积雪草挥发油气相指纹图谱的研究（可编辑）

积雪草挥发油气相指纹图谱的研究（可编辑） 积雪草挥发油气相指纹图谱的研究 泸州医学院 硕士学位论文 积雪草挥发油气相指纹图谱研究 姓名:王芳 申请学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:张开莲 20090401 积雪草挥发油气相指纹图谱研究 摘要 目的:采用气相色谱法对积雪草挥发油化学成分指纹图谱进行研究， 建立积雪草挥发油的气相指纹图谱标准，用于积雪草药材挥发油的质量 控制，并为雪抑乐质量标准的制订提供依据。:采用水蒸气蒸馏法 提取积雪草挥发油。利用气相色谱法测定积雪草挥发油指纹图谱，通过 考察不同条件下的分离效果，优选色谱条件:色谱柱的选择，柱温或程 序升温模式，载气流速，进样量;考察供试品溶剂对测定的干扰;并进 一步考察指纹图谱的稳定性、精密度、重现性，最终确定积雪草指纹图 谱分析的气相色谱条件。按所确定的色谱条件和测定方法，对积雪草所 含挥发油成分的气相色谱指纹图谱进行研究。先后对10批积雪草药材供 试品进行GC检测分析，以石竹烯为参照物，按“中药注射剂指纹图谱研 究的技术要求’’计算相对保留时间及峰面积比值，标定共有指纹峰，并 对lO批药材进行相似度比较。结果:优选出的色谱条件为:色谱柱: 分流比:l:10;燃烧气:氢气，流量40ml,min;助燃气:空气，流量 对测定无干扰。方法学考察结果:精密度试验共有峰的相对保留时间、 相对峰面积的RSD为O,2(78,，重现性试验共有峰相对峰面积、相对保 留时间的RSD为0(02,,2(81,，供试品在8小时之内检测稳定，共有 峰 的相对保留时间、相对峰面积的RSD为O(0l,,2(80,。对10批积雪 草 药材供试品进行GC检测分析，积雪草GC指纹图谱中共有32个共有峰，共 有峰峰面积总百分含量为91(62?9(12。10批药材的GC指纹图谱相似度 发油中各组分达到较好分离效果，精密度、重现性、稳定性良好。10批 药材的GC指纹图谱相似性高，所建立的GC指纹图谱标准符合国家指纹图 谱技术要求，可用于积雪草药材挥发油的质量控制，并为雪抑乐质量标 准的制订提供依据。 关键词气相色谱;积雪草;指纹图谱 ontheGC Study ofCenteHaasiatica L( Urb?? Fingerprint Abstract the GCto outtheresearchintothe of Objective:Bycarry Fingerprint volatile oilinCentella the to standardof establishthe Asiatica L( Urb(，and volatileoil GC oilinCentellaasatica by volatile Fingerprint(Method:The extracted L( Urb(was wet ofthe by distillation(ByGC，theFingerprint volatileoilin Centella determined(Theeffects asatica L( Urb(was separate underdifferent conditionswere studiedSO as to the optimize chromatographic the column， the condition,includingchromatographic column orthe flowrateofthe temperature programmedmode，the heating carrierand gas the size(Theinterventionofthe wasalso sample sample wellasthe studied，as ofthe stability，precision，reproducibility Fingerprint， which the enableddetermination ofthefinal conditionof chromatographic the toCentella tO Fingerprint Asiatica L( Urb((Accordingthe(optimized and condition ofthevolatile chromatographic method，the assay Fingerprint oilinCentella asthe Asiatica L( Urb。