[doc格式] 机织涤纶人工血管热交联胶原涂层及实验研究

[doc格式] 机织涤纶人工血管热交联胶原涂层及实验研究 机织涤纶人工血管热交联胶原涂层及实验 研究 中国分子心脏病学杂志2008年12月第8卷第6期(总第43期357 . 临床研究. 机织涤纶人工血管热交联胶原涂层及实验研究 黄福华孙立忠郑军 【摘要】目的目前临床广泛使用的涂层人工血管由于使用具有细胞毒性的交联剂如乙醛和 甲醛,植入体内可带来一些副作用从而影响人工血管的愈合.为减少这些不良后果的发生,作者进行 了热交联胶原涂层的机织涤纶人工血管的实验研究.材料和将牛胶原蛋白浸渍涂层涤纶人工 血管内外壁并使用热交联固定,通过血管壁渗水率,形态学以及力学性能等体外试验评价热交联胶原 蛋白涂层人工血管是否达到人工血管植人前.结果结果显示未涂层人工血管管壁渗水率在经 过胶原蛋白涂层和热交联后降低了99%,达到了植入时不漏血的目的.胶原蛋白涂层占重(297-4-23 mg/g)较InterGardTN血管的涂层重量(313?25mg/g)稍低一些.结论本 研究初步证实热交联胶 原蛋白涂层人工血管可操控性好,渗水率低.同时在体外具备良好的 生物降解性能. 【关键词】胶原蛋白;人工血管;热交联;渗水率 AWovenPolyesterVascularProsthesisCoatedwithCollagenbyThermallyCrosslinkingHUANG Fu—hua,SUNLi-zhong2,ZHENGJia.DepartmentofThoracicandCardiovascularSurgery,NangCar- diovascularDiseaseResearchInstitute,NanjingFimtHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nan一 ,210006;DepartmentofCardiacSurgery,CardiovascularInstituteandFuWaiHospital,CAMS&PUMC, Beijing,100037 【Abstract】 ObjectiveIthasbeenreposedthatcoatedvascularprosthesescommonlyusedinvascu— larsurgeryhadsideeffectsduetotoxicityofthecrosslinkerssuchasglutaraldehydeandformaldehyde.To diminishundesirablesideeffectsofchemicalcross—linkingofbiodegradabl ematerials,theauthorsdesigneda wovenpolyestervascularprosthesiscoatedwithcollagenbythermallycrosslinking(theWCT—graft). MaterialsandmethodInthisstudy,aporouswovenpolyester(Dacron)graftwascoatedwithcollagen suspensionbythermallycrosslinking.Then,itwasinvestigatedinvitrotoevaluateitspotentialforuseasa newvasculargraftimpervioustoblood.Forinvitroinvestigation,thewaterpermeability,coatingweight, morphology,andmechanicalpropertiesoftheWCT—graftwerecomparedt othoseofcontrolandcommercially availablecollagen?coated(InterVascular@)grafts.ResultsThewaterpermeabilityofthecontrols(381.4 mL?cm一.rain一 