.pH值的影响一般来讲，增加pH会减弱疏水吸附作用，反之会增加疏水吸附作用。因此在中性pH值条件下不吸附的蛋白质可以在酸性条件下发生吸附。当pH>8.5或pH<5时，其对疏水作用有极大的影响。5.温度的影响操作环境的温度十分重要，从25℃降低至4℃，其疏水作用强度也将随之降低20%-30%，因此，不能在冷室进行疏水作用层析。温度对于疏水作用的影响因不同的物质而不同，因此在操作时应注意保持温度的一致性。五、实验方法1.胶的溶涨用缓冲液或去离子水将凝胶清洗，去除其中的有机溶剂。2.装柱疏水层析使用短而粗的层析柱，一般高度为5-15cm，而柱的直径则由样品量决定。3.平衡用3-5倍柱床体积的起始缓冲液冲洗、平衡柱床。4.加样上样总量一般在200-500mg。因疏水作用层析的操作在高盐条件下进行，因此，在加样前不需特殊处理，只要加入适当的盐并调整好pH值。但若样品中有盐酸胍和尿素类物质时则应去除，以防影响吸附。5.洗脱疏水层析的洗脱过程是一个不断降低盐浓度的过程，可选用线性梯度或阶梯式梯度逐渐降低盐浓度，使不同的蛋白质在不同的盐浓度下洗脱出来而达到分离的目的。下面介绍几种常用的洗脱方法。（1）负盐梯度洗脱用负盐梯度缓冲液，逐渐降低流动相离子强度，是最主要的洗脱方式，梯度洗脱能改善分辨率。（2）改变pH洗脱蛋白质在等电点时具有最大的疏水性，溶液的pH远离等电点时该蛋白质的疏水结合力降低。（3）降低温度降低温度疏水作用强度也将随之降低（4）替代洗脱方法可用正梯度洗脱液加去污剂或降低极性的有机溶剂(一般是乙烯基乙二醇，浓度可达75%)进行洗脱。6.柱的再生（1）洗脱后可依次用5倍体积水、5倍体积1mol/LNaCl加5倍体积水进行在位清洗使其获得再生。（2）也可用6mol/L尿素洗涤凝胶柱，以除去紧密结合的蛋白质，再经初始缓冲液平衡后，可重复使用。7.柱的保存胶内加0.02%硫柳汞可于4℃长期保存。