was studied(Takingcaryophyllene reference 0batchesofCentella materia,，1 Asiatica L( Urb(wasassayedby therelativeretention GC，and timesand ofthe area proportionalitiespeak was commonweremarkedand the calculated，thepeaks among compared 10 totheTechnical forthe Research according Requirements Fingerprint intoChineseCrude conditionswereasfollows: Drug(Results:theoptimal column:HP一5Ms chromatographic quartz capillary column for 4C thefirst5 to1704Cat rateof temperature:90 min，up the 8 to250?attherateof 2 10"C,min，formin，thell 50C,rnin，formin; the up carrier rate gas:hi曲purenitrogen，flow1(2ml,min O(12Mpa ; rate ratio:1:1 supplementary 0; gas:nitrogen，flow40ml,min;split 3 combustion rate air:hydrogen，flow gas: rate atr,flow 500ml,min;detector:FID，detector270?， temperature vaporizertemperature size:lul(Petroleum 235?;sample ether 30,60。 c was chosenassolvent(Resultstothe RSD of methodology the study:the relativeretentiontimeandthearea ofcommonwas肚2(78,in peaks the the precisiontest，0(02,~2(81,in test;0(010,o, 2(80,inthe reproducibility thatthe stablewithin test，which 8hours( stability signified samplestayed Tlle ofthe10bathesofCentella that Fingerprint there were32commoninthe the addedareaof peaks chromatogram,and which covered91(62--b9(12intotal GC methodestablishinthis can analytical studyfinely the separateingredients inthe volatileoilinCentella the asatica L( Urb(，and precision， and were 0batches reproducibilitystability ofCentellaasatica satisfying(1 the L( Urb(showed establishedstandardfortheGC highsimilarity，and Canmeetthe fromthe Callbe Fingerprint requirementguidance，thus applied tocontrolthe ofCentella to a asatica L( Urb(，meanwhile quality provide basisforthe the ofXueYile( standardof