at120mmHg)wasreduced>99%bycollagenimpregnation,rendenngthegraftim— pervioustoblood.Thecoatingweightofthecollagenwas297?23mg/gofgraft.producingaslightlylower valuethanthatoftheInterGardTNprosthesis(313?25mg/g).ConclusionThisstudydemonstratedthat theuseofabiodegradablecollagenasbiologicalsealantandcrosslinkedthermallycanbeafeasibleapproach toprepareimpervioustextilearterialprostheses. 【Keywords】 Vasculargraft;Collagen;thermallyCrosslinking;Waterpermeability 血管外科使用涤纶编织的人工血管已有五十余 年的历史,效果确实,经久耐用,.这些人工血管 的管壁通常保持有不同程度的孔隙率,便于受体组 织侵入生长,包裹血管假体并促其愈合.但充满孔 作者单位:210006南京医科大学附属南京第一医院南京市心 血管病研究所心胸外科(黄福华);100037北京,中国医学科学院 北京协和医学院阜外心血管病医院血管外科中心(孙立忠,郑军) 通讯作者:郑军Email:dr.zhjun@yahoo.eom.cn 隙的人工血管植入时可导致大量的血液从管壁渗漏 至组织间隙.这一缺陷可采用术中使用自体血预 凝或可降解的生物材料预先涂层密封管壁孔隙来 解决.植入自体血预凝的人工血管可致术中,术后 失血较多,增加输血导致传播肝炎病毒或HIV病毒 的风险.因而目前临床上运用多为商业化涂层人工 血管,即通过采用白蛋白,明胶或胶原涂层的涤纶人 工血管.然而有学者报道这些涂层人工血管由 于使用的化学交联剂如甲醛或戊二醛具细胞毒性作 358 用,植人体内后可带来一些副作用从而影响人工血 管的愈合.为克服这些缺陷,我们进行了热交联胶 原涂层机织涤纶人工血管的研制(WCT.graft),并通 过体外实验来评价热交联胶原蛋白涂层人工血管作 为新的血管假体是否具备良好的操控性能,不漏血 和生物可降解性能,达到可植入目的. 1材料和方法 1.1热交联胶原蛋白涂层机织涤纶人工血管的 制备:胶原蛋白提取过程:小牛跟腱通过机械粉碎, 清洗,化学处理等诸多程序,最终得到均匀,白色糊 状含98%纯度的胶原蛋白,并均通过致热源物质, 细胞毒性和抗原性试验(购自北京益而康生物有限 公司). 多孔机织涤纶(Dacron)人工血管,直径8mm, 管壁厚度为0.42mm,在120mmHg压力下渗水率 为381?12.3mL/cm?min(阜外心血管病医院血 管外科中心设计制备).为避免涂层过程中沾染杂 质,操作在密封消毒塑料袋中进行.将人工血管与 注满胶原蛋白悬浮液的50ml注射器相连接,同时通 过三通连接器与一容器相连,容器内盛有胶原蛋白 和甘油按比例配制的悬液.胶原蛋白悬液通过注射 器加压推入血管假体内腔,多余悬液从管壁孔隙渗 漏至容器中.按上述程序反复操作3,5遍后,将胶 原蛋白涂层人工血管置于真空箱中干燥后再于 110%一118%条件下交联15,18h.制备完毕的热 交联胶原蛋白涂层人工血管行环氧乙烷熏蒸消毒备 用. 同种织物及编织方法的未涂层的InterVascu- lar~人工血管和经化学交联胶原涂层的InterGardTM 人工血管(InterVascular公司,法国)作为体外试验 的对照组. 1.2体外实验 1.2.1形态学观察:人工血管内外结构在胶原 蛋白涂层前后采用电子显微镜观察(JSM-5510型, 日本).标本表面喷洒铂金固定,提高传导便于对人 工血管织物的纱线结构和胶原蛋白浸渍处理后的血 管壁征象的观察. 1.2.2渗水率测定:渗水率通常与人工血管的 孔隙率有关,我们依据Guidoin等描述的方法建立 渗水率测试台来测定人工血管的渗水率.分别测定 热交联胶原蛋白涂层组,未处理组和化学交联胶原 涂层组人工血管的渗水率并进行比较. MolecularCardiologvofChina,December2008,Vo1.8No.6(SerialNo.43 1.2.3涂层材料的占重:采用重量的方法 测定热交联胶原蛋白涂层人工血管的涂层材料的占 重,剪取5根1cm长的胶原蛋白涂层人工血管标本, 蒸馏水冲洗干净后冷冻干燥称重(W1),然后置人 5%的碳酸钠溶液加热搅拌3分钟后蒸馏水反复冲 洗.