柴胡疏肝散对肝气郁结证大鼠尿液代谢组学的影响

do:i 10�3969 / j� issn�1005�0264�2010�05�014 柴胡疏肝散对肝气郁结证大鼠尿液代谢组学的影响 陈 � 斌 � 王伟明 � 黄育华 � 湖北省中医院 (湖北 武汉, 430061) � � 摘 � 要 � 目的: 观察柴胡疏肝散对肝气郁结证模型大鼠尿液代谢组学的影响。方法: 30只 SD大鼠随机分为 3 组: 正常组 10只 ( A组 )、模型组 10只 ( B组 ) 和给药组 10只 ( C组 )。采用夹尾法建立肝气郁结证大鼠模型, 收 集实验前后的大鼠尿液, 通过核磁共振波谱仪检测, 观察与分析各组大鼠尿液代谢组学的差异性变化。结果: 与正常 组相比, 模型组尿液马尿酸、��酮戊二酸、柠檬酸、异柠檬酸和乌头酸的含量降低, 肌酸酐、丙酮、乙酸、肌酸、烟 酸和 5�羟基吲哚�3�乙酸的含量显著升高。给予柴胡疏肝散灌胃干预后, 给药组大鼠尿液肌酸、丙酮、肌酸酐等含量 明显下降, N�氧化三甲胺、氧化三甲胺 ( TMAO)、牛磺酸等含量明显增高, 其尿液代谢表型有向正常范围回归的趋 势, 呈现代谢网络修复的结果。结论: 肝气郁结证大鼠的尿液代谢组学出现变化, 柴胡疏肝散能够部分调控平抑肝气 郁结证中发生异常的代谢产物, 促使代谢表型向正常范围回归, 对肝气郁结证大鼠代谢紊乱有一定的恢复作用。 关键词 � 肝气郁结证; 代谢组学; 柴胡疏肝散 /药理作用 Effects of Caihusugan powder on urine m etabonom ics in m odel rats of stag� nation w ith liver�Q i syndrom e CHEN B IN , WANG WEI�MING, H UANG YU�HUA�H ubeiH osp ital of TCM (Wuhan Hubei, 430061) China Abstrac t� Objective: To study the e ffects o f C aihusugan powder on urine m etabonom ics in m ode l rats w ith stagnation o f liver�Q i syndrom e�Methods: Thirty SD rats w ere random ly div ided into three g roups: G roup A: norm a l g roup; G roup B: m od� e l g roup; G roup C: m edic ine group�Except for group A, the o ther two groups werem ade intom ode l o f the stagnation of L iver�Q i syndrom e by pinching the ta i,l and the urine sam ples w ere co llected and w ere ana lysed by nuc lcarm agne tic resonance ( NMR) spectrom eter ex am ination be fo re and after expe rim en t�R esults: Com pa ring w ith the no rm al group, h ippuric acid con tent, a�Ke� tog lutarate, c itrate, isocitra te and acon ita te decreased in the model group�Creatin ine, acetone, acetic ac id, rea tine, n ico ti� nate and 5�hydroxy indo le�3�aceta te acid inc reased in the m ode l g roup� In the group C, C aihusugan pow de r cou ld downregu la te rea tine, acetone, crea tinine, and upregulate N�TMAO, TMAO, aur