磁珠分选原理及应用ppt课件

1/1MD0xxx.01MiltenyiBiotec:免疫磁珠分选技术及应用MD0197.02内容•MACS技术原理•MACS技术设备及分选策略•几种特殊的MACS分选分选和分析DC细胞分选各种T细胞分选和分析细胞因子分泌细胞分选造血干细胞分选人类肿瘤细胞分选和分析凋亡和死亡细胞分选转染细胞分子生物学和蛋白生化的分选MD0347.01MACS技术原理MACS(MagneticActivatedCellSorting)：=免疫学+细胞生物学+磁力学基于抗体对抗原的特异性识别磁性微珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞相连在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的MD0651.01MACS®磁性分选MACS微珠进行磁性标记未标记的细胞先行流出洗脱阳性分选的细胞MD0197.02分选前标本制备：过滤MACS预选滤器：30mMD0197.02MACS技术设备与试剂»MACS微珠»MACS分选柱»MACS分选器»详细分选*MACS技术设备与试剂MACS微珠：MACS微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，可用于目的细胞的磁性标记。特性：50nm大小对细胞没有毒性可生物降解不影响细胞特性MD0057.03MACS技术分选的CD8+T细胞微珠MACS微珠直标微珠多选微珠间标微珠MACS技术设备与试剂MACS分选柱：》填充有不同规格的铁珠。》铁珠面有亲水包被，不损伤细胞。》无菌包装。》可用于分选多种细胞及亚细胞物质、细菌、病毒、mRNA和蛋白质。专利产品将磁场扩大1000－10000倍——高纯度，高回收率MD0061.02在MS柱中产生的强大磁场MACS技术设备与试剂MACS分选柱：MACS技术设备与试剂MACS分选器：从手动到自动，从实验室到临床MACS技术设备与试剂MACS分选器autoMACS分选仪9种程序，一机完成所有细胞分选成本低，两个可重复使用的分选柱（2周内100次）快速（3－10分钟）重复性好全自动分选，仪器操作简单适用范围广：从少量标本（105）到大量标本（4X109），进样量0.5ml-50ml8种全血微珠，可以做常见细胞的全血分选，省去了费时的提取单个核细胞过程MACS技术主要优势•小磁珠:50nm（快速、不活化细胞、不沉淀）•保留细胞功能（直接进行后续实验；无毒性；氧化铁和多聚糖组成，可生物降解）•与流式细胞仪兼容（不影响细胞光学特性、不影响荧光抗体标记、与流式细胞仪分选联合使用可以缩短流式分选时间）•快速、简便、无菌•适用范围广（磁珠种类多、从少量到大量、适用于分选各种细胞、亚细胞物质）MD0043.02MACS®细胞分选策略•阳性分选•去除分选•去除分选后再阳性分选•多重分选MD0044.02MACS细胞分选策略1、阳性分选：•根据特异性标志分选细胞:阳性分选是指目的细胞磁性标记后，作为阳性的标记组分直接分选出来。 •优点：   》高纯度，尤其是富集稀有的细胞》高回收率》操作简便、迅速MD0044.02MD016102阳性分选策略MACS®微珠磁性标记未标记细胞先行流出将分选柱移出磁场，洗脱阳性分选细胞MACS细胞分选策略2、去除分选：•去除分选是磁性标记非目的细胞，并将其从细胞混合物中去除，即未磁性标记的细胞为目的细胞。 •去除分选策略适用范围：》去除不需要的细胞》缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞）》不需要抗体和目的细胞结合》需进一步通过阳性选择分选细胞亚群MD0044.02MD0160.02去除分选磁性标记分选未磁性标记细胞MACS细胞分选策略3、去除分选后再阳性分选：•即先去除非目的细胞，再进行阳性分选。 •适用范围：》非目的细胞也表达用来阳性选择目的细胞的抗原。》