quality KeyWords:GC;Centella asiatica L( Urb(;Fingerprint 4 泸州医学院毕业硕士研究生 学位论文独创性声明及发承诺书 本人声明所呈交的学位论文 已整理成发表形式 是我个人在泸卅f医学院导师指 导下，由导师及泸州医学院提供一切科研条件的情况下进行的研究工作及取得的研究 成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机 构已经发表 或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。在即将毕业离校之际，本人郑重承诺:该论文将以泸州医学院 的名义发表 论文作者为研究生及导师，作者所在单位为泸州医学院 ，并在发表后立 即将发表论文原件 期刊 寄与导师1册。 学位论文作者签名:易荡 导师签名: 劢,g-芭 日期: 劫叩年f月牛E1 日期:猡唧年岁月哆Et 泸州医学院硕士学位论文版权使用授权书 本人完全了解泸州医学院有关保留、使用学位论文的规定，即:泸州医学院有 允许论文权保留并向有关部门或机构送交本人学位论文的复印件和电子版，被查阅和 借阅，允许有关部门或机构以电子出版物形式出版发行，并对外进行全文内容服务。 本人授权泸州医学院可以将本人学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，进行数字化处理汇编、通过网络或其它途径进行交流传播，可以公布学位论文的 全部或部分内容，可以采用影印、缩印、扫描或其他复制手段保存和汇编学位论文， 即泸州医学院具有本人学位论文的数字化制品复制权、信息网络传播权和汇编权。 保密口，在――年解密后适用本授权书。 本人提交的学位论文属 不保密‖ 请在以上方框内打“?” 学位论文作者签名:乏鸳 导师签名:弓矽再考 日期:刃4矿年箩月?日 导师签章: 地址及邮政编码: 日期:参彳年罗月,-k日 : : 电子信箱: 前 言 积雪草Centellaasiatica亿(,jUrb为中国药典一部收载的常用中 药材，为伞形科积雪草属植物积雪草的干燥全草，别名雷公根，铜钱草 或崩大碗，广泛分布于南、北半球热带和亚热带地区，主产于印度、马 来西亚、南非、印尼等国n1。我国仅产一种积雪草，主要分布于长江流 域以南各地。在我国将积雪草作为传统植物药治病已有数千年的历史， 中国药典明确记载积雪草具有清热利湿、解毒消肿的功效，主治湿热黄 疸、中暑腹泻、砂淋血淋、痈肿疮毒、跌扑损伤。现代药理学研究发现 积雪草有着多方面的药理活性，如具有抗胃溃疡、抗抑郁、抗细胞毒素、 抗麻风、抗菌、抗丝虫、抗结核、促进伤口愈合等作用瞳1。其中积雪草 抗抑郁方面的作用已引起人们的重视?“3。我院正在研发的抗抑郁新药 ――雪抑乐，既是以积雪草的提取物为原料制成的全新制剂。 进入21世纪，中医药发展面临着前所未有的机遇和挑战。由于中国 医药市场在加入WTO后，更直接面临激烈的竞争，原有传统中药产业的 产品、管理和科技水平与国际医药主流市场的标准和要求存在较大的差 距，同时还受到亚洲国家以及一些西方国家在研究和开发传统医药上的 巨大威胁，因而中医药所面临的挑战是十分严峻的。但作为世界优秀传 统医药文化，中医药具有系统的理论体系、独特的诊疗方法、显著的临 床疗效，已被越来越多的国家和地区所认识，这将有利于中医药的进一 步发展。 中药材是一种特殊商品，在中药产业体系中，即是原料药也是成品， 因而中药材生产的规范化及质量的标准化是中药现代化的基础和关键。 中药材质量的好坏通常采用有效成分测定的方法进行评价。可是中药含 有大量的化学成分，仅选择药材中的某一活性成分或指标成分作为监测 的目标进行质量控制并不能准确地反映药材质量的优劣。因此如何全面 地评价中药和中药制剂的质量一直是中药现代化的难点。目前，利用综 合的质量评价模式从分解式的单一成分的“微观分析”向群体成分的“宏 观分析"发展已经初步形成。利用各种有效的分析手段，如光谱、柱色 谱、平面色谱、“微观”与“宏观”相互结合和补充是更有效的评价中药质 量的模式。其中，色谱指纹图谱分析将是鉴别中药真实性及评价质量一 致性和产品稳定性的较有研究价值的模式。中药指纹图谱可以准确地鉴 别药材地真伪，还可以提供量化信息，借以估计中成药中所含某一药材 的投料情况以及生产、贮藏过程中该药材整体成分的稳定性。 