葡聚糖凝胶过滤介质材料的制备方法

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111530168A(43)申请公布日2020.08.14(21)申请号202010387362.6C08K5/1515(2006.01)(22)申请日2020.05.09(71)申请人苏州先觉生物科技有限公司地址江苏省苏州市工业园区星湖街218号生物纳米园A1北座3楼H58(72)发明人沈宇辉　(74)专利代理机构北京轻创知识产权代理有限公司11212代理人王欢(51)Int.Cl.B01D39/16(2006.01)B01J13/00(2006.01)C08J3/24(2006.01)C08J3/09(2006.01)C08L5/02(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图5页(54)发明名称葡聚糖凝胶过滤介质材料的制备方法(57)摘要本说明书公开了一种葡聚糖凝胶过滤介质材料的制备方法，以环氢氯丙烷为第一反应油相，加入第二反应油相得到混合油相；所述第二反应油相为液体石蜡、二氯乙烷、石油醚、甲苯、氯苯以及甘油至少其中之一；在所述混合油相中加入复合分散剂得到反应溶液，所述复合分散剂为聚醋酸乙烯酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇倍半油酸酯、甘油醚聚合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、棕榈酸、山梨醇酐硬脂酸酯、失水山梨醇油酸酯、失水山梨醇酐三油酸酯至少其中之二的混合物；将葡聚糖溶液加入所述反应溶液中，所述第一反应油相同时作为交联剂，通过反相悬浮聚合法制备所述葡聚糖凝胶过滤介质材料。制备的材料单分散性好，可承受压力高，且分离纯化效果好。CN111530168ACN111530168A权　利　要　求　书1/1页1.葡聚糖凝胶过滤介质材料的制备方法，其特征在于，包括：以环氢氯丙烷为第一反应油相，加入第二反应油相得到混合油相；所述第二反应油相为液体石蜡、二氯乙烷、石油醚、甲苯、氯苯以及甘油至少其中之一；在所述混合油相中加入复合分散剂得到反应溶液，所述复合分散剂为聚醋酸乙烯酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇倍半油酸酯、甘油醚聚合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、棕榈酸、山梨醇酐硬脂酸酯、失水山梨醇油酸酯以及失水山梨醇酐三油酸酯至少其中之二的混合物；将葡聚糖溶液加入所述反应溶液中，所述第一反应油相同时作为交联剂，通过反相悬浮聚合法制备所述葡聚糖凝胶过滤介质材料。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制备所述葡聚糖溶液，包括以下步骤：将葡聚糖原料加入氢氧化钠水溶液中后加入硼氢化物与其反应；所述硼氢化物为硼氢化钠、硼氢化钾至少其中之一；静置后，获取透明且具有流动性的葡聚糖溶液。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖原料的分子量为10000-100000。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖溶液的葡聚糖的质量分数为10％-50％。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制备所述反应溶液，包括以下步骤：设定反应温度为25℃-70℃；加入所述第一反应油相和所述第二反应油相得到混合油相；在所述混合油相中加入所述复合分散剂，搅拌，使得所述复合分散剂溶解于所述混合油相中。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一反应油相和所述第二反应油相的体积比为7:5。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述葡聚糖溶液加入所述反应溶液的同时，以1000-3000rpm的转速进行搅拌，反应5-90分钟。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，搅拌时间到达后，降低搅拌转速至300-1500rmp，继续反应1-15小时。