食品中D-异抗坏血酸的测定 高效液相色谱法（编制说明）

吉林省食品安全地方标准《食品中D-异抗坏血酸的测定》编制说明(送审稿)吉林省产品质量监督检验院2012年7月24日吉林省食品安全地方标准《食品中D-异抗坏血酸的测定高效液相色谱法》编制说明一、研究背景抗坏血酸，又称维生素C，是一种己糖醛基酸，广泛存在新鲜水果及保健饮品中，是重要的必需维生素，人体不能自身合成，必须靠摄取获得，严重缺乏时可引起坏血病。抗坏血酸的化学性质不稳定，易被氧化，在酸性条件下才能较稳定存在。异抗坏血酸，即D-抗坏血酸，是抗坏血酸的光学异构体，异抗坏血酸价格相对便宜，常用做食品抗氧化剂，防腐剂。它也可参与人体生理代谢，但只有抗坏血病活性的5%，在人体消化过程中可能存在与抗坏血酸的竞争作用，影响人体对抗坏血酸的吸收。抗坏血酸是蔬菜、水果中重要的营养成分，新鲜蔬菜、水果中往往都有含量较高的抗坏血酸。抗坏血酸和异抗坏血酸都是一般食品中允许添加的食品添加剂，但是目前国家食品安全标准中没有食品中D-异抗坏血酸检测方法，现有抗坏血酸检测方法不能区分食品中添加的抗坏血酸和异抗坏血酸成分，因此有必要建立食品中D-异抗坏血酸液相色谱检测方法,为质量监管部门提供技术依据。二、任务来源任务来源：吉林省卫生厅任务编号：DBS22/002-2012归口单位：吉林省卫生厅起草单位：吉林省产品质量监督检验院三、制定标准的必要性和意义1、保障人民身体健康的需要D-异抗坏血酸的合成成本低，只约相当于抗坏血酸（即天然维生素C）的30%左右。一些食品生产企业为增加产品的保质期，在食品中添加D-异抗坏血酸作为抗氧化剂，声称添加维生素C，却没有维生素C的营养价值，按目前标准不能检测、鉴别，损害了消费者的知情权，也可能对人民身体健康造成潜在危害。2、是为国家政府部门食品安全监管工作提供技术保障的需要为能够及时应对食品安全突发事件，维护广大消费者的利益，保护消费者身体健康，为执法机构的监督提供科学理论依据和技术支撑，有必要建立食品中D-异抗坏血酸检测的液相色谱方法，以实现饮料中营养物质抗坏血酸和作为抗氧化剂、防腐剂使用的异抗坏血酸分离检测，严格规范抗坏血酸和异抗坏血酸在饮料中的添加使用。本标准的制定为国家政府部门食品安全监管提供了技术保障。3、完善国家标准的需要目前国家标准中，使用碘量法和旋光法鉴别、测定抗坏血酸含量，不能区分样品中抗坏血酸和D-异抗坏血酸。目前，我国国家标准中没有食品中抗坏血酸和D-异抗坏血酸的液相色谱测定方法，制定此标准可满足检验工作需要，完善国家标准体系。四、标准制定的主要过程1、前期工作我们实验室在2010年完成了国家质检总局2009QK086科研项目《食品中抗坏血酸和异抗坏血酸的测定》，在实验室中成功地使用液相色谱法完成了抗坏血酸和D-异抗坏血酸分离检测，并在《中国公共卫生》杂志发表了研究论文。通过查阅最新的资料和技术文献，我们确定了使用HILIC液相色谱柱分离测定抗坏血酸和D-异抗坏血酸的技术路线，对方法的检出限、回收率、精密度进行了系统研究，建立了一个操作简单、灵敏度高、选择性好、能为我省大多数的检测机构所使用的方法，为食品中抗坏血酸和D-异抗坏血酸的检测提供了技术依据。由于目前国家标准和地方标准中没有测定食品中D-异抗坏血酸的方法，据此我们向吉林省卫生厅提出食品安全地方标准制定申请。2、实验室间验证工作2012年7月，我们进行了实验室间的验证工作。通过统计分析各个实验室的检测数据，验证了方法的准确度和精密度、最低检出限等。参加验证的实验室一致认为：该方法适用于测定食品中D-异抗坏血酸的含量，具有测定结果准确可靠、操作简单、快速等特点。五、制标原则本标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则，尽可能与国际通行标准接轨，注重标准的可操作性，严格按照GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》和GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的要求编写的。六、标准主要条款的说明1、标准的名称本标准利用液相色谱法检测食品中D-异抗坏血酸含量，所以本标准的名称定为：《食品中D-异抗坏血酸的测定高效液相色谱法》。2、标准的范围本标准适用于食品中D-异抗坏血酸的液相色谱法测定。