中药指纹图谱是指某种中药中所共有的、具有特异性的某类或数类 成分的色谱或光谱的图谱，用以鉴别其真伪或产地，评价原料药材、半 成品和成品质量均一性和稳定性。通过指纹图谱的特异性，能有效鉴别 样品的真伪与产地;通过指纹图谱主要特征峰的含量或比例的制定，能 有效控制样品的质量，确保样品质量的相对稳定，在有效成分不完全明 确的前提下，制订中药的特征指纹图谱，对于有效控制中药的质量，具 有重要的意义陌3。 目前指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有 效手段，美国FDA允许草药保健品资料可以提供色谱指纹图鉴别资料， WHO在1996年草药评价指导原则中也有规定，如在:“plantpreparation” 及“finishedproduct”的章节中提到如果不能鉴别有效成分，则鉴别一 种或几种特征成分 如色谱指纹图 以保证制剂和产品质量的一致;欧共 体在草药质量指南的注释中提到草药的质量稳定性单靠测定已知的有 效成分是不够的，因为草药及其制剂是以其整体作为有效物质。我国对 中药材指纹图谱的研究虽然起步较晚，但也取得了较大的成绩，近几年 有关中药指纹图谱的研究论文日益增多。目前，中药指纹图谱的研究已 成为我国中药研究的热点之一，将对我国中药现代化研究起到巨大的促 进作用?3。 目前可用于制定指纹图谱的检测方法主要有薄层色谱 TLC 、高效 DN时旨纹图谱等。各种指纹图谱在分离效果、重现性能、适用范围、分 析速度、普及程度等方面具有不同的优缺点。其中，气相色谱方法具有 高效、高灵敏度、样品用量少和分析速度快等优点，主要用于中药挥发 性成分的分离鉴定。 积雪草主要含有三萜皂苷类、多炔烯烃类、挥发油类等成分口1。研 究表明，其中积雪草苷、积雪草酸及积雪草挥发油均具有抗抑郁作用随, 111。我院研制的抗抑郁新药“雪抑乐’’既是以积雪草提取物作为原料制 成 的全新制剂，积雪草挥发油为其中主要药效成分之一。 本课以积雪草挥发油为研究对象，采用气相色谱法较系统地探讨 指纹图谱研究过程中所涉及的多方面问题，如优选其色谱分离条件，考 察指纹图谱的稳定性、精密度、重现性等，建立积雪草挥发油气相色谱 指纹图谱，为积雪草及其制剂的质量控制提供一定的参考。 当前国内对积雪草的研究比较广泛，但多在其化学成分及药理作 用、提取工艺上n2~1劓，对其质量控制研究多在其主要成分积雪草苷、羟 基积雪草苷、积雪草酸等的含量测定上，主要以HPLC为主n6一引，而GC 研 究较少n"。而对积雪草挥发油的指纹图谱未见文献报道。因此，该课题 具有一定的新颖性。 、仪器和试药 asiaticaL(Urb( 1药材为伞形科积雪草属植物积雪草 Centella 的干燥全草，分别购于宝康医药公司、成都药材市场，并经生药学教研 室庄元春老师鉴定。 2仪器 SP--3420型气相色谱仪，北京北分瑞利分析仪器公司。 m×0(25ram ，北京北分瑞利分析仪 石英毛细管柱，。HP一5Ms 30 器公司。 ZB--2010色谱工作站，四川知本分析测试技术公司。 WYB―H型静音无油空气泵，北京中亚气体仪器研究所。 SPGN一2A型高纯氮发生器，北京中亚气体仪器研究所。 SPGH--300型高纯氢发生器，北京中亚气体仪器研究所。 ZDHW型3000ml调温电热套，北京中兴伟业仪器有限公司生产。 FCl04型电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司生产。 KQ3200B型超声波清洗器，江苏省昆山市超声仪器有限公司生产。 HH-W型数显恒温水箱，江苏省金坛市医疗仪器厂生产。 球形冷凝管、挥发油测定器 特制，刻度管最小刻度为0(05mL ，均 为成都市科龙化工试剂厂生产。 2000mL圆底烧瓶为崇州市蜀玻化工有限公司生产。 3试药与试剂 石竹烯对照品，购于sigma公司。无水乙醇，吐温一80，石油醚 30, 60? 、无水硫酸钠，均为分析纯。试验用水为去离子水。 方法与结果 1气相色谱试验条件的确定 英毛细管柱，HP一5Ms 30nl×0(25ram ，结果见图1。 图l色谱柱的选择 Fig(1Thechoiceofthe column chromatographic A:SE--30 B:HP一5Ms 由图1(--f知，图A中峰l，2，3，4，5，6，7，8的分离度分别为1(8， m× 0(25ram 。 