9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，选取聚醋酸乙烯酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇倍半油酸酯、甘油醚聚合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、棕榈酸、山梨醇酐硬脂酸酯、失水山梨醇油酸酯以及失水山梨醇酐三油酸酯其中任意两种制备所述复合分散剂，其质量百分比分别为2.0wt.％和3.0wt.％。10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将葡聚糖溶液加入所述反应溶液中反应结束后，用所述第二反应油相、热水和无水乙醇反复洗涤，去除表面水分后得到所述葡聚糖凝胶过滤介质材料。2CN111530168A说　明　书1/6页葡聚糖凝胶过滤介质材料的制备方法技术领域[0001]本说明书涉及生物工程技术领域，特别涉及葡聚糖凝胶过滤介质材料的制备方法。背景技术[0002]在生物工程处理过程中，经常需要将所需要的成分与其他成分分离出来，层析分离技术具有其他分离手段无法比拟的地位，而限制层析分离技术发展的关键在于过滤介质的开发。[0003]由于葡聚糖来源广泛，价格低廉，其本身不易造成蛋白或者细胞吸附，且分子链上含有大量具有反应活性的羟基，可形成具有三维交联网状空间结构，从而可作为分子筛使用，用来分离不同分子量化合物，因此，葡聚糖是生物工程领域常用的过滤介质原料。[0004]一般的制备技术容易出现微球粘黏，硬度不够以至于烘干后微球结块、或者溶胀率不符合要求影响分离效果等质量问题。发明内容[0005]本说明书实施方式提供一种单分散性好，可承受压力高，且分离纯化效果好的葡聚糖凝胶过滤介质材料的制备方法。[0006]本说明书实施方式提供一种葡聚糖凝胶过滤介质材料的制备方法，所述方法包括，以环氢氯丙烷为第一反应油相，加入第二反应油相得到混合油相；其中，所述第二反应油相为液体石蜡、二氯乙烷、石油醚、甲苯、氯苯以及甘油至少其中之一；在所述混合油相中加入复合分散剂得到反应溶液，其中，所述复合分散剂为聚醋酸乙烯酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇倍半油酸酯、甘油醚聚合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、棕榈酸、山梨醇酐硬脂酸酯、失水山梨醇油酸酯以及失水山梨醇酐三油酸酯至少其中之二的混合物；将葡聚糖溶液加入所述反应溶液中，所述第一反应油相同时作为交联剂，通过反相悬浮聚合法制备所述葡聚糖凝胶过滤介质材料。[0007]由以上本说明书实施方式提供的技术可见，以环氧氯丙烷同时作为第一反应油相和交联剂，再加入复合分散剂和第二反应油相，通过化学交联，采用反相悬浮聚合法，制备具有空间网络结构的交联葡聚糖凝胶的过滤介质材料，这种制备方法解决了传统悬浮聚合法得到的微球产物存在的尺寸分布宽，并且产物抗压能力弱的问题；同时还解决了传统无外相法在交联过程中微球容易粘结，导致微球产物在烘干后不能将粘结的聚集体有效筛除的问题。其单分散性好，可承受压力高，且分离纯化效果好。附图说明[0008]为了更清楚地说明本说明书实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书中记载的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳3CN111530168A说　明　书2/6页动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0009]图1为本说明书实施方式提供的葡聚糖凝胶过滤介质材料的制备图；[0010]图2为本说明书实施方式提供的葡聚糖溶液制备流程图；[0011]图3为本说明书实施方式提供的反应溶液制备流程图；[0012]图4为本说明书实施方式提供的制备葡聚糖凝胶过滤介质材料的流程图；[0013]图5为本说明书实施方式提供的反向悬浮聚合过程的流程图；[0014]图6为本说明书实施方式提供的葡聚糖凝胶微球在水中溶胀的显微镜照片；[0015]图7为本说明书实施方式提供的葡聚糖凝胶微球性能表征图；具体实施方式[0016]为了使本技术领域的人员更好地理解本说明书中的技术方案，下面将结合本说明书实施方式中的附图，对本说明书实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本说明书一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本说明书中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都应当属于本说明书保护的范围。