胱硫醚β合酶基因突变及负荷后同型半胱氨酸水平与青年脑梗死

胱硫醚β合酶基因突变及负荷后同型半胱氨酸水平与青年脑梗死 胱硫醚β合酶基因突变及负荷后同型半胱氨 酸水平与青年脑梗死 中国神经精神疾病杂志2005年第3l卷第2期 胱硫醚I];合酶基因突变及负荷后同型 半胱氨酸水平与青年脑梗死? 刘怀翔张哲成柏谈晓牧刘建国高海风 l15 ? 论着? 【摘要】目的研究胱硫醚G合酶(CBS)基因T833C突变对蛋氨酸负荷试验(MLT)后血浆同型半胱氨酸(Hcy) 水平的影响及其对青年脑梗死的致病作用.方法采用高压液相色谱法测定血浆空腹同型半胱氨酸(Fhey)及负荷 后同型半胱氨酸(Phey)水平,选取Fhey水平正常的75例青年脑梗死患者和52例正常对照者.利用扩增阻滞突变 体系法检测CBST833C基因型.结果病例组Phey水平和负荷前后Hcy水平的差值均高于对照组;病例组和其负 荷后高同型半胱氨酸血症(PHhcy)组CBS基因C/C,C/T型和c等位基因频率分别高于对照组和病例组负荷后非高 同型半胱氨酸血症(NPHhcy)组;病例组,对照组和PHhcy青年脑梗死患者组CBSC/C型者Phey水平依次高于C/T 型和T/T型者;NPHhey青年脑梗死患者CBSC/C型暂Phey水平高于T/T型者,C/T型显着高于T/T型者.结论 CBST833C基因突变可能是Phcy水平异常升高的遗传原因,并间接导致青年脑梗死发生的重要遗传危险因素. 【关键词】胱硫醚G合酶蛋氨酸负荷试验脑梗死 【中图分类号】R743.32【文献标识码】A GeneticmutationofCBSandPhcylevelinyoungpafien~withcerebralinfarction.HUHuai—,,ZHANGZhe- cheng,TANXiao-mu,LIUJian—guo,GAOHai-feng.DepartmentofNeurology,TheSecondHospital ofTianjinMedicalUrdversi一 ,23Pin西iangRoadTianjin.300211.Tel:022—88328514 【Abstract]ObjectiveTostudytheeffectofeystathionime』3synthase(CBS)T883Cgenemutationtotheplasmahomocys. tine(Hcy)levelaftermethionineloadingtest(MI;F)inyoungpatientswithcerebralinfarction.Methods Theemptyplasmahomo? cystine(Fhcy)andhomocystine’afterMLT(Phcy)levelweremeasuredwithhighperformanceliquidch romatography.75youngpa- tientswithcerebralinfarctionand52normalcontrols,both~,4thnormalFheylevel,wereselectedforCBST833egenetypeforanal? ysiswithamplificationrefractoffmutationsystem.ResultsThePhcylevelandhcylevelbeforeandafterloadinginpatientswere higherthanthoseinthecontrols.ThefrequenciesofCBSgeneC/C,C/TgenetypeandCallelesinthepatientsandthecaseswith HyperhomeysteinemiaafterMLT(PHhcy)weresignificantlyhigherthancontrolsandthosewithoutHyperhomeysteinemiaafterMLT (NPHhey)respectively.ThePheylevelofCBSC/CgenetypeWashigher,inturnthanC/TandT/Tgenetypeinpatients,controls andtheyoungpatientswithcerebralinfarctionandPHhey.TheFhcylevelinCBSC/CandC/TgenetypsWashigherthanthatin T/1’type.intheNPHhcyoftheyoungpatientswithcerebralinfarction.ConclusionsBesidecircumstanceandnutrition.CBS T833CgenemutationmaybetheinheritedreasonofPhcylevelabnormalelevationandindirectcauseofcerebralinfarctioninyoung patients. 