随即在室温下次氯酸钠液中反复漂洗3,5遍, 然后再次用蒸馏水反复冲洗干净,随后冷冻干燥称 重(W2).涂层材料的占重依据下列公式计算:涂层 材料占重=(W1一W2)/W2.采用同样的方法测定 化学交联胶原涂层人工血管(InterGard州)的涂层材 料占重. 1.2.4涂层材料的降解试验:根据早先关于胶 原蛋白在体外降解率测试方法的报道,对人工血管 的热交联胶原蛋白涂层体外降解速率进行比重分 析.分别测试热交联胶原蛋白涂层在.糜蛋白酶 (EC3.4.21.1,SigmaUK),胶原蛋白酶(EC3.4. 24.3,SigmaUK)和蛋白酶XIV(EC3.4.24.31, SigmaUK)溶液中的降解速率.将上述蛋白酶分别 溶于0.05M的磷酸钠缓冲液中(pH7.0),保持酶 浓度为1.0U/ml.长约1am的人工血管冷冻干燥 后称重(G1),随即浸泡于蛋白酶溶液中,每种酶溶 液中放置6段人工血管,溶液温度通过水浴保持在 37%左右.作为对照,在无蛋白酶的磷酸盐缓冲液 中也放置6段长约1cm的人工血管.在放置后1, 3,6,9,12和15d分别取出一段血管假体,蒸馏水冲 洗干净后冷冻干燥称重(G2).根据涂层材料占重 试验测得的比重数据算出原先每段人工血管所含涂 NN:N:(w3:G1×—W1-W一2) ,然后依据下列公式 Wl 计算降解比例:涂层材料降解比例=(G1一G2)/ W3. 1.2.5力学性能:分别测试血管假体热交联胶 原蛋白涂层前后的横向和纵向抗拉强度.采用万能 材料试验机(Model4302;InstronCo.,英国)进行测 定比较,在十字夹头夹持下以10cm/min的速度移 动.每个标本测定在断裂时纵向的和横向的抗拉 力. 1.3统计学处理:用SPSS11.0软件进行资料的 统计学处理,各项数据采用均值?标准差的形式表 示,组问比较采用One—wayANOVA检验方法,P< 0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1热交联胶原蛋白涂层机织涤纶人工血管的 t】目分子心脏病学杂志2008年12月第8卷第6期(总第43期 制备:经热交联胶原蛋白和甘油混合悬液涂层的人 工血管与化学交联胶原涂层InterGard人工血管相 比,稍硬一些,但湿润后即保持良好的顺应性和弹 性,植人时操控性满意.人工血管经热交联胶原蛋 白涂层后在肉眼观察与未处理组相仿,唯一不同是 涂层后的血管假体壁皱褶有轻微的扩张(见图1). 图I热交联胶原蛋白涂层和对照组未涂层人 工血管 ?? ?幽图2热胶原蛋白涂层人工血管电子扫描照 片:(A)涂层前内壁(B)涂层前外壁(CJ涂 层后内壁(D)涂层后外壁 2.2体外实验: 2.2.1形态学观察:图2显示血管假体在热交 联胶原蛋白涂层前后的扫描电子显微镜观察结果. 热交联胶原蛋白涂层的人工血管内外壁均显示胶原 蛋白均匀一致交联在织物的纱线周围.在高倍电镜 下可以观察到涂层面的胶原蛋白光滑平整. 2.2.2热交联胶原蛋白涂层人工血管渗水率, 涂层材料重量和力学性能:表1比较了未涂层的对 照组,热交联胶原涂层的对照组和化学交联胶原蛋 白涂层组人工血管的渗水率和涂层材料的占重.热 交联胶原蛋白涂层使人工血管的渗水率(381.4? 12.3ml/min?Clll在120mmHg压力下)降低了近 99.9%.热交联胶原蛋白涂层的人工血管的涂层材 359 料占重297?23mg/g,比化学交联胶原涂层的血管 假体(313?25mg/g)稍低,但无统计学意义(P> 0.05).热交联胶原蛋白涂层人工血管的纵向抗拉 强度较未涂层对照组和化学交联胶原涂层组稍高, 但无统计学差异(P纵向=0.614,P横向=0.781). 2.2.3热交联胶原蛋白涂层材料降解情况:人 工血管热交联胶原蛋白涂层材料浸泡在各种蛋白酶 溶液及磷酸缓冲液中1d后即降解至原先重量的 65%.随后,胶原蛋白在不同酶溶液中降解速率开 始产生差异.7d后浸泡在蛋白酶XIV,胶原蛋白 酶,仅.糜蛋白酶和磷酸钠缓冲液中的胶原蛋白降解 比例分别为97%,90%,75%和63%(见图3). 