[0017]请参阅图1与图4，本说明书实施方式提供葡聚糖凝胶过滤介质材料的制备方法。所述葡聚糖凝胶过滤介质材料具体可以包括以下步骤。[0018]步骤S11：以环氢氯丙烷为第一反应油相，加入第二反应油相得到混合油相；其中，所述第二反应油相为液体石蜡、二氯乙烷、石油醚、甲苯、氯苯以及甘油至少其中之一。[0019]在本实施方式中，所述第二反应油相可以是液体石蜡、二氯乙烷、石油醚、甲苯、氯苯以及甘油中的至少其中之一，可以是其中的任意一种，也可以是任意两种或者多种的混合。例如所述第二油相可以是二氯乙烷、石油醚两者的混合，也可以是甲苯、氯苯以及甘油三者的混合。所述混合油相可以是将所述第一反应油相和所述第二反应油相混合后所得的混合物。所述混合油相可以是所述第一反应油相和所述第二反应油按照一定比例进行混合，例如，所述第一反应油相和所述第二反应油相按照体积比7:5的比例混合。[0020]在本实施方式中，以环氢氯丙烷为第一反应油相，以液体石蜡、二氯乙烷、石油醚、甲苯、氯苯以及甘油至少其中之一为第二油相得到混合油相可以稳定油相质量。[0021]步骤S12：在所述混合油相中加入复合分散剂得到反应溶液，其中，所述复合分散剂为聚醋酸乙烯酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇倍半油酸酯、甘油醚聚合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、棕榈酸、山梨醇酐硬脂酸酯、失水山梨醇油酸酯以及失水山梨醇酐三油酸酯至少其中之二的混合物。[0022]在本实施方式中，所述复合分散剂可以是聚醋酸乙烯酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇倍半油酸酯、甘油醚聚合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、棕榈酸、山梨醇酐硬脂酸酯、失水山梨醇油酸酯以及失水山梨醇酐三油酸酯其中之二或者其中的多种的混合物。例如，所述复合分散剂可以是聚醋酸乙烯酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯两者的混合物，或者是甘油醚聚合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、棕榈酸三者的混合物。[0023]在本实施方式中，由于反相悬浮聚合具有热力学不稳定的特点，在聚合反应中，颗粒往往会发生结块，使用分散剂可以防止聚合物颗粒粘结，本实施方式所选用的复合分散剂材料可以更好地与葡聚糖原料相匹配，相比较单一分散剂材料，可以筛分出小尺寸微球4CN111530168A说　明　书3/6页聚集体，提高单分散性，分离效果更好，可以获得更好地分散与保护效果。[0024]在本实施方式中，采用符合分散剂可以确保颗粒同时具有两个属性，一个是抗高压力学特征，一个是颗粒的分散度和大小可控比较好。[0025]步骤S13：将葡聚糖溶液加入所述反应溶液中，所述第一反应油相同时作为交联剂，通过反相悬浮聚合法制备所述葡聚糖凝胶过滤介质材料。[0026]在本实施方式中，所述反相悬浮聚合法可以是将水溶性单体在有机溶剂中分散成细小液滴并进行聚合反应的技术。使用反相悬浮聚合法对设备和工艺的要求较低，反应条件温和，副反应小，没有废水和环境污染。[0027]在本实施方式中，同时将环氢氯丙烷作为第一反应油相和交联剂，不需要在反相悬浮聚合反应中再次添加，可以在制备所述混合油相时添加一次即可。所述环氢氯丙烷同时作为第一反应油相和交联剂，可以将反应油相和分散剂除去，并且这种方法制备出的葡聚糖微球硬度更高，能够承受更高的压力，同时微球产物在烘干过程中不易粘接，容易筛分。[0028]在一个实施方式中，请参阅图2，制备所述葡聚糖溶液，包括以下步骤。[0029]S21：将葡聚糖原料加入氢氧化钠水溶液中后加入和硼氢化物与其反应；其中，所述硼氢化物为硼氢化钠、硼氢化钾至少其中之一；[0030]S22：静置，获取透明且具有流动性的溶液。[0031]在本实施方式中，可以将葡聚糖原料加入氢氧化钠水溶液中后加入和硼氢化物，所述硼氢化物可以是硼氢化钠或者硼氢化钾的至少其中之一。例如可以将葡聚糖原料溶于所述氢氧化钠溶液中再加入硼氢化钠与其反应，或者可以将葡聚糖原料溶于所述氢氧化钠溶液中后再加入硼氢化钠和硼氢化钾的混合物与其反应。[0032]在本实施方式中，加入所述硼氢化物，可以提高溶液的稳定性。[0033]在一个实施方式中，所述葡聚糖原料的分子量为10000-100000，制备的所述葡聚糖溶液中葡聚糖的质量分数为10％-50％。