【Keywords】CystathionineGsynthaseMethionineloadingtestCerebralinfarction 高同型半胱氨酸血症(Hhcy)已被认为是缺乏传统 卒中危险因素的年轻患者新的独立危险因素….目前 的研究以空腹同型半胱氨酸(Fhey)作为研究对象,而 负荷后同型半胱氨酸(Phcy)水平异常增高也是诊断 Hhcy的必要条件.本文探讨CBS基因突变,Phcy水平 及青年脑梗死之间的关系,以期为临床研究防治青年 . 本课题为天津市自然科学基金(编号:003606411) 0课题负责人及通信作者(E—mail:doctorzze@sina.cOlfl1.Cn) *天津医科大学第二医院神经内科(天津300211) 脑梗死提供思路. 1资料与方法 1:1对象根据1996年修订的全国脑血管病诊断标 准,选取2000年5月至2003年5月住院年龄?45岁且 Fhcy水平正常的急性脑梗死患者75名,其中男54名, 女21名,年龄29,45岁,平均42.4岁,均经头颅CT或 MR证实,并除外肝肾功能不全及甲状腺疾病;正常对 照组为52名,男39名,女l3名,并与病例组年龄及排 l6 除相匹配. 1.2方法 1.2.1血样采集与检测受试者(病例组均于发病3 天内)当日晨,均空腹抽取静脉血2mL,以2%的EDTA 抗凝,立即冰浴,I小时内离心,取血浆于一70%保存待 测.空疆采血后即口服【,蛋氨酸0.1kg(溶于200 mL橙汁中),服药后4小时再次取静脉血2mL,处理同 前.采用高效液相色谱法测定血浆Hey水平.根据 Fbcy,pI】水平分别超过正常对照组的水平95%参考 范围上限作为诊断l-Hmy的标准另取空腹血6ITIL (肝素抗凝)用于血脂及生化检查 1.2.2PCR-AI~MS分析取肘正中静脉血2mL,5% EDTA抗凝.用TKM法提取基因组DNACBS扩增I物 序列参考文献,由上海生物工程公司合成..FgSR反 直体系50,常规配制,扩增CBS基因的反应条件为: 94变性5rain,94?lmin,56.clmin,72?lrain,循环 3o次,72?延伸7rnin.l%琼脂糖凝胶电泳检查PCR 扩增产物,扩增目的片段大小为870bp. 1.3统计学处理用SPSS10.0统计软件包进行分 析,计数资料用y检验计量资料用均数?标准差表 示.采用,检验,Spearman相关及方差分析 2结果 2.1两组血浆Hcy水平,一般情况及相关性比较病 例组p}I负荷前后Hey水平的差值(AHey)和[ff,cy检 出率均显着高于对照组(P<0.01),病例组高血压者, CbinJNervMealDisVoI_3l.N0.2March2005 吸烟饮酒者高于对照组(P<O.05);空腹血糖(GLU), 甘油三酯(TG),胆固酵(Tc),低密度脂蛋白(LDL)水平 均显着高于对照组(P<0.01):见表J:SpeJmmm相关 分析结果示除Pllcy与性别具有相关性(P<0.05)外, Phev与其他危险因素均无明显相关(P>0.05). 2.2CBS基因扩增结果和基因型分析CBS基因扩 增的目的片断长度为870bp,分为纯和突变型C/C,杂 和型C/T及野生型1y见图1. I:nnOI~XXi(J;,j/’hHT蜉IH”‘f;4一,:’f』I;6, T,rwild目?H 1:~IM200(1;23:C/C型;4.5:(‘型:6.:n’I’ 图1G/~z,基因F’CR产树 2.3两组殛负荷后高同型半胱氨酸血症【PI?)与负 荷后非高同型半胱氨酸血症(M唧h】青年脑梗死患 者CBS基因型和等位基因频率分布病例维和PHhcy 青年脑梗死患者组CBS基因C/C,C/T基因型及C等 位基因型频率分布分别高于对照组和NP/~c)r青年脑 梗死患者组(P(001)见表2. Table10栅阳瘾E,I.0『Hand?