3、方法原理抗坏血酸（L-Ascorbicacid）：通常称为维生素C（VitaminC），分子式C6H8O6，分子量176.13，水溶液形成缩醛结构，结构式：，纯品通常呈无色晶体状，水溶液具有很强的酸味，抗坏血酸在水溶液中的pK1=4.17，pK2=11.57，当抗坏血酸在水溶液中浓度达到5mg/mL时，溶液的pH值为3，呈现较强的酸性。抗坏血酸在水溶液中的比旋光度为：[α]D25=+20.5°→+21.5°(c=1cm)，一般我们通过测量抗坏血酸的比旋光度可以测定抗坏血酸的纯度。抗坏血酸在pH=2的水溶液中最大紫外吸收峰在245nm(E1%1cm=695)，在pH=6.4的水溶液中最大紫外吸收峰在265nm(E1%1cm=940)。抗坏血酸是一种很强的还原剂，在pH=4的水溶液中，抗坏血酸的第一电离能为，E10=+0.166V，因此可以用氧化还原电位滴定法测定抗坏血酸含量。D-异抗坏血酸（IsoascorbicAcid），也叫异维生素C（isovitaminC），分子式C6H8O6，分子量176.13，D-异抗坏血酸易溶于水，水溶液具酸性，在水溶液中成缩醛状结构存在，结构式为，以抗坏血酸纯品为无色晶体，也具有抗坏血病的生理活性，但其在人体内生理活性仅为抗坏血酸的5%。异抗坏血酸的旋光活性与抗坏血酸相反，在水溶液中的比旋光度为：[α]D20=-16.6°(c=1cm)。异抗坏血酸主要作为防腐剂添加到加工食品、饮料中。抗坏血酸和D-异抗坏血酸在结晶态时互为光学异构体，但是在水溶液中，形成的缩醛结构后，由于空间位阻关系，两种化合物上的羟基和羟甲基伸展方向不同，其在水溶液中的极性也不相同，因此我们可以通过选择合适的液相色谱条件，使食品中的重要营养成分抗坏血酸和作为食品防腐剂的异抗坏血酸分别得到检测。在本课题研究中，我们发现抗坏血酸和D-异抗坏血酸在HILIC色谱柱有较强的保留，通过实验优化了色谱条件，最终确定了样品前处理条件和液相色谱分离条件，该方法用于食品中D-异抗坏血酸的测定，具有操作简单，重现性好，结果准确可靠等特点，检测方法的灵敏度、精密度、准确度、回收率等技术参数符合食品样品测试的要求。4试剂和材料除特殊说明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为三级水，色谱用水为一级水，符合GB/T6682中用水规定。流动相用乙腈为色谱纯。D-异抗坏血酸(含量>99.7%)，可以用分析纯试剂。0.1%磷酸水溶液：精密吸取磷酸1mL，加超纯水定容至1000mL。流动相：精密吸取0.1%磷酸水溶液100mL，加色谱纯乙腈定容至1000mL，此流动相应过0.45μm微孔滤膜过滤。5仪器、设备需要配紫外检测器的液相色谱仪，HILIC色谱柱（250mm长，内径4.6mm，粒径5μm，孔隙100Å）；自动匀浆机、电子分析天平，感量0.1mg、离心机（50mL，每分钟4000转；0.45μm一次性微孔滤膜（有机相）。6试样制备6.1液体试样：准确称取试样5g，精确至0.001g，置于50mL容量瓶中，加流动相适量，混匀后，加流动相定容至刻度。充分振荡混匀后，取此试样溶液适量，用0.45μm一次性微孔滤膜过滤至2mL进样瓶中，待测。液体食品试样如饮料等含水量多，可以与流动相以任意比例互溶，5g液体试样加流动相可以精确地定容到50mL。6.2水溶性固体试样：准确称取试样5g，精确至0.001g，置于50mL容量瓶中，加0.1%磷酸水溶液适量，振荡溶解后，加流动相定容至刻度。此试样溶液充分振荡混匀后，用0.45μm一次性微孔滤膜过滤至2mL进样瓶中，待测。水溶性固体试样在水中溶解度较好，加适量0.1%磷酸水溶液使样品溶解后，再加入适量流动相可以改善样品色谱峰形，提高色谱定性、定量的准确性。6.3蔬菜、水果及其罐头制品：取有代表性的部分匀浆后，称取试样12.5g，精确至0.001g，置于50mL容量瓶中，加0.1%磷酸水溶液定容至刻度，此试液在4000r/min下离心10min。精密量取上清液10mL，置于25mL容量瓶中，加流动相定容至刻度。此试样溶液充分振荡混匀后，用0.45μm一次性微孔滤膜过滤至2mL进样瓶中，待测。蔬菜、水果含水量比较高，匀浆后加提取液可以准确定容到50mL，离心后上清液加流动相稀释、过滤后进样即可。