ine, andm ake it incline to the no rm al state�Conclusion: There are theM e tabonom ics changes in rats o f stagna tion o f liver�Q i syndrome, and Ca ihusugan powder can regu la te the disturb� ance and m ake it inc line to the norm a l sta te� K eyW ords� stagna tion o f liver�Q i syndrome; m etabonom ics; Ca ihusugan powder /pharm aco log ica l effect � � 肝气郁结证是中医临床常见病证, 数十年来, 中医对肝 气郁结证本质的研究从未间断过, 其生物学基础一直是研究 的热点, 但均未能从整体上对肝气郁结证进行研究。我们运 用代谢组学技术, 从整体上研究肝气郁结证模型大鼠尿液代 谢组学变化及柴胡疏肝散对它们的影响。 1� 材料与方法 1� 1� 实验动物及分组 � 30只 SD大鼠, 由华中科技大学动物 实验中心提供, 清洁级, 雄性, 体重为 ( 220 28) g, 自由 饮水进食。 30只大鼠随机分为 3组: 正常组 10只 ( A组 )、 模型组 10只 ( B组 ) 和给药组 10只 ( C组 ), 正常组和模型 组大鼠每天按 10m l/kg生理盐水灌胃, 给药组大鼠每天按 10m l/kg柴胡疏肝散水煎液灌胃。 1� 2� 试剂与仪器 � 重水 ( D2O) 由中国科学院物理与数学研 究所进口分装, 三甲基硅烷基丙酸 ( TSP ) 为加拿大默克公司 � � 通讯作者, E�m ai:l hyh6568@ 126� com !297!中西医结合肝病杂志 2010年第 20卷第 5期 产品; K2H PO4, N aH2PO 4, N a2H PO4, 叠氮钠为上海生工生 物工程有限公司产品; AVANCE400M型超导傅立叶变换核磁 共振波谱仪 ( NMR) 为德国布鲁克公司产品。离心机为德国 Eppendorf M inispinP IUS产品; 低速台式离心机 TDZ4B�WS为 赛特湘离心机仪器公司产品; 数控超声波清洗器 KQ�100DV 为昆山超声仪器有限公司产品; 液氮罐 YDS (扬州广陵化玻 公司 ) , 移液器 (德国 Eppendorf) , 5mm核磁管 (美国 BD公 司 ) , 电子天平 DT500 (常熟市百灵天平仪器有限公司 )。 1� 3� 模型制作 � 造模方法参照须惠仁等 [1]的方法建立, 模型 组与给药组大鼠分别置于同笼, 用纱布包裹尖端的止血钳夹 鼠尾巴, 因为疼痛, 与其他大鼠撕打会很快激怒全笼的大鼠。 夹尾每次刺激 30分钟, 每隔 3小时 1次, 每天刺激 4次, 每 天轮换刺激不同大鼠 , 激怒刺激 10天后进行实验指标检测。 1� 4� 尿液标本收集处理 [2] � 分别于造模开始前 1天和第 10 天用代谢笼收集 24小时尿液。分别收集正常组、模型组、给 药组大鼠尿液标本 3m ,l 室温下, 存于接尿管 (内加 500� l浓 度为 1mm ol/L叠氮钠 ) 中, 接尿管置于冰中保持低温, 新鲜 尿液离心温度 20∀ , 7 000 rpm, 离心 10分钟, 去除固体杂 质。用 EP管收集上层 2m l尿液, 离心后分装置于 - 76∀ 冰箱 保存备用。 1� 5� 实验前样品配制 [3]及尿液预处理 � 尿液标本常温解冻 后, 从每份尿液向编号后的离心管中分别依次加入 400� l尿 液, 加 入 188� l 磷 酸 盐 /D2Obuffer ( 0� 2m l )、 Na2HPO4 ( 0�0116g)、N aH2PO4 ( 0�0012g )、TSP ( 0� 0001g ), pH 7�4, 并加 TSP 10� l为内标 ( MTSP = 1 # 10- 3mo l/L ) 配成待测溶 液。充分震荡混匀后, 样品静置 10分钟再于 4∀ 、 13 000rpm 低温离心 10分钟, 取上层清液 550� l置于 5mm核磁管中, 准 备进行 AVANCE400M型超导傅立叶变换 NMR测试。 