[0034]在本实施方式众，选用这个数据10000-100000的葡聚糖原料的分子量，制备的所述葡聚糖溶液中葡聚糖的质量分数为10％-50％，可以获得更适合的密度和强度的颗粒，太大分子量会造成颗粒较密度高，过筛选效果不好。太小的密度会造成抗压力差，易破碎。颗粒的分散度和大小也更为适宜。[0035]在一个实施方式中，请参阅图3，制备所述反应溶液，包括以下步骤。[0036]S31：设定反应温度为25℃-70℃。[0037]S32：加入所述第一反应油相和所述第二反应油相得到混合油相。[0038]S33：在所述混合油相中加入所述复合分散剂，搅拌，使得所述复合分散剂溶解于所述混合油相中。[0039]在本实施方式中，反应温度可以设定在25℃-70℃范围内任一温度，设定该反应温度区间可以提高所述复合分散剂的溶解效率，提高之后反向悬浮聚合的效果。[0040]在一个实施方式中，所述第一反应油相和所述第二反应油相的体积比为7:5。[0041]在本实施方式中，可以将7体积的第一反应油相与5体积的第二反应油相相混合，使用该体积比可以更好地稳定油相品质。[0042]在一个实施方式中，选取聚醋酸乙烯酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、失水山梨5CN111530168A说　明　书4/6页醇倍半油酸酯、甘油醚聚合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、棕榈酸、山梨醇酐硬脂酸酯、失水山梨醇油酸酯以及失水山梨醇酐三油酸酯其中任意两种制备所述复合分散剂，其质量百分比分别为2.0wt.％和3.0wt.％。[0043]在本实施方式中，可以选取上述物质的任意两种制备所述复合分散剂，选取的两种物质的质量百分比分别为2.0wt.％和3.0wt.％。例如，选取棕榈酸和甘油醚聚合物作为复合分散剂，100g棕榈酸溶液中棕榈酸为2g，100g山梨醇酐硬脂酸酯溶液中山梨醇酐硬脂酸酯为15g。[0044]在本实施方式中，选用该质量百分比制备复合分散剂可以稳定溶解于混合油相中，从而可以筛分出小尺寸微球聚集体，提高单分散性，分离效果更好，可以获得更好地分散与保护效果。[0045]在一个实施方式中，请参阅图5，反向悬浮聚合的过程包括以下步骤。[0046]S51：将所述葡聚糖溶液加入所述反应溶液的同时，以1000-3000rpm的转速进行搅拌，反应5-90分钟。[0047]S52：搅拌时间到达后，降低搅拌转速至300-1500rmp，继续反应1-15小时[0048]S53：反应结束后，用所述第二反应油相、热水、无水乙醇反复洗涤，去除表面水分后得到所述葡聚糖凝胶过滤介质材料。[0049]在本实施方式中，经过两次搅拌和反应，提高了葡聚糖凝胶微球的化学稳定性。先以1000-3000rpm的转速进行搅拌，反应5-90分钟，在搅拌时间到达后，降低搅拌转速至300-1500rmp，继续反应1-15小时可以获得更好的颗粒分散度，先以高转速搅拌获得小颗粒，反映结束后降低转速进而增大颗粒，提高分散效果。[0050]在本实施方式中，用所述第二反应油相、热水、无水乙醇反复洗涤，去除表面水分后得到所述葡聚糖凝胶过滤介质材料，可以获得安全可靠的颗粒，并且将聚集的颗粒洗干净，提高颗粒的可靠性和稳定性。[0051]本说明书提供使用本说明书提供的方法制备葡聚糖凝胶过滤介质材料的6个场景示例。[0052]在本场景示例中，称取30g葡聚糖，用70g 6mol/L的氢氧化钠水溶液处理，加入1.0g硼氢化钾，静置，使其溶解成黄色透明的流体。[0053]在本场景示例中，设定反应温度为45℃，在反应装置中按比例加入体积比7:5的环氧氯丙烷与二氯乙烷的混合油相500mL，再加入复合分散剂2.0wt.％的棕榈酸，3.0wt.％的聚醋酸乙烯酯，开启搅拌，使得复合分散剂在反应油相中溶解稳定；[0054]在本场景示例中，将经过前处理的葡聚糖溶液加入到反应装置中，同时高速搅拌，转速为3000转/每分钟，持续45分钟；[0055]在本场景示例中，当高速搅拌时间到达以后，降低搅拌速度为1000转/每分钟，继续反应5小时；[0056]在本场景示例中，反应结束后，用二氯乙烷，热水，无水乙醇反复洗涤产物，真空抽滤除去表面水分得到葡聚糖凝胶微球。[0057]在一个场景示例中，称取25g葡聚糖，用100g 6mol/L的氢氧化钠水溶液处理，加入1.0g硼氢化钾，静置，使其溶解成黄色透明的流体。[0058]在本场景示例中，设定反应温度为50℃，在反应装置中按比例加入体积比7:5的环6CN111530168A说　明　书5/6页氧氯丙烷与氯苯的混合油相550ml，再加入复合分散剂2.0wt.％的棕榈酸和3.0wt.％的聚醋酸乙烯酯，开启搅拌，使得复合分散剂在反应油相中溶解稳定。