要分选非常稀有细胞，先去除非目的细胞再行阳性分选，可获得高纯度的目的细胞。MD0044.021.去除非CD4+T细胞。用生物素化抗体混合物和抗生物素微珠间接磁性标记非CD4+T细胞磁性分选去除标记细胞先行流出为CD4+T细胞2.CD25微珠直接磁性标记CD25+细胞阳性分选靶细胞CD4+CD25+调节性T滞留在分选柱上，离开磁场后洗脱下来去除后再阳性分选CD4+CD25+双阳性细胞MD0652.01多选微珠标记MACS分选磁性颗粒的酶解离终止解离反应根据第二标志进行磁珠标记MACS分选MACS细胞分选策略4、多选微珠：MACS畅销机器与分选柱•MiniMACSstartingkit：1个分选架、1个MiniMACS分选器、1盒MS分选柱、1支价值7500元试剂（15088元）：可做阳性分选、小量标本、间标去除分选、分子生物学分选•Mini&MidiMACSstartingkit：1个分选架、1个MiniMACS分选器、1个MidiMACS分选器、1盒MS分选柱、1盒LS/LD分选柱、1支价值7500元试剂（27838元）：可做阳性分选和去除分选•MS分选柱：1盒25个，2763元•LS分选柱：1盒25个，4356元•LD分选柱：1盒25个，5100元•uMACS与u或者M分选柱：分子生物学分选•VarioMACS分选仪•autoMACS自动分选仪、CliniMACS分选仪MD0044.02MACS几种畅销磁珠与抗体•专利产品：CD133、CD303、CD304•特殊产品：人类DC系列：BDCA-1(CD1c)、BDCA-2(CD303)、BDCA-3(CD141)、BDCA-4(CD304)小鼠DC系列：mPDCA微珠与抗体干细胞产品：CD133、CD271微珠与抗体细胞因子分泌细胞：CSA分选与分析TH2细胞：CD294(CRTH)微珠与抗体分选人类肿瘤细胞：上皮肿瘤：CK、HEA非血液肿瘤：CD45去除死亡细胞去除试剂盒分选转染细胞分选HIV病毒、mRNA、cDNA•topten：CD133、CD34、人CD4+CD25+、小鼠CD4+CD25+CD303/CD304、人类NK、小鼠CD11c、anti-PE微珠小鼠干细胞试剂盒（系别阴性＋CD117）、CD4/CD8MD0044.02主要竞争对手分析Dynal：大磁珠主要市场：CD4、CD8等高频细胞，优势：价格劣势：回收率低（不能做低频细胞、弱表达细胞分选）磁珠必需剪切（耗时——细胞状态不佳）大磁珠（活化细胞）我们的优势：纯度高、回收率高、细胞活性好不活化细胞，不改变细胞功能省时、省细胞产品品种最多，有专利产品有手动、自动、临床级产品有强大的技术支持队伍很好的声誉，市场占有率最高MD0044.02主要卖点干细胞产品：人类：CD133、CD34、MSC试剂盒（CD271）小鼠：系别阴性试剂盒、CD117微珠定向分化培养基DC产品：人类：BDCA-1、BDCA-2/4小鼠：CD11cNK产品：人类：NK细胞阴选试剂盒、CD3/CD56T细胞产品：CD4+CD25+调节性T细胞（人和小鼠）CSA系列CD4、CD8微珠及阴选试剂盒B细胞产品：CD19微珠及阴选试剂盒肿瘤细胞分选：癌细胞富集试剂盒、HEA微珠、CD45阴选单核细胞分选：CD14微珠及阴选试剂盒间标微珠死细胞去除试剂盒预选滤器、FCR阻断剂、T细胞活化与扩增试剂盒流式细胞仪抗体（价廉、包装量大、优质）MD0044.02识别DC和DC亚群NewLineage-(CD3,CD14,CD16,CD19,CD20,CD56)HLA-DR+PDCCD11c-CD123+BDCA-2(CD303)+BDCA-4(CD304)+CD123lowCD123-CD11c+CD123low/-MDCMDC1MDC2BDCA-1(CD1c)+BDCA-3(CD141)++DC亚群特异性标志:BloodDendriticCellAntigensBDCA-2/4+BDCA-1+BDCA-3+CD11c+DCCD8+DCCD4+DCCD11c+B220+Gr-1(Ly-6C/G)+DCCD11c+B220-DCConventionalDC(“lymphoid“DC)(“myeloid“DC)CD11cCD8aCD11cCD4PEFITCAPCCD11cCD11cB220Gr-1PlasmacytoidDC(PDC)mPDCA-1MACS®技术分选与分析小鼠DC细胞NewMACS®技术分选与分析大鼠DC细胞NewMD0044.02Anti-DC(OX62)微珠用于从大鼠外周血、淋巴和非淋巴组织中分选或者去除OX62+DC。