1� 6� NMR数据采集及数据分析 � 在超导傅立叶变换 NMR上 调用相关 NOESY谱脉冲序列, 设置参数, 然后进行采样, 得 到自由感应衰减 ( F ID ) 信号。设置主要参数: 预饱和方式抑 制水峰, 预饱和时间 ( satdly) 为 2秒, 预饱和功率 ( satpw r) 为 2, 扫描谱宽 ( swh ) 为 9615H z, 采样数据点数 ( np) 为 65536 ( 64k) , 累加次数 ( ns) 为 128, 然后开始采样, 得到 F ID信号。 谱图处理: 将得到的 F ID信号通过 32k傅立叶变换及校 正相位和基线等转换为 1H�NMR谱, 得到 3组大鼠在造模前 1 天、第 10天不同时间点的尿液代谢产物 1H �NMR谱图。分段 积分: 以 TSP为化学位移参考峰的位置, 设为 0ppm, 调用 NMR中的程序将 1H 谱按默认值, 从 9� 5m到 0�05m, 每段为 0� 04ppm, 进行分段积分。为了避开水峰对谱图造成的影响, 水峰附近的区域 ( 4� 2~ 5� 2) 将被去除, 最后将积分数据按 样品编号、时间编号用 Excel文件储存, 以便进行 NMR数据 数字化处理。将积分数据归一化后, 保存, 以备主成分分析 ( prine ipal com ponents ana ly sis, PCA ) 时使用。 1� 7� 统计学方法 � 主成分分析法 ( PCA ) 分析。将积分值进 行中心化和比例换算, 用 SIMCA�P 10�0 软件包 (瑞典, Um etr ics AB, Um ea) 进行多变量统计学分析, 用 PCA求出主 成分 ( pr incipa l com po�nen ts, PC ) [4] , 利用 PC对各组大鼠尿 液的代谢组分进行分析。 2� 结果 2� 1� 大鼠行为学观察 � 模型组大鼠毛发稀松, 行动迟缓, 活 动量减少, 不活泼, 大便次数增多, 色浅、松散而特臭, 性 情烦躁, 容易激惹, 叫声尖细, 胡须凌乱; 而正常组大鼠毛 发光泽, 行动快捷, 饮食、大便均正常。 2� 2� 1H�NMR谱分析 � 图 1为 3组大鼠尿液典型的 1H �NMR 谱, 可以看出正常组与模型组之间 1H�NMR谱有明显差别, 说明造模后大鼠的内源性代谢谱发生了明显的变化, 模型组 与给药组之间 1H �NMR谱有明显差别, 说明经给药后大鼠的 尿液代谢谱发生了变化, 可以初步判断大鼠给药前后尿液组 成的成分和比例上有明显的变化。 2� 3� NMR图谱模式识别主成分分析 � 对 1H�NMR谱峰积分 值进行 PCA分析后, 得到 PCA得分图。正常组与模型组 PCA 有明显区别, 可见标本的 PC积分值分别集中分布于椭圆形散 点图 ( 95%的置信区域内 ) 的 4个区域中, 两组均能互相区 分开来, 并且互不重叠, 说明两组的代谢表型有差异 (图 2); 模型组与给药组区分明显 (图 3), 互不重叠; 正常组与 给药组没有显著差异 (图 4)。 图 1� 3组大鼠尿液典型的 1H �NMR谱 !298! 中西医结合肝病杂志 2010年第 20卷第 5期 � � 对 1H�NMR谱峰积分值进行 PCA分析后, 得到因子载荷 图, 从两两比较的 PCA因子载荷图 (图 5、图 6) 可见, 少 数点远离原点, 大多数点集中在原点附近, 正是这些远离原 点的化学位移所代表的化合物造成了各组间差异。对 PC1及 PC2的进一步分析, 并对其主要代谢物组的 1H�NMR谱化学 位移进行归属。 图 2� 正常组与模型组大鼠尿液 PCA得分图 ( score p lot) 图 3� 模型组与给药组大鼠尿液得分图 ( score p lot) 图 4� 正常组与给药组大鼠尿液得分图 ( score p lot) 图 5� 正常组与模型组大鼠尿液因子载荷图 ( loading plot) 图 6� 模型组 B组与给药组 C组大鼠尿液代谢组 因子载荷图 ( load ing p lot) � � 对 1H�NMR谱化学位移进行归属, 通过谱库验证, 根据 原始图谱的信号峰和判别分析因子载荷图的贡献度, 共同分 析得出其浓度的组间差异, 以上数据表明: 与正常组相比, 模型组大鼠尿液马尿酸 3�97、 7� 55、7� 85, ��酮戊二酸 3� 01、 2� 45, 柠檬酸 2� 57、 4�10、 2� 88, 异柠檬酸 3�99、 2� 51、 2� 43和乌头酸 3� 77、6�96、 3�96的谱峰相对积分面积明显减 少, 在尿液中含量降低; 肌酸酐 3�05、4�07, 丙酮 2�23, 乙 酸 1� 93, 肌酸 3�93、 3�03, 烟酸 4� 41、1�41和 5�羟基吲哚�3� 乙酸 3� 03、 2�91、 6� 63、7�15的谱峰相对积分面积明显增高, 在尿液中的含量显著升高。