用SE-30 25mX0(22ram 色谱柱的分离效果不及HP一5 30 因此采用石英毛细管柱，HP一5Ms 30m×0(25ram 。 1(2柱温的选择 由于积雪草挥发油含有多种组分，且沸程较宽，若选择一个恒定柱 温很难分离各个组分，因此采用程序升温的方式进行分析。考察不同程 序升温下所得色谱峰。所得色谱图见图2。 以40?,min升至250? 保持2min ; lOmin ; 以10?,min升至250? 保持2min ; 以5?,min升至250? 保持2min 。 】O 图2柱温的选择 A:程序升温l B:程序升温2 C:程序升温3 D:程序升温4 mode heatmode1 heat 2 A:programmeding B:programmeding heatmode3 heatmode4 C:programmeding D:programmeding 结果表明，按程序升温l进样所得图谱见图2A，在初始阶段有溶帮 峰的干扰，其主要色谱峰群出峰时间在25一-45min，而且色谱峰峰形普 遍较差，峰较宽，分离效果差，所以提高起始温度为150口。按程序升 温2进样所得图谱见图2B，虽然色谱峰峰形较好，但色谱峰数量较少， 特别是在初始阶段样品中有色谱峰与溶剂峰重叠，在5-,8min这段时间 无色谱峰，这是由于初始温度较高，样品中一些低沸点的组分，不能与 溶剂峰完全分离，因此选择使用二阶段程序升温，调低初始温度为90?， 以150 i徘为第一个程序升温的结束温度并保持8min以使低沸点的组分 流出，在150珠持8rain后以10F,min升至250馓高沸点的组分能够分 后所出色谱峰分离较好，峰形较好，但在24",28min时间段中可见色谱 峰数量明显较少，可明显分辨在24min处所见的大峰为2个峰重叠后形 成，其峰形也较宽，这是由于降低了初始温度且升温速度较慢，所以将 起始温度保持时间调整为5min，第一个程序升温速率增加为10?,min， 并将170徘为第一个程序升温的结束温度，同时降低第二个程序升温 的升温速率以提高25min后色谱峰的分离度。按程序升温4进样所得图谱 见图2D，所得色谱峰数量最多，低沸点组分与高沸点组分均能有效分离， 分离度较高。 所以，本实验柱温采用程序升温4的方式。 1(3载气流速的选择在上述条件下，以氮气作为载气，选择流速分别 1(0 为0(8ml,min， ml,min，1(2ml,min进样。所得色谱图见图3。 图3载气流速的选择 rate The ofthecarrierflow Fig(3 choice gas A:0(8ml,minB:1(Oral,rainC:1(2ml,min 结果表明，随载气速度增加出峰时间缩短，分别计算对照峰的拖尾 1(2ml,min时为0(96，表明当载气流速为1(2ml,min时，所得峰形较 好， ml,min。 拖尾因子满足要求。所以确定载气流速为1(2 色谱图见图4。 14 图4进样量的选择 Thechoiceof size Fig(4 sample A:0(5ul B:lul C:2ul 由图4可知，当进样量为0(5ul时，色谱峰数量较少，而当进样量 为lul与2ul时，色谱峰数量相当，但当进样量为2ul时，对照峰拖尾因 子为0(83，而进样量为lul时为0(95，且进样量为2ul时峰分离度仅有 0(9，较进样量为lul的2(5低。因此，确定样品进样量为lul。 I(5考察色谱记录时间 按上述条件，记录lOOmin色谱图见图5。由图 可知，35min后没有色谱峰出现。故记录35min色谱图。 图5100nlin色谱图 for100min Fig(5Chromatogram 2供试品的制备 2(1供试品萃取溶剂的选择采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，由于 积雪草挥发油中的主要成分可溶于石油醚等有机溶剂，为了更好的表征 积雪草挥发油中各组分，选择用石油醚 60,90? 、石油醚 30,60 ? 为溶剂，在同一条件下提取、分析。 结果表明，以石油醚 60(--，90 oC 作为萃取溶剂时，在程序升温初 始阶段溶剂峰与样品峰不能完全分开，干扰色谱的辨别，影响了样品的 分离效果，故选择低沸点的石油醚 30,60。