单克隆抗体OX62识别表达于大部分大鼠DC上的整合素αE2亚单位（分子量150kDa）。两个主要的树突状细胞亚群：CD4/OX41双阳性和CD4/OX41双阴性亚群。该抗原也表达于表皮TCRα/β+或γ/δ+的T细胞亚群和垂体前叶星状滤泡样（S100+）细胞的一个亚群，但在朗格罕氏细胞和巨噬细胞上不表达。MACS®技术分选与分析功能性T细胞MD0044.02MD0420.02MACS®细胞因子分泌细胞分析与分选New抗原特异性再刺激细胞因子分泌阶段捕获试剂标记荧光标记和磁性分选••••CatchReagentDetectionAntibodyAnti-PEMicroBeadscytokinesecretingcellsecretedcytokineMD0420.02MACS®细胞因子分泌细胞分析与分选New分选前刺激组分选后未刺激组*百分比均为占CD4＋细胞百分比MD0420.02MACS®细胞因子分泌细胞分析New刺激组未刺激组                                                                                                                                                                                                                                                                                                         使用PE-CMVpp65/HLA/A2-tetramers和IFN-gSecretionAssay-DetectionKit(APC)orIL-2SecretionAssay-DetectionKit(APC)检测HLA/A2CMV+患者PBMC。*百分比均为占CD8＋细胞百分比MACS®细胞因子分泌细胞分析与分选New人类细胞因子分泌细胞分选与检测试剂盒IFN-g分泌细胞IL-2分泌细胞IL-4分泌细胞IL-10分泌细胞TNF-分泌细胞小鼠细胞因子分泌细胞分选与检测试剂盒IFN-g分泌细胞IL-2分泌细胞IL-4分泌细胞IL-5分泌细胞IL-10分泌细胞人类干细胞分选微珠与试剂盒•CD34微珠及多选微珠：用于从骨髓、外周血、脐带血中分选造血干细胞、内皮前体细胞•CD133微珠：用于从骨髓、外周血、脐带血中分选造血干细胞、内皮前体细胞、多能成体干细胞（MAPC）•CD117微珠：用于从骨髓、外周血、脐带血中分选造血干细胞、骨髓间充质细胞•CD45/GlyA去除分选试剂盒：用于从骨髓中阴选分选多能成体干细胞（MAPC）•CD105微珠：用于从骨髓中分选间充质细胞•抗成纤维细胞微珠：用于从骨髓中分选间充质细胞多能成体干细胞（MAPC）•MSC分选工具（CD271）new：用于从骨髓中分选间充质细胞MD0044.02MSCResearchToolBox-CD271(LNGFR)new成分:分选:CD271(LNGFR)-APCAnti-APCMicroBeadsFcRBlocking培养:NHExpansionMedium(2x500mL)CytoMix-CD271(LNGFR)质量控制:NHAdipoDiffMedium(12x8mL)NHOsteoDiffMedium(12x5mL)IntroductoryofferAdsinBlood(April&Mai)MSCResearchToolBox-CD271(LNGFR)人类MSC的化研究CD271又叫做低亲和力神经生长因子受体(LNGFR),是迄今为止发现的最佳MSC分选标志，可用于直接从人类骨髓中分选MSC。