给予柴胡疏肝散灌胃干预后, 给 药组大鼠尿液肌酸 3�93、 3�03, 丙酮 2�23, 肌酸酐 3� 05等含 量明显下降; N�氧化三甲胺、 TMAO、牛磺酸等含量明显增 高, 其尿液代谢表型有向正常范围回归的趋势, 呈现代谢网 络修复的结果。 3� 讨论 机体正常的生理状态是靠各代谢途径之间相互制约而形 成的网络系统维持的, 疾病状态可以看成是正常生理平衡被 打破、超过机体自身调节能力范围的一种非平衡状态, 药物 的使用就是要使这种失衡状态回复到原始的平衡状态或达到 一个新的平衡。疾病是一组生化指标经过系统分析后的偏离 常态, 单靠传统的、孤立、片面的几个临床指标已不能准确、 全面、整体地反映疾病内在变化和满足对疾病诊治的要求。 利用不同性质代谢物之间的相互偶联关系和与生理、病理状 态的联系对有效区分生理、病理状态, 彻底阐述疾病的机理, 合理利用药物通过代谢干预达到诊治疾病的目的都具有十分 重要的意义。 肝气郁结证本质研究, 一直是中西医结合研究领域的热 点之一。数十年来, 对设想可能成为肝气郁结证本质的许多 物质如激素、 cAMP、 cGMP、神经递质、微量元素等进行了 大量研究, 仅观察到与肝气郁结证本质有关的现象和事实, 但未能明确阐释肝气郁结证的实质。目前, 在研究中仍然存 在着选取的一般指标项目较多, 而特异性、敏感性均高的指 标相对较少的现状, 其中不少指标在不同证型之间有类似的 改变, 因而临床无鉴别价值 [ 5, 6]。 代谢组学是近年迅速发展起来的新兴生命学科, 它从代 谢的角度研究生命的本质及疾病的发生、发展过程 [ 7, 8]。它把 !299!中西医结合肝病杂志 2010年第 20卷第 5期 人体作为一个完整的系统来研究, 研究人体代谢网络在疾病 和药物作用下的变化规律, 与中医中药整体观点的哲学思想 十分吻合, 为中医证的研究提供新的模式和方法 [ 9]。在本实 验中, 肝气郁结证大鼠的尿液代谢组学发生了明显的变化, 尿液中马尿酸、��酮戊二酸、柠檬酸、异柠檬酸和乌头酸的 含量降低, 肌酸酐、丙酮、乙酸、肌酸、烟酸和 5�羟基吲哚� 3�乙酸的含量显著升高。柴胡疏肝散能够部分调控平抑肝气 郁结证中发生异常的代谢产物, 促使代谢表型向正常范围回 归, 对肝气郁结证大鼠代谢紊乱有一定的恢复作用。 参考文献 [ 1] 须惠仁, 傅湘琦, 向丽华, 等 �肝郁证的动物实验研究 激怒 刺激对大鼠血液流变学的影响 [ J] �中医杂志, 1991, ( 6) : 44� [ 2 ] WATERS NJ, WATERFIELD CJ, FARRANT RD, et a l�Metabonom ic deconvolu tion of em bedded tox icity: app lication to th ioacetam ide hepato and neph rotox icity [ J] �C hem Res Tox ico,l 2005, 18 ( 4) : 639- 654� [ 3] L INDON JC, N ICHOLSON JK, HOLMES E, et al�M etabonom ics: m etabo lic processes stud ied by NMR spectros�copy of b iof lu ids [ J] � C onceptsM agn Resort, 2002, 12 ( 5 ): 289- 320� [ 4 ] BOLLARD ME, STANLEY EG, L INDON JC, et al�NMR�based m etabonom ics approach es for evaluat ing phys iological inf luen ces on bioflu