C 为本品的萃取溶剂。 2(2供试品制备:准确称取积雪草509，置挥发油测定器2000ml烧 瓶中，加水1000ml，浸泡lOh，照挥发油测定法[药典一部附录XD]甲法 装置，自测定器上端加水使充满刻度部分，加石油醚 30--一，60。C 4ml， 连接回流冷凝管，加热蒸馏2(5h，放冷，分取石油醚层，加无水硫酸钠 1(Og脱水，定容为lOml，摇匀，即得 每iml含积雪草59 。 3参照物的制备 3(1参照物的选择根据文献资料，积雪草挥发油采用气质联用分析从 llene 、法昵 中分离出45个成分，其中含量较高的有石竹烯 caryophy 在选定的色谱条件下，石竹烯的保留时间在15min附近，与其相邻色谱 峰的分离度好 R大于1(5 ，见图6，故选为本试验的参照物。 3(2对照品溶液的制备精密吸取石竹烯对照品0(05ml，置5ml容量瓶 稀释10倍即得 每lml含石竹烯IHI 。 图6对照品的GC色谱图 GCforthestandardarticle Fig(6 4方法学考察 4(1稳定性试验 取积雪草 第8批 供试品溶液，分别在0，2，4，6，8小时检测指 纹图。计算各色谱峰相对保留时间平均值及RSD值，以及单峰面积超过 总峰面积5,以上的色谱峰的峰面积比值及RSD值，结果见表1。 由表1可知，各色谱峰的相对保留时间的RSD为O(Ol,,O(78,， 单 峰面积占总峰面积大于或等于5,的色谱峰的RSD为2(22,,2(80,。 结 果表明各色谱峰的相对保留时间和峰面积比值基本保持一致，符合指纹 图谱的要求，供试品在8小时之内检测是稳定的。 4(2精密度试验 取积雪草药材 第8批 供试品溶液，连续进样5次，检测指纹图谱。 计算各色谱峰相对保留时间平均值及RSD值，以及单峰面积超过总峰面 积5,以上的色谱峰的峰面积比值及RSD值，结果见表2。 由表2可知，各共有峰的相对保留时间的RSD为O,O(30,，单峰面 积占总峰面积大于或等于5,的色谱峰面积的RSD为1(11,,2(78,。结 果各共有峰的相对保留时间基本一致，单峰面积占总峰面积大于或等于 5,的色谱峰面积的比值基本,致，符合指纹图谱技术要求。 4(3重现性试验 取积雪草药材 第8批 样品5份，按供试品溶液制备方法制备供试 品，检测指纹图谱计算各色谱峰相对保留时间平均值及RSD值，以及单 峰面积超过总峰面积5,以上的色谱峰的峰面积比值及RSD值，结果见表 3。 由表3可知，各共有峰的相对保留时间的RSD为0(02,O(79,，单 峰 面积占总峰面积大于或等于5,的色谱峰面积的RSD为1(93,,2(81,。 结果各色谱峰的相对保留时间基本一致，单峰面积大于或等于5,的色 谱峰面积的比值基本一致，符合指纹图谱技术要求。 表1稳定性实验 n 5 Tab1 111eresults ofstabilitytest n 5 相对保留时间 峰面 积比值 峰号――甬疆??―――R―SD汀万――――雨囊F――――RSD亓而_一平均 值 , 平均值 , l 0(278 O(69 2 0(331 0(67 3 0(394 0(50 4 0(415 0(46 5 0(522 O(24 6 0(572 O(19 7 0(584 0(15 8 0(641 。0(11( 9 0(714 0(06 10 0(909 0(05 11 0(938 0(02 12 0(956 0(02 S 1 0 l 0 13+ 0(763 2(70 1(034 0(02 14 1(041 O(01 15’ 1(084 2(22 1(050 0(02 16 1(061 0(02 17 1(080 0(03 18 1(091 O(03 19 1(097 O(04 20 1(102 O(04 2l 1(116 O(04 22 1(143 0(06 23 1(158 O(06 24 1(224 O(08 25’ 0(505 2(78 1(291 0(34 26 1(316 0(Ol 27。 