血小板活化检测方法
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balohot 2010-06-28 10:29
血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析
血小板活化试验,对于血小板功能、心血管疾病的研究,有重要意义。使用流式细胞仪进行多参数分析,可以特异、灵敏地检测血小板表面标记,了解血小板的活化
状态和反应性,并同时获得更多关于血...
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balohot 2010-06-28 10:29
血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析
血小板活化试验,对于血小板功能、心血管疾病的研究,有重要意义。使用流式细胞仪进行多参数分析,可以特异、灵敏地检测血小板表面标记,了解血小板的活化
状态和反应性,并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、血小板疾病患者的筛选、预测并发症等方面有良好的应用前景。
使用推荐的三色流式分析方法检测血小板活化的优点是:
检测血小板的反应性;了解血小板活化进程;血小板先发生膜糖蛋白变化,然后是胞浆内颗粒释放到血小板外。同时检测多种血小板表面标志;高度灵敏;直接检测
血小板的多种标志;使用全血,标本量少;操作简便快捷,将血小板人工激活减至最低。
BDIS血小板活化试剂组成为:
PAC-1 FITC:血小板活化早期的标志物,即活化的 gpⅡb/Ⅲa复合物,抗体与活化后血小板膜表面的gpⅡb/Ⅲa复合物纤维蛋白原结合位点相结合。BDIS抗体为
IgM型,建议使用PAC-1结合阻断剂RGDS做阴性对照。
CD62P PE:血小板活化后期的标志物,特异地与活化血小板结合。静止血小板胞浆内a颗粒含有CD62P,血小板活化时,颗粒内糖蛋白向膜外释放,血小板表面表
达CD62P。
CD61 PerCP:特异的泛血小板表面标记,既与活化血小板结合,也与静止的血小板结合。CD61与CD41联合,即为血小板表面gpⅡb/Ⅲa复合物。在本试验中,用
FL3设阈值。
试验用品
采血管:枸橼酸钠抗凝的真空采血管;一次性12×75 mm Falcon试管;微量加样器和加样头;BD抗体:2-8℃保存。
RGDS (PAC-1阻断剂):用PBS配制,10mg/ml。
血小板激活剂:ADP,浓度2×10-4M,2-8℃保存。也可选用其他激活剂,如PMA、纤维蛋白、TRAP。
PBS缓冲液:含0.1%NaN3,过滤后2-8℃保存。
固定液:含1%多聚甲醛的PBS缓冲液,2-8℃可保存一周。
振荡混匀器。
FACS流式细胞仪:进行数据获取。
CaliBRITE Beads/FACSComp软件:FACS仪器校正,预设获取条件。
CellQuest软件:试验数据获取和分析软件。
操作步骤
1、标本采集:
(1)采血管顺序编号。
(2)抽取静脉血,采血管中注入2ml。
(3)于10分钟之内完成血小板激活和染色步骤,操作时应注意减少人工激活。
2.血小板激活:
(1)试管内加入50μlADP,450μl全血,轻轻摇匀。
(2)室温孵育5分钟。
(3)立即染色。
3、荧光抗体染色:
(1)Falcon管编号。
(2)在对照管中加入PE同型对照、CD61 PerCP、PAC-1各20μl,RGDS加10μl。
(3)在试验管中加入三种抗体各20μl。
(4)在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本5μl。
(5)轻轻混匀,室温暗处孵育15-20分钟。
(6)各管中加入1ml冷的固定液 (2-8℃),充分混匀, 2-8℃阴暗处放置30分钟。
(7)24小时内上机分析。
4、上机获取数据:
(1)开机:
检查鞘液筒装满,废液筒倒空。
先打开流式细胞仪,再打开计算机。
仪器气路加压,排空气泡。
做FACSComp。
(2)打开CellQuest,顺序放置对照管和试验管,获取数据:
调出获取条件,FSC和SSC选择Log方式。
获取条件为CD61 PerCP阳性。
使用对照管调整FL1和FL2的PMT,使阴性群体位于FL1 vs FL2点图左下角。
分别使用PAC-1 FITC/IgG1 PE/CD61 PerCP和PAC-1 FITC+ RGDS/CD 62P PE/CD61 PerCP
调整FL2-FL1和FL1-FL2补偿。
获取各管的试验数据。
5、结果分析:
在CD61 vs SSC点图中设门找血小板群。 CD61 vs SSC 点图显示有三群,CD61阳性/低SSC一群主要由单个血小板组成,CD61阳性/高SSC一群主要由黏附血小
板的血细胞组成, CD61阳性/散射光更低的一群主要由血小板来源的碎片组成。由于在生理和病理情况下,血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉,因此,
不建议使用FSC-SSC图设门。
在CD61 vs SSC点图中找出CD61 PerCP阳性的血小板群 (单个血小板和黏附在WBC上的血小板),设门。门内做PAC-1 FITC vs CD62P PE点图的双参数分析,
统计结果。
Figure5 Unstimulated frwhole blood
荧光抗体 FITC PE PerCP
对照管 PAC-1+RGDS IgG1 CD61
试验管 PAC-1 CD62P CD61
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Figure6 Unstimulated fresh whole blood(gated on R1)
Figure7 Unstimulated fresh whole blood(gated on R1)
Figure8 ADP-stimulated fresh whole blood(gated on R1)
注意事项
1.采血时请用大号针管,抽出的前2ml血应弃去不用。
2.尽量避免标本受到物理振动。
3.取血后10分钟内完成染色操作。
4.在Falcon管中加血标本5ml,管壁上不能有残留血,未染色的部分会影响试验结果
5.为了检测和控制血小板体外激活,建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控制
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