[0059]在本场景示例中，将经过前处理的葡聚糖溶液加入到反应装置中，同时高速搅拌，转速为2000转/每分钟，持续60分钟。[0060]在本场景示例中，当高速搅拌时间到达以后，降低搅拌速度为1000转/每分钟，继续反应5小时。[0061]在本场景实例中，反应结束后，用甲苯，热水，无水乙醇反复洗涤产物，真空抽滤除去表面水分得到葡聚糖凝胶微球。[0062]在一个场景示例中，称取25g葡聚糖，用100g 4mol/L的氢氧化钠水溶液处理，加入1.0g硼氢化钾，静置，使其溶解成黄色透明的流体。[0063]在本场景示例中，设定反应温度为50℃，在反应装置中按比例加入体积比为7:5的环氧氯丙烷与液体石蜡的混合油相500ml，再加入复合分散剂2.0wt.％的棕榈酸和3.0wt.％的失水山梨醇酐三油酸酯，开启搅拌，使得复合分散剂在反应油相中溶解稳定。[0064]在本场景示例中，将经过前处理的葡聚糖溶液加入到反应装置中，同时高速搅拌，转速为2000转/每分钟，持续45分钟。[0065]在本场景示例中，当高速搅拌时间到达以后，降低搅拌速度为1000转/每分钟，继续反应5小时；[0066]在本场景示例中，反应结束后，用液体石蜡，热水，无水乙醇反复洗涤产物，真空抽滤除去表面水分得到葡聚糖凝胶微球。[0067]在一个场景示例中，称取25g葡聚糖，用50g 4mol/L的氢氧化钠水溶液处理，加入1.0g硼氢化钾，静置，使其溶解成黄色透明的流体；[0068]在本场景示例中，设定反应温度为50℃，在反应装置中按比例加入体积比7:5的环氧氯丙烷与液体石蜡的混合油相500ml，再加入复合分散剂2.0wt.％的棕榈酸和3.0wt.％的山梨醇酐硬脂酸酯，开启搅拌，使得复合分散剂在反应油相中溶解稳定；[0069]在本场景示例中，将经过前处理的葡聚糖溶液加入到反应装置中，同时高速搅拌，转速为3000转/每分钟，持续60分钟；[0070]在本场景示例中，当高速搅拌时间到达以后，降低搅拌速度为1000转/每分钟，继续反应6小时；[0071]在本场景示例中，反应结束后，用液体石蜡，热水，无水乙醇反复洗涤产物，真空抽滤除去表面水分得到葡聚糖凝胶微球。[0072]在一个场景示例中，称取25g葡聚糖，用75g 6mol/L的氢氧化钠水溶液处理，加入1.0g硼氢化钾，静置，使其溶解成黄色透明的流体。[0073]在本场景示例中，设定反应温度为50℃，在反应装置中按比例加入体积比7:5的环氧氯丙烷与液体石蜡的混合油相500ml，再加入复合分散剂2.0wt.％的棕榈酸和3.0wt.％失水山梨醇酐三油酸酯，开启搅拌，使得复合分散剂在反应油相中溶解稳定。[0074]在本场景示例中，将经过前处理的葡聚糖溶液加入到反应装置中，同时高速搅拌，转速为3000转/每分钟，持续60分钟；[0075]在本场景示例中，当高速搅拌时间到达以后，降低搅拌速度为1250转/每分钟，继续反应6小时；7CN111530168A说　明　书6/6页[0076]在本场景示例中，反应结束后，用液体石蜡，热水，无水乙醇反复洗涤产物，真空抽滤除去表面水分得到葡聚糖凝胶微球。[0077]在本场景示例中，请参阅图6，其为显微镜下的葡聚糖凝胶微球在水中溶胀的照片，其溶胀性较好。[0078]在一个场景示例中，取干粉状态的使用本方法获取的葡聚糖凝胶过滤介质材料，经过充分溶胀后，分别装入内径12mm的层析柱，填料柱床高度9cm，体积约10ml，采用3ml/min的流速。[0079]在本场景示例中，待分离样品是10mg/ml BSA和0.5M NaCl的混合溶液，分别以1.7ml，1.0ml，0.6ml体积上样，请参阅图7，其脱盐效果较好，从峰型上看，使用本方法获取的葡聚糖凝胶过滤介质材料峰型较为尖锐，说明其分辨率较高。[0080]本说明书提供的实施方式，以环氧氯丙烷同时作为第一反应油相和交联剂，再加入复合分散剂和第二反应油相，通过化学交联，采用反相悬浮聚合法，制备具有空间网络结构的交联葡聚糖凝胶的过滤介质材料，这种制备方法制备的产物抗压能力强，避免交联过程中的微球粘结。[0081]本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。[0082]虽然通过实施例描绘了本说明书，本领域普通技术人员知道，本说明书有许多变形和变化而不脱离本说明书的精神，希望所附的权利要求包括这些变形和变化而不脱离本说明书的精神。8CN111530168A说　明　书　附　图1/5页图1图29CN111530168A说　明　书　附　图2/5页图310CN111530168A说　明　书　附　图3/5页图411CN111530168A说　明　书　附　图4/5页图5图612CN111530168A说　明　书　附　图5/5页图713