图3热胶原蛋白涂层材料在各种酶溶液中降解情况 标本浸泡于(×)磷酸缓冲液(PBS),(?)d一糜蛋白酶(o【-chy- motrypsin).(口)胶原蛋白酶(collagenaseIA),或(?)蛋白酶 XIV(proteaseXIV),各酶溶液通过水浴保持在37~C左右.纵轴 表示降解后剩余的涂层材料比重. 3讨论 随着国民生活水平的提高,血管疾病发病率在 逐年上升.目前,人工血管置换病变血管是治疗这 类疾病最为直接有效的手段之一.国内一直未能自 主生产免预凝的涂层人工血管,因此各医疗机构使 用的人工血管95%以上为欧美进口商品,以美国 Meadox公司和法国Intervascular公司涂层涤纶人工 血管为主.这些人工血管多采用明胶或胶原涂层, 甲醛或戊二醛交联固定J.然而有学者报道这 些涂层人工血管由于使用的化学交联剂如甲醛或戊 二醛具细胞毒性作用,植人体内后,交联剂逐步释 放,对周围组织产生毒性作用,从而影响人工血管在 受体内的生物愈合?”.为克服这些缺陷,我们进 行了热交联胶原涂层机织涤纶人工血管的研制 (WCT.graft),这是涂层人工血管国产化的一次尝 MolecularCardiologyofChina,December2008,Vo1.8No.6(Seria1No.43 表1渗水率,涂层材料占重和抗拉强度 注:在120mmHg压力下测试标本置人测试台后第1rain的平均渗水 率 试,目的是为血管外科医师提供一种新的弹性佳,顺 应性良好,植入不需自体血预凝且不漏血的涂层人 工血管,同时必须确保涂层材料及涂层操作不影响 人工血管的操控,缝合和机械性能.在实验中我们 发现热交联胶原蛋白涂层的人工血管渗水率低,缝 合性能和操控性良好,在体外具备良好的生物降解 性能,达到了人工血管的植入前标准. 涂层材料胶原蛋白是一种天然蛋白质,由牛跟 腱提炼而得.作为一种生物材料,胶原蛋白具备生 物相容性良好,血液相容性好和可降解性等特 点’’l.在本研究的体外实验中,人工血管胶原蛋 白涂层材料浸泡在各种蛋白酶溶液及磷酸缓冲液中 1d后即降解至原先重量的65%.随后,胶原蛋白在 各种酶溶液中的降解速率有所不同.但7天后,浸 泡在蛋白酶XIV中的胶原蛋白降解比例为90%,由 此可见胶原蛋白涂层材料在体内应具备良好的生物 降解性能. 而且许多实验证实了胶原蛋白具备较好的生物 相容性,可降解性和无毒性.可用来作药物释放的 载体,细胞培养基和组织工程材料.在本研究中胶 原蛋白涂层并热交联后,在干燥状态下人工血管与 未处理的InterVascular~血管相比管体稍硬,弹性差. 但浸泡生理盐水后血管弹性改善,顺应性良好,操控 性满意. 临床要求替换病变血管的人工血管在植人中和 植人后必须不漏血,同时在体内必须愈合良好,经久 耐用且管腔长期不扩展.首先,人工血管的渗水 率不能超过50ml/min?cm,否则将导致出血难以 控制.在我们的实验中热交联胶原蛋白涂层的人工 血管渗水率仅为0.96?0.34ml/min?cm,与化学 交联胶原涂层的人工血管相比无显着性差异.其 次,人工血管涂层后不能影响人工血管的力学性能. 本实验证实热交联胶原蛋白涂层血管假体的力学性 能(纵向和横向抗拉力强度)与对照组相比无明显差 异,表明实验中胶原蛋白涂层和交联等操作没有损 害血管假体的机械性能.另外,热交联胶原蛋白涂 层材料人工血管的涂层材料所占比重要低于传统的 化学交联胶原涂层人工血管,从经济学角度考虑较 为有益. 本实验初步证实运用具生物降解性能的胶原蛋 白作为人工血管涂层材料并通过热交联固定可以制 备新的不漏血的血管假体.热交联胶原蛋白涂层的 人工血管与未涂层的涤纶血管相比,优点是渗水率 低,达到植入时不用预凝,节省手术时间,减少输血 风险的目的.与传统的化学交联胶原蛋白涂层人工 血管相比,它提供了较易处理和交联的操作程序,避 免了使用具有细胞毒性的醛类化学药品作为交联 剂.进一步评价热交联胶原蛋白涂层人工血管的生 物相容性和实际使用效果还需更详细和深入的动物 和临床试验. 参考文献 1Yates,S.G.,eta1.,Thepreclottingofporousarterialprostheses. 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