分选后CD271(LNGFR)+MSCs是一群均一的MSC细胞群，而CD271阴性细胞成分中没有成纤维细胞克隆形成单位(CFU-F)活性。与贴壁培养的MSC相比，CD271分选的MSC增殖能力增强10－1000倍。CD271分选和扩增的MSC保留了多系分化潜能，具有分化为脂肪细胞和成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞的可塑性。cumulativepopulationdoubling(CPD)AdsinBlood(April&Mai)MSCResearchToolBox-CD271(LNGFR)人类MSC的标准化研究NadiaQuirici等，ExperimentalHematology30(2002)783–791MACS小鼠干细胞分选试剂盒：LineageCellDepletionKit:去除成熟和分化的造血细胞，预富集造血干祖细胞。CD117MicroBeads：分选早期和晚期干祖细胞。Anti-Sca-1MicroBeads：分选造血干细胞和早期造血祖细胞。CD117+Sca-1+lin–细胞也有非造血分化潜能，如分化为肌细胞、内皮细胞、肝细胞、神经系统细胞。CD45/Ter119微珠去除分选骨髓细胞，可以得到MAPCs,也有体外分化为多种细胞的潜能。小鼠骨髓造血干细胞(HSC)定义为Sca-1+、CD117+(c-kit)、Thy-1low和lin-细胞.MACS®技术分选人类肿瘤细胞NewMD0044.02上皮肿瘤细胞根据表面抗原进行分选与分析：Anti-HEA(EpCAM)MicroBeadsAnti-ErbB-2(HER-2/neu)MicroBeads根据细胞内细胞角蛋白分选与分析：cytokeratin黑色素瘤细胞分选：Anti-melanomaMicroBeads其它非造血系统肿瘤细胞:CD45MicroBeads去除白细胞骨髓瘤细胞：CD138MicroBeads霍奇金氏淋巴瘤/RS细胞：CD30MicroBeadsMACS®技术分选凋亡细胞NewMD0044.02刺激、分化、凋亡、脱颗粒、坏死PS暴露PS暴露细胞被AnnexinV微珠磁性标记磁性标记细胞滞留在分选柱上PS暴露细胞被洗脱下来MACS®技术分选转染细胞NewMD0044.02应用于功能基因、信号转导研究、药物筛选和标记技术。MACSelect4转染细胞分选试剂盒使用pMACS4.1和自己的质粒转染细胞用MACSelect4微珠标记转染细胞MACS分选转染细胞分选后细胞可用于培养或者分析MACS®技术分选转染细胞NewMD0044.02优点：省时：只需2-3小时（建立一个稳定的细胞系需数周） 纯度高，背景低 不影响转染细胞功能和活力 分选的细胞可直接用于培养或功能检测可用于：原代细胞&细胞系贴壁&悬浮细胞稳定&短暂转染MACS®分子生物学和蛋白生化的分选•表位蛋白分选：µMACS抗His-,HA-,c-myc-,GFP-,GST-蛋白分选.•生物素化分子及其靶位分选：µMACS链霉亲和素微珠•µMACS免疫沉淀：µMACS蛋白A、蛋白G微珠•mRNA分选：从细胞、组织、外周血、总RNA中分选mRNA一步法cDNA合成newMD0044.02MACS®分子生物学和蛋白生化的分选优点：•分选柱上固定：高纯度利于灵敏的后续实验作用温和，可获得理想的分子复合物分选柱上分子修饰，可以减少细胞损失•MACS微珠：敏感，可用于极少量的目的分子快速：分选mRNA仅需15分钟免疫沉淀只需1-2小时一步法cDNA合成仅需90分钟MD0044.02MiltenyiBiotecGmbH(headquarter)