舢彻fsctorsc州钟twogroups 表I两组血浆?时水平殛一般情况比较? )P(O.叭坤h?州group与lE常对照组比较.P(00【 Table2c0.Tqm悄onofCBS舯畸peandatl~letwog+mupsand’??and咖of睥t妇lts 表2两组殛PIn与NPIIh~-青年脑梗死患者CBS基因型和等位基因频率分布Cases例 P(O.01棚砷withtwo即与对照组比较p<c)fll2)P(001~]tmrPdwI山NPIp与NrH,,组比 较.P<O0 中国神经精神疾病杂志2005年第3l卷第2期 2.4两组CBS不同基因型I-Icy水平比较不论病例 组还是对照组,CBS的3种基因型Phcy水平改变存在 同一趋势,C/C型者Phcy水平依次高于C/T和rr/T型 者(P<0.01),在Fhcy组各基因型之间无差别(P> 0.05).见表3. Table3Ct朋p口ofadifferentgenetypeintwogroul~s 表32组a不同基因型Hcy水平比较 (4-S,tmlol/1) Groups 组别 Patientn123o33 病例组Fhey13.214-1.9012.934-2.72I2.75?2.96 Phcy65.O1?14.99.):)47.534-10.18”37.62?409 Controln21337 对照组Fhcy14.634-3.6812.834-2.9412.564-229 Phcy47. 754-2.09.J37. 454-2.78l】34.804-262 1)P<0.O1comparedwithT/Tgenetypeinsamegroup 与同组基因T/吓型比较,P<0.O1 2)P<0.O1comparedwithC/Tgenetypeinsamegroup 与同组基因C/T型比较,P<0.Ol 2.5PHhcy与NPI-tlhcy青年脑梗死患者a各基因 型tltcy水平比较PHhcy组,cBS基因C/C型者Phcy 水平显着高于C/T和rr/T型者(P<0.01),C/T型者高 于rr/T型者(P<0.05);NPHhcy组中,CBSC/C型者Ph— cy水平高于rr/T型(P<0.o5),C/T型者显着高于rr/T 型(P<0.01),见表4. Table4c,,mmris~ofCBsdifferentgenetype inPI珏lcyandNPHhcyofpatients 表4咖lcy与NPHhcy青年脑梗死患者a各基因型 tltcy水平比较(i?s,tlmol/l) 1)P<0.Olcomparedwith吓genetypeingroup 与同组基因T/T型比较.P<0.Ol 2)P<0.05co,~redwith吓genetypeingroup 与同组基因吓型比较.P<0.05 3)P<0.Olcomp,~withC/Tgenetypeinsarllegroup 与同组基因C/T型比较,P<0.Ol 3讨论 ll7 反映Hhcy与脑梗死的实际关系.因而提出诊断Hhcy 必须包括Fhcy和/或Phcy水平异常增高两种情况_4一. GriendR等…发现通过MLT,大约30%,50%Fhcy水平 正常的Hhcy得以诊断.我们研究发现经MLT后病例 组Phcy和?Hcy水平及Hhcy的检出率明显高于对照 组,进一步证实人群中存在着大量潜在的Hhcy患者, 仅表现为Phey水平异常增高. 在正常情况下,体内约50%的Hcy是经CBS催化 的转硫途径进行分解代谢.Fhcy水平正常而Phcy水 平异常的尚不完全十分清楚.CattaneoM等_5j 研究认为Phcy水平异常增加对转硫途径最敏感.CBS 基因有多个突变点,但以T833C突变最为常见.CBS 包含一个S一腺苷蛋氨酸(sAM)调节位点,SAM在协助 调节血浆Hcy维持在正常水平发挥重要作用,SAM对 CBS基因突变造成缺陷的酶激活作用明显减弱,MLT 后,尽管细胞内SAM水平增加,但有缺陷的CBS仍不 能把短时间内生成的大量Hcy清除,造成Phcy水平的 异常升高.我们研究发现不论病例组还是对照组,CBS 的3种基因型Phcy水平改变存在同一趋势,C/C型者 Phcy水平依次高于C/T和rr/T型者.