0(622 2(80 1(358 0(12 28 1(414 O(12 29 1(424 0(10 30 1(465 O(78 31 1(492 O(12 32 2(058 0(22 ?:单峰面积超过总峰面积5,的色谱峰 19 表2精密度实验 n 5 Tab2 Theresults test n 5 ofprecision 峰号 一 塑翌堡甲甲宁,――峰?2比值 平均值 RSD , 平均值 RSD , 1， o(277 0(30 2 0(330 0(30 3 0(393 0(22 4 0(414 0(21 5 0(5214 0(1l 6 -0(572 0(07 7 0(584 0(06 8 0(641 0(04 9 0(714 0(04 10 0(908 0(33 ll 0(938 0(01 12 0(956 0 S 1 0 1 0 13+ 1(034 O(01 0(761 1(90 14 1(041 0(01 15+ 1(050 0(01 1(072 1(11 16 1(06l o(Ol 17 1(080 0(01 18 1(091 0(01 19 1(097 0(02 20 1(101 0(01 2l 1(115 O(Ol 22 1(142 0(02 23 1(157 0(02 24 1(224 0(03 25+ 1(294 O(03 0(476 2(78 26 1(330 0(Ol 27+ 1(357 O(03 0(621 (80 2 28 1(413 0(04 29 1(424 0(04 30 1(465 0(13 31 1(473 0(02 32 2(060 0(12 ?:单峰面积超过总峰面积5,的色谱峰 3重复性实验 n--5 Tab3 Theresults of test n 5 reproducibility 峰号 望竺竺!!竺 一 竺兰竺兰竺 RSD , 平均值 平均值 RSD , l 0(278 0(14 2 0(33l O(12 3 0(393 0(79 4 0(415 0(74 5 0(522 0(42 6 0(572 0(30 7 0(584 0(28 8 0(64l O(17 ‘ 9 0(714 0(09 10 0(909 0(08 ll 0(938 o(04 12 0(956 0(04 S l O l O 13+ 1(034 0(02 0(764 1(93 14 1(04l 0(05 15’ I(050 0(03 1(091 2(07 16 1(06l 0(03 17 1(080 0(05 18 1(091 0(05 19 1(097 0(05 20 1(102 0(05 2l 1(116 0(06 22 1(143 0(07 23 1(158 0(08 24 1(225 0(10 25’ 1(287 0(23 O(41t 2(8l 26 11303 O(10 27+ 1(358 O(19 O(546 2(62 28 1(415 0(09 29 1(425 0(12 30 1(464 0(76 3l 1(474 O(05 32 2(059 0(36 六:单峰面积超过总峰面积5,的色谱峰表 21 5积雪草指纹图谱的考察 5(1 积雪草指纹图谱及技术参数 按上述供试品溶液的制备方法和确定的色谱分离条件，分别制备供 试品溶液，进样分析，记录35分钟的色谱图，见图7。分析10批样品的 色谱图，通过考察各指纹峰的相对保留时间，标定共有指纹峰。结果表 明，积雪草挥发油GC指纹图谱中共有32个共有指纹峰，见图8。 以石竹烯色谱峰 S峰 的保留时间和峰面积为1，计算各共有指纹 峰的相对保留时间及峰面积比值。各批指纹峰的保留时间及相对保留 时间，百分峰面积，峰面积比值及其差值见表4。 图710批积雪草GC指纹图谱 ten GC ofCentellaasiaticaL(Urb(for batches Fig(7 fingerprintchromatogram 图8积雪草GC指纹图谱 GC ofCentellaasiaticaL(Urb( Fig(8 chromatogram fingerprint (表4积雪草GC指纹图谱技术参数 n----10 as Tab1The resultsofGCofCentella iaticaL(Urb analytical peak 共有 否分峰面积 峰 丽积比值 相对保留时间 峰面积比值 备注 峰号 , 差值 , 标 准规定 ? 0(279?0。