6.4水不溶性固体试样：准确称取试样12.5g，精确至0.001g，置于250mL烧杯中，精确加入0.1%磷酸水溶液50mL，匀浆后，在4000r/min下离心10min。取上清液10mL，置于25mL容量瓶中，加流动相定容至刻度。此试样溶液充分振荡混匀后，用0.45μm一次性微孔滤膜过滤至2mL进样瓶中，待测。不含水也不溶于水的固体样品，可以用50mL磷酸水溶液提取试样中的D-异抗坏血酸成分，加适量流动相稀释后进样即可。试样中抗坏血酸和异抗坏血酸在酸性溶液中比较稳定，因此我们选择0.1%磷酸溶液做提取溶剂，加适量流动相定容、过滤后直接进样即可。7分析步骤7.1检验过程应在避光条件下快速进行。7.2D-异抗坏血酸标准溶液的制备（D-异抗坏血酸试液见光易分解，应避光配制，并临用现制）。精密称取D-异抗坏血酸标准品100mg于100mL棕色容量瓶中，加0.1%磷酸水溶液定容至刻度，得D-异抗坏血酸浓度为1mg/mL的标准溶液；精密吸取D-异抗坏血酸标准溶液1mL、2mL、5mL、10mL、20mL于100mL棕色容量瓶中，加0.1%磷酸水溶液稀释并定容至刻度，得浓度为10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的D-异抗坏血酸的系列标准溶液。取此系列标准溶液适量，用0.45μm一次性微孔滤膜过滤至2mL进样瓶中，待测。7.3测定方法液相色谱法：精密吸取试样和标准品溶液，按规定色谱条件分别进样20μL，色谱图。以D-异抗坏血酸保留时间定性，外标法峰面积定量。7.4液相色谱条件7.4.1色谱柱和流动相条件的确定根据参考文献和试验结果，我们发现抗坏血酸和异抗坏血酸在HILIC色谱柱上的保留规律与一般的C18色谱柱不同，当使用乙腈和0.1%的磷酸水溶液作为流动相时，当乙腈的比例大于80%时，抗坏血酸和异抗坏血酸可以得到色谱分离，且随着流动相中乙腈比例增加，抗坏血酸和异抗坏血酸的保留时间变长，分离度也增加，在乙腈比例为90%时有最好的分离效果和检测灵敏度。当乙腈比例大于95%以后，由于水溶性的抗坏血酸和异抗坏血酸在流动相中溶解度降低，造成色谱峰峰形变差。因此，确定乙腈和0.1%磷酸水溶液的比例为90：10作为液相色谱检测方法的流动相。7.4.2检测波长的选择取配制好的抗坏血酸和Ｄ-异抗坏血酸标准溶液适量，分别进样，用二极管阵列紫外检测器记录色谱图和光谱图，发现在此色谱条件下抗坏血酸和Ｄ-异抗坏血酸最大吸收均在245nm附近，故本实验以245nm作为检测波长。图1和图2分别为AA和iso-AA的紫外光谱。图1AA紫外光谱图Figure1UVspectraofAA图2iso-AA紫外光谱图Figure2UVspectraofisoAA改变流动相中有机相比例或者改变缓冲溶液pH值，均会使抗坏血酸和异抗坏血酸的最大吸收波长发生变化，如根据文献报道，抗坏血酸在pH=2的水溶液中最大紫外吸收峰在245nm，在pH=6.4的水溶液中最大紫外吸收峰就变成了265nm，因此，应在根据具体流动相条件，在实验前确定检测波长。7.4.3流动相：0.1%磷酸溶液+乙腈=10+90，7.4.4流速：1.0mL/min；7.4.5进样体积：20μL。7.4.6柱温：30℃7.5结果与表述：结果按式(1)计算：(1)式中：X---试样中D-异抗坏血酸含量，mg/kg；C---从色谱工作站中读出试液中抗坏血酸或D-异抗坏血酸的浓度，μg/mL；m---试样质量，g；7.5.2　结果表述平行测定结果用算术平均值表示，保留3位有效数字。8检出限等采用此方法对不同浓度的D-异抗坏血酸标准溶液进行测定，重复进样，分别测定峰高值、噪音值，仪器检出限采用3倍噪声的响应值，为0.05μg/mL，按取样量5g，定容体积50mL计算，方法的检出限为0.5mg/kg。9线性范围取浓度为10～200μg/mL系列标准溶液，依法进样，以色谱峰面积为纵坐标，样品浓度为横坐标绘制标准曲线，计算标准曲线线性方程：D-异抗坏血酸y=13157.1211x–2.796956，r2=0.99995y：峰面积，x：浓度（μg/mL）以上数据表明，试液浓度在10～200μg/mL范围内，D-异抗坏血酸浓度和峰面积线性关系良好，可以用于外标法定量。此方法可用于食品样品中D-异抗坏血酸的测定。