同样青年脑梗死 PHhcy组,CBS基因C/C型者Phcy水平依次高于C/T 和rr/T型者;NPHhcy组,CBSC/C及C/T型者Phev水 平高于rr/T型.说明除营养因素外,CBS基因突变可 能是MLT后,特别是青年脑梗死患者Phcy水平异常增 高的遗传原因. CBS基因突变干扰了Hcy的正常代谢,间接通过 Hhcy,在一系列损害机制的作用下,继发缺血性脑血管 病的发生.本研究仅对CBST883C点突变进行检测, 发现病例组和其PHhcy组CBS基因C/C型,C/T型和c 等位基因型频率分别高于对照组和青年脑梗死NPhhcy 组,而正常rr/T型及T等位基因频率则低于这两组. 提示CBS基因突变可能是青年脑梗死发生,发展的一 个重要遗传危险因素,与国外KellyPJ等_8j的结论相一 致. 总之,CBS基因CBST883C突变可能是Phcy异常 升高的遗传原因及青年脑梗死的遗传危险因素.在疾 病预防工作中,对动脉硬化患者,特别是缺少传统的危 险因素的年轻患者,行MLT检查且进一步检测CBS的 基因型是非常必要.因此及早发现Phev水平异常升 高对缺血性脑卒中早期预防有着积极意义. 参考文献 既往多以Fhcy作为研究对象,而Fhcy尚不能完全 1vanderGfiendI/.HaasFJ.DI?nM,eta1.Monieloadti lI8 necessaryfordetectionofhyperhomocysteinemia.JLabClinMed,1998, 132(1):67. 2TsaiMY,HnsunNQ,SchwichtenbergK.eta1.Amplificationrefractory6 mutationsystemtoidenfi~mutationsincystathioninebeta??synthasedeft.. ciency.ClinChe~n.1995.4l(12):l775. 3GrahamIM,DalyLE,RefsumHM.eta1.Plasmahomocysteineasarisk7 factorforvasculardisease.TheEuropeanConcertedActionPr0_iect.JA. MA.1997.277(22):1775. 4KristensenB,MaimJ.NilssonTK.eta1.Hyperhomocysteinemiaand8 hypofthrinolysisinyoungadultwithischemicstroke.Stroke,1999,30 (5);974. 5deJongSC,StehouwerCD.VandenBergM.eta1.Determinantsoffast. ingandpost’methioninehomecysteinelevelsinfamiliespredisposedtohy一 (上接第l14页) 2讨论 颅内胆脂瘤也称表皮样囊肿或珍珠瘤,是源自异位胚胎残留 的外胚层组织,具有沿颅底向蛛网膜下腔,脑的裂隙部位葡行性 生长的特点,临床症状常在肿瘤较大,广泛延伸时才出现l2一,形 态多不规则,如没有良好的照明,手术难以全切除肿瘤,术后无菌 性脑膜炎的发生率高,主要是由于瘤内容物进入蛛网膜下腔或脑 室内刺激脑组织引起,其发生率为10%,40%_】一,可致术后蛛网 膜下腔出血和脑积水,严重者可导致患者死亡.随着手术显微镜 的应用,提高了颅内胆脂瘤的全切率.但即使在显微镜下也会存 在难以达到的死角,而或多或少地残留部分病灶_4一.特别是位于 鞍区和颅中窝向颅后窝,颅前窝广泛延展的胆脂瘤,由于该区汇 集了颅底动脉环,多组颅神经,视交叉,下丘脑和垂体柄乃至脑干 等重要生命结构,手术难度和危险性均较大,显微镜下常难以看 到肿瘤的全貌,若勉强牵拉,将增加脑组织损伤及术后反应.近 年来神经内镜已越来越广泛地应用于临床,国内外均有文献报 道l4利用神经内镜扩大手术视野,消除手术的死角,有利于增加 颅内胆脂瘤的全切除率.本组l4例均在显微镜下切除绝大多数 瘤体后,导入神经内镜(30.或70o观察镜)探察术区显微镜下难以 发现的病灶死角,有效地弥补了显微镜照明的不足,增加了肿瘤 的全切率,减轻手术创伤,增加了手术的安全性. 