肝组织白蛋白基因RT-PCR检测

肝组织白蛋白基因RT-PCR检测 小鼠肝组织白蛋白基因、葡萄糖醛酸基转移酶基因RT-PCR 检测 (管冬元 梁超) 一(材料与试剂 DEPC 处理水 用DEPC 处理水配制的75%乙醇(分析纯) 氯仿 异丙醇 Tizol (Gibco BRC公司) M-MuLV(200U/ul) Taq polymerase(5U/ul) RNAsin (40U/ul) DNTP(each 10mM)) DNA marker (each 100bp, 100-1000bp) EB(2mg/ml ) 5×TBE 琼脂糖 小鼠白蛋白基因的上、下游引物 随机引物50uM 兰、黄枪头(进口) 0.5ml 1.5ml 离心管 (进口) 冷冻台式离心机 电动匀浆器及匀浆管 20，200，1000ul移液器 剪、摄等手术器械，筒纸，电子天平，量筒 真空干燥器 -20?及-70?冰箱 752分光光度计及石英比色皿 PCR仪 电泳仪，照像机，胶卷 肝组织 实验过程 (一)RNA抽提 ,(取肝组织50mg，剪碎，加入1ml Trizol液，快速电动匀浆。 ,(22?， 静置5min ,(加入氯仿0.2ml，颠倒15s ,(22?，静置3min ,(离心:4?，15000转/分×15min ,(取上清液0.5ml ,(加入0.5ml异丙醇，混匀 ,(22?，静置10min ,(离心:4?，15000转/分×10min ,,(弃上液 ,,(加入1ml 4? 75%乙醇 ,,(离心:4?，10000转/分×5min 1 ,,(弃上液，真空干燥5min ,,(用25ul水溶解，-70?保存。 (二)反转录(,,) 5*buffer 4ul dNTP(10mM) 2ul 随机引物(100ug/ul) 1ul DTT(100mM) 1ul RNAsin(40U/ul) 1ul 总RNA(2ug) 2ul 水 至18ul 15号程序: 65?，5分钟;冰上，加RNAsin 1ul，M-MLV 1ul。37?60分钟，94?5分钟。-20?保存。 (三)PCR PCR反应体系: dNTP(each 0.5mM) 2ul 10×buffer 4ul MgCl (25mM) 4ul 2 上、下游引物(4uM)各 1ul RT产物 4ul Taq酶 0.4ul 加水至 40ul PCR反应条件(运行33号程序)为:94? 3min ?94? 40s，55? 1min，72? 1min，30个循环?72? 5min?4? 保存 (四)电泳 1(制作电泳凝胶模具 ,(电泳缓冲液:1×TBE 250ml ,(作1.4,琼脂糖凝胶(60ml) 双蒸水 48 ml 5×TBE 12ul 琼脂糖 0.84g 煮沸，冷却至60?左右，加: EB 3.5ul 混匀，灌胶 ,(制备样品，取20ul PCR样品，加4ul加样缓冲液，混匀，依次上样:DNA marker 6ul，正常组 24ul，模型组 24ul，治疗对照组 24ul ,(电泳:80V，0.5-1小时 ,(紫外灯下观察目标基因片段，并拍照。 附参考文献: 1、《分子克隆》第二版 2、李永明, 赵玉琪. 实用分子生物学方法手册. 第一版. 北京: 科学技术出版社, 1998, 274~291 2