id compos it ion [ J] �NMR B iom ed, 2005, 18: 143- 162� [ 5] 李素香, 闫晓天 �肝郁证临床及实验研究进展 [ J] �中医研究, 2003, 16 ( 4) : 60- 63� [ 6] 谭秦湘, 吕志平, 张绪富 �蛋白质组学在肝郁证研究中的应用 [ J] �中国临床康复, 2006, 10 ( 11 ): 144- 146� [ 7 ] N ICHOLSON JK, BOLLARD ME, LINDON JC, et a l�M etabonom ics: a plat form for studying drug toxicity and gene function [ J] �D rug D iscovery, 2002, 1: 153- 162� [ 8] TOM ITAM�W hole�cell s imu lation: a gand challenge of the 21st cen tu� ry [ J] �T rends in B iotechno logy, 2003, 19: 205� [ 9 ] 沈自尹 �系统生物学和中医证的研究 [ J] �中国中西医结合杂志, 2005, 25 ( 3) : 255� (收稿日期: 2010- 07- 07� 编辑: 姚昌绶 ) (上接第 288页 ) 或情志失调, 或久病体虚等都可以引起肝失 疏泄、脾失健运、痰浊内生、血脉不通、痰瘀互结, 致使湿 邪、痰浊、瘀血等病理因素淤积于肝导致本病发生。本病病 位在肝, 与脾、肾等脏腑紧密相连。病机特点是肝脾肾功能 受损, 痰瘀互结, 痹阻肝脏络脉。 ∃痰% 与 ∃瘀% 两者有着密切关系, 均为津血不归正化 的病理产物, 气血津液的化生和运行全赖一身阳气的温煦和 推动, 阳气充沛, 升降出入正常, 则水津四布, 五津并行 [2]。 一旦阳气不足或气化失常, 阳气不通, 则必然会导致津液停 积而成痰, 聚为脂膏, 痰瘀互结, 瘀血阻滞, 以致脉络不通。 同时痰凝血瘀进一步加重阳气不通, 使病情加重反复缠绵。 可见阳气不通是形成和加重痰凝血瘀的关键 [ 3], 阳气通则痰 浊血瘀可除, 肝浊清而脂膏自消。因此 , ∃通阳% 是临床防治 NAFLD的重要方法。 本实验结果显示: NAFLD模型组大鼠全血黏度、血浆黏 度、红细胞压积都显著高于治疗组 , 存在着明显的血液流变 学异常; 各治疗组大鼠的 TG、TC、 LDL指标较模型组降低, 而 HDL则升高, 血脂较模型组有明显改善。全血黏度、血浆 黏度、红细胞压积代表血液 ∃浓、粘、聚%, 可以作为反映脂 肪肝痰瘀互结证定量疗效观察指标 [ 4]。有研究显示, 随着脂 肪肝程度的加重, 血液流变学异常亦逐渐加重, 血流速度减 慢, 红细胞发生聚集, 就会使血液黏度进一步增高, 并形成 恶性循环, 最后导致一些小动脉血流停滞。模型组大鼠血液 较正常组明显呈现 ∃浓、粘、聚% 的特点。葱白提取物可使 NAFLD大鼠血液黏度得以有效降低, 使得红细胞携氧能力提 高 [ 5] , 改善肝窦周围由脂肪堆积而引起的氧供和微循环障 碍 [ 6] , 从而改善血液流变学状况。 参考文献 [ 1] 陆再英, 钟南山主编 �内科学 [M ] �第 7版 �北京: 人民卫生出 版社, 2008: 435� [ 2] 印会河, 张伯讷主编 �中医基础理论 [M ] �上海: 上海科学技术 出版社, 1984: 61- 63� [ 3] 林永康 �论痰与瘀 [ J] �中华现代临床医学杂志, 2003, 1 ( 3 ): 246- 247� [ 4 ] 仝连信 �脂肪肝病人血液流变学的临床观察 [ J] �中国血液流变 学杂志, 2004, 14 ( 1) : 120� [ 5 ] 李德忠 �光照射磁极化血液净化疗法对急性脑梗死治疗的临床研 究 [ J] �中华医药学杂志, 2003, 2 ( 4 ): 2- 5� [ 6 ] 刘光健, 杨婷, 李永霞, 等 �血液稀释净化生物平衡疗法治疗非 酒精性脂肪肝的研究 [ J] �现代中西医结合杂志, 2007, 16 ( 11) : 1449- 1451� (收稿日期: 2010- 07- 15� 编辑: 韦 � 怡 ) !300! 中西医结合肝病杂志 2010年第 20卷第 5期