因鞍区蛛网膜下腔形成多个脑池,存在多个自然间隙l6,肿 瘤常沿蛛网膜下腔从一个脑池蔓延到另一个脑池,而常会包裹该 区的神经和血管如:视神经,动眼神经和颈内动脉及其分支.因 此,在鞍区胆脂瘤切除术中,要仔细解剖该区脑池.术中常见蛛 网膜增厚,应仔细辨认,最好行锐性分离,而不要钝性牵拉,以免 造成神经,血管损伤.对从鞍上池向颅前窝生长的胆脂瘤可采用 单侧或双侧额下入路,先切除颅前窝的肿瘤,位于鞍上池的肿瘤 常从神经,血管下方生长,将神经,血管上抬,切除肿瘤时,可用剥 离子或小号刮匙镊子从神经,血管的一边分离,推送,从另一边用 吸引器将肿瘤吸出;对向颅后窝生长至脚间池,环池和桥小脑角 池上部者,通过额颞入路解剖侧裂池和颈内动脉周围池,轻轻牵 开额叶,显微镜下即可将肿瘤绝大部分切除,然后置入神经内镜 观察,消灭显微镜下手术区的死角.因胆脂瘤缺乏血运.在神经 内镜下可以将肿瘤内容物全部清除.但剥离肿瘤包膜时要十分 轻柔,细心,对与脑于或重要神经,血管粘连紧密的部分,宁可残 留,不宜勉强剥离,可用双极弱电流下电凝破坏包膜内面的鳞状 上皮层,以免导致严重并发症.对颅中窝向鞍旁和颅后窝生长 ChinJNervMentDisVo1.31.No.2March2005 perhomocysteinemiaandprematurevnsc~ardisease.ArterinsclerThromb VnscBiol,l999,19(5):l316. 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(收稿日期:20O4—07—07) (责任编辑:林平) 者,也可采用额颞入路,但向颞下生长较多者.宜采用颞下入路. 在切除肿瘤时,应注意用脑棉片保护防止瘤内容物沿蛛网膜下腔 扩散,适当用含地塞米松的生理盐水反复冲洗,有利于将瘤内容 物清除干净,可有效防止术后无菌性脑膜炎的发生.但有时因肿 瘤位置深在,难以用脑棉片将周围蛛网膜下腔完全保护起来,仍 可能有少量瘤内容物进入颅后窝的蛛网膜下腔.术后放置引流 管和及时反复腰穿释放脑脊液或行腰穿置管脑脊液持续体外引 流有利于清除可能流入蛛网膜下腔的瘤内容物,减轻对脑膜和脑 组织的刺激,防止无菌性脑膜炎的发生.本组l4例由于肿瘤内 容物切除彻底,术中尽可能避免肿瘤内容物流入蛛网膜下腔和应 用地塞米松生理盐水反复冲洗,以及术后放置引流管2448h, 必要时延长至72h,拔除引流管后及时反复腰穿或腰穿置管脑脊 液持续引流,均未发生无菌性脑膜炎. 术中使用神经内镜观察和切除残瘤时,须通过显示器监测来 间接观察肿瘤,进而用适当的手术器械来切除肿瘤,因此需要熟 悉神经内镜视野并有熟练的内镜下手术操作技巧,一般需要有经 验的神经外科医师才能完成.但随着神经内镜外科技术的发展, 这一神经外科前沿技术将被越来越广泛地应用于神经外科临床. 参考文献 l吴承远,刘玉光主编.临床神经外科学.第l版.北京.人民卫生 出版社.2001,362,368. 2VincbonM,PertuzonB,LejeuneP,eta1.Intraduralepidermoidcystsof thecerebellopontineane:diagnosisandsurgery.Neurosurgery,1995,36 (1):52. 3惠旭辉,毛伯镛,何能前.桥小脑角上皮样囊肿34例临床分析. 中国神经精神疾病杂志,2001,27(1):68. 4张亚卓,王忠诚,刘丕男,等.神经内镜辅助显微外科治疗颅内胆 脂瘤中华神经外科杂志,2001,17(4):201. 5CarvalGA,CasvioA,MatthiesC.eta1.Subarachnoidfatdissemination afterresectionofacerebellopontineangledysontogeniccyst:casereport andreviewof山eliterature.N.eumsurrv,2OO0,47(3):760. 6Y~rolMG,KasdaglisK,JainKK,eta1.Anatomicalobservationofthe subamchnoidcisternsofthebrainduringsurgery”.JNeurosurg,1976,44 (3):298. 【中图分类号】R739.41 I文献标识码】A (收稿日期:2OO4—06一l8) (责任编辑:甘章平)