10回收率根据GB/T5009.1-2003，我们选择果汁饮料，婴幼儿奶粉，苹果酱，保健食品和桃罐头等5类样品，分别精密称取10份，每份5g，其中5份加入异抗坏血酸0.02mg/mL标准溶液5mL，另外5份样品作为对照，依法制备试样溶液，分别进样后，计算样品添加回收率和RSD。详细数据见表1。表1样品添加回收率 样品 异抗坏血酸添加量（g/kg） 异抗坏血酸回收率（%） RSD（%） 苹果酱 0.200 87.1 5.4 果汁饮料 0.200 89.7 3.2 婴幼儿奶粉 0.200 91.3 4.5 保健食品 0.200 90.5 5.1 桃罐头 0.200 92.6 4.3果汁饮料，婴幼儿奶粉，苹果酱，保健食品和桃罐头等5类食品样品的添加回收率均高于80%，此方法测定食品中D-异抗坏血酸具有很好的准确性。11方法验证试验在给定的实验条件下，我们请五家机构的不同人员在各自的实验室采用液相色谱法对方法进行了验证试验，实验结果如下：11.1线性范围采用标准溶液，进行方法线性实验，记录峰面积与对应的标准溶液浓度，进行线性回归计算，得出线性方程、线性范围和相关系数(R2)，结果见表2。由结果可见，各验证单位均取得良好线性相关。表2.D-异抗坏血酸的线性范围与相关系数(R2) 检测单位 线性曲线 线性范围(μg/mL) 相关系数（R2） 机构1 y=10231x–5.0955 10-200 0.99991 机构2 y=12984x＋0.9812 10-200 0.9999 机构3 y=17256x＋3.2321 10-200 0.99992 机构4 y=12150x–1.1133 10-200 0.99995 机构5 y=15231x＋5.4169 10-200 0.999911.2回收率和精密度各验证单位采用液相色谱法测定果汁，婴幼儿奶粉，苹果，保健食品和桃罐头等样品的加样回收率和精密度，每个样品分别依法测定5次。结果见表3-7。表3.方法回收率和精密度实验（机构1） 样品 异抗坏血酸添加量（g/kg） 异抗坏血酸回收率（%） RSD 苹果酱 0.200 92.3 3.7 果汁饮料 0.200 90.9 3.9 婴幼儿奶粉 0.200 93.4 2.0 保健食品 0.200 94.7 3.1 桃罐头 0.200 95.6 2.3表4.方法回收率和精密度实验（机构2） 样品 异抗坏血酸添加量（g/kg） 异抗坏血酸回收率（%） RSD 苹果酱 0.200 95.0 5.1 果汁饮料 0.200 97.2 1.2 婴幼儿奶粉 0.200 87.5 6.9 保健食品 0.200 90.3 7.0 桃罐头 0.200 89.1 3.2表5.方法回收率和精密度实验（机构3） 样品 异抗坏血酸添加量（g/kg） 异抗坏血酸回收率（%） RSD 苹果酱 0.200 91.0 4.2 果汁饮料 0.200 92.3 2.5 婴幼儿奶粉 0.200 91.9 3.7 保健食品 0.200 93.9 4.4 桃罐头 0.200 90.7 5.1表6.方法回收率和精密度实验（机构4） 样品 异抗坏血酸添加量（g/kg） 异抗坏血酸回收率（%） RSD 苹果酱 0.200 94.1 5.2 果汁饮料 0.200 93.3 4.2 婴幼儿奶粉 0.200 96.1 4.5 保健食品 0.200 88.3 6.0 桃罐头 0.200 89.3 4.7表7.方法回收率和精密度实验（机构5） 样品 异抗坏血酸添加量（g/kg） 异抗坏血酸回收率（%） RSD 苹果酱 0.200 90.5 3.9 果汁饮料 0.200 92.1 3.5 婴幼儿奶粉 0.200 90.9 1.4 保健食品 0.200 92.7 2.9 桃罐头 0.200 91.4 2.3七、资料性附录抗坏血酸或D-异抗坏血酸的液相色谱图图A.1抗坏血酸和D-异抗坏血酸标准溶液色谱图1，D-异抗坏血酸；2，抗坏血酸图A.2含抗坏血酸和D-异抗坏血酸的饮料样品液相色谱图由抗坏血酸和D-异抗坏血酸液相色谱图可以看到，食品样品中抗坏血酸和D-异抗坏血酸的色谱分离良好，此方法可实际用于含量较高样品的抗坏血酸和D-异抗坏血酸同时测定。八．实施标准的建议经过以上工作，我们建立了食品中D-异抗坏血酸含量测定的检测方法。方法快速、灵敏、准确。建议批准并发布。吉林省产品质量监督检验院2012年7月24日PAGE1_1404302316.unknown