抗体酶2nullnull五、抗体酶的筛选方法:
1.ELISA法
2.酶学活性检测法
3.短过渡态类似物法
4.基因筛选法null1.ELISA法: 酶联免疫吸附测定法,又称酶标法,是在免疫酶学基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。
基本原理是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应。
测定的对象可以是抗体也可以是抗原。null操作步骤:
a.利用固相载体吸附需测定的抗体(注意保留其免疫活性);
b.加入待测抗原和相应的酶,或者直接加入抗原与酶结合成的偶联物(注意保留其免疫原活性与...
nullnull五、抗体酶的筛选方法:
1.ELISA法
2.酶学活性检测法
3.短过渡态类似物法
4.基因筛选法null1.ELISA法: 酶联免疫吸附测定法,又称酶标法,是在免疫酶学基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。
基本原理是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应。
测定的对象可以是抗体也可以是抗原。null操作步骤:
a.利用固相载体吸附需测定的抗体(注意保留其免疫活性);
b.加入待测抗原和相应的酶,或者直接加入抗原与酶结合成的偶联物(注意保留其免疫原活性与酶活性),来标记该抗体;
c.加入酶的相应的底物,有颜色反应。
该有色产物的颜色深浅与待测抗体的含量成正比,利用吸光度值可以计算,因此,ELISA法可以对待测物进行定性和定量的测定。
特点:
灵敏性高
特异性强nullELISA法的种类:
√(1)双抗体夹心法;
√(2)间接法;
√(3)竞争法;
(4)双位点一步法;
(5)捕获法测IgM抗体
(6)应用亲和素和生物素的ELISAnull2.酶学活性检测法原理:利用抗体酶的催化活性
方法:
1.分光光度法:利用底物和产物在紫外或可见光部分的光吸收的不同,
特点:简便、节省时间和样品,可检测到nmol/L水平的变化;
2.荧光法:根据底物和产物的荧光性质的差异来进行,
特点:灵敏度往往比分光光度法要高出若干个数量级,但是易受其他物质干扰,最好在可见光范围内进行;
3.同位素测定方法:用放射线同位素的底物,经酶作用后,通过适当的分离,得到一定纯度的产物,测定其脉冲数;
特点:灵敏度极高,可达fmol或更高水平;
4.电化学方法(pH测定法):利用反应前后pH的变化来检测,
特点:方便,较为粗糙; null3.短过渡态类似物法:
原理: 以过渡态类似物中含有的必需基团的基本结构单元作为筛选单克隆抗体的标准。这是一种快速鉴定与过渡态结合的抗体的方法,对该化合物亲和力越强的抗体,其催化效率越高,从而将所要的抗体酶筛选出来。
4.基因筛选法:
原理:应用基因探针,对基因抗体库进行分析和筛选。null六、抗体酶的应用:
1.在理论研究中的应用;
2.在化学工业上的应用;
3.在医学领域的应用;
null1.在理论研究中的应用:
a.证实了酶促反应过渡态理论;
b.加深了对酶作用机理一些假设的理解;null2.在化学工业上的应用:
Sinha等第一次把抗体酶用于天然产物Multi-striatin的合成,至今已成功筛选出可催化六种类型酶促反应和几十种化学反应的抗体酶,可催化许多困难的和能量不利的反应。催化类型包括酯水解,金属底物异构化反应、氧化还原、环化反应等,抗体也可以作为手性助剂控制光加成反应产物的立体化学,用于手性化合物的拆分,还可用于探索化学反应机制。null3.在医学领域的应用:
(1)利用抗体酶催化药物在体内的还原,有利于机体对药物的吸收,并降低药品的毒副作用;
(2)将抗体酶技术和蛋白质融合技术结合在一起,设计出既有催化功能又有组织特异性的嵌合抗体;
(3)将抗体酶直接作为药物,以治疗酶缺陷症患者;
(4)戒毒;
(5)前药治疗(ADEPT);nullLandry 等用可卡因水解的过渡态类似物2磷酸单酯为半抗原,产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解,其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多,水解后的可卡因片断失去了可卡因刺激功能。因此,用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾,达到戒毒目的。null前药治疗(ADEPT):
前药指为降低药物毒性而设计的一类自身无活性或活性较低,需在体内经代谢转化为活性药物以发挥作用的化合物。
ADEPT:即将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联,这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。静脉给药后,当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近, 抗体酶就会将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物,从而提高肿瘤细胞局部药物浓度,增强对肿瘤的杀伤力,达到提高肿瘤化疗效果目的。null1.催化机制仍不清楚;
2.从大量抗体中快速简便地筛选出催化抗体的技术还需完善;
3.抗体酶的实际应用价值尚需开发。现时存在的问
:null发展趋势:
(1) 克隆免疫反应因子的基因
(2) 改善过渡态相似物的设计与合成
(3) 抗体结合点位的化学和遗传修饰
(4) 多种半抗原的综合应用
(5) 在抗体酶中引入辅助因子null结束语:
抗体酶是当今科学前沿众多学科包括合成化学、生物学、免疫学、化学动力学、催化学等待研究成果在分子水平交叉渗透的产物,是抗体的多样性和酶分子的高效催化能力结合在一起的一种新的策略。它的出现不仅为人们开辟了一条人工设计酶的途径,也使人们对催化过程中催化剂的催化机理和催化剂与底物的相互识别有了进一步的认识,无论是在实践应用方面或是理论探索方面, 都具有极其广阔的前景。
尽管仍有一些问题有待解决,但我们可以相信随着生物技术和化学学科的迅速发展,抗体酶的研究与应用必定会到达一个新的层次。nullThe end
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