003O(52?O(12 0(042?0(009 2 o(33l?0(003O(88?O(2l 0(072?0(016 3 仉394?0(003 1(06?O(3l 0，086?0(024 4 O(415?O(003O(80?O(18 O(065?0(014 5 0(522?0(002O(50?O(13 0(04l?0(010 6 0(572?0(00l 0(3l?0(08 0(025?0(006 7 0(584?0(002 L96?0(6l 0(158?O(043 8 0(641?0(00l 1(08士O(23 0(088?0(017 9 0(714?0(00l 0(8l?0(19 0(065?0(013 m 0(902?0(00l 0(41?0(05 0(034?0(003 n 0(938?O(001 4(02?0(50 0(408?o(024 屹 0(956?0(00l 1(77士0(16 0(145?0(014 S 1(000 12(28?O(86 1(000 石竹 13 1(0344-0(0019(25?0(74 o(762?o(056 ?7(35 应丰?30, 14 O(88 0(0735-0(016 1(042士0(ool 4-0(15 15 13(26?O(06 1(082?0(060 ?5(55 应 净?25, 1(050-t-O(00l 16 1(06l 5-0(00l 2(52?0(80 0(2884-0(018 17 1(080?0(00l2(8l?O(29 O-392?O(029 18 1(091?0(00l 1(38?O(19 O(113?0(017 19 1(097?O(003O(8l?0(08 0(0665-0(007 20 1(1025-0(0012(Ol4-0(15 0(2055-0(013 21 1。1164-0(00l2(56?O。20 O(33l?0(025 22 1(1435-0(00l 1(275-0(13 O(103?0(010 23 1(158?0(00l 2(86?O(20 0(233?0(020 24 1(43 0(117?O(013 1(225?0(00l 5-0(1l 25 4-29(26应牛士 30, 1(2965-0(0026(25?1(69 0(5164-0(15l 26 1(332?0(00l 1(03?O(19 0(084?0(019 4"26(35应丰士 30, 27 1(359?0(0027(64?1(60 0(6304-0(166 28 1(4215-0(004 1(734-0(66 O(137?0(055 29 1(43l?O(ool 1(55?0(82 0(2124-0(086 30 1(471?0(001 1(644-0(5l 0(136士0(048 31 1(41?0(31 0(1164-0(029 1(4864-0(004 l 32 2(0160?0(02 3(95?1(67 0(3184-0(048 S峰保留时间:15(143s;S峰峰面积:1498 5(2相似度计算以共有峰的峰面积比值为指标，选择平均矢量作为 对照图谱，按夹角余弦计算，10批药材的相似度分别为0(947，0(965， 示，lO批积雪草挥发油的相似度均在90,以上，符合中药指纹图谱相似 度的要求。 讨论 1气相色谱试验条件 1(1色谱柱的确定对挥发性成分一般采用气相色谱法分析，故本课题 采用气相色谱检测积雪草挥发油的指纹图谱。气相色谱色谱柱有填充柱 及毛细管柱两类，中药材中的物质成分复杂，选用填充柱分离效果较差， 所以通常选用毛细管柱进行分析。文献报道，积雪草挥发油中主要含有 l 石竹烯 caryophy ， 使各组分出峰时间主要由其各自的沸点高低决定。经实验，HP一5Ms色 谱柱的分离效果较SE一30更为理想，故选用石英毛细管柱，HP一5Ms 30 Ill×0(25mm 。 1(2柱温的确定柱温会影响样品组分的分离程度和分析时间。低柱温 有利于延长柱寿命降低检测器的本底，但是由于组分在固定液中的扩散 系数减少，增大了传质阻抗，造成峰展宽，保留时间变长，延长了分析 时间，故大多在使难分离物质达到要求的分离度条件下，尽可能采用低 柱温。而对于宽沸程多组分的样品选用一个恒定柱温很难分离各个组 分，低沸点组分因柱温太高，色谱峰出柱过快，峰窄而相互重叠，而高 沸点组分又因柱温太低，出柱很慢，峰宽而平，甚至有些组分不能流出， 因此，采用程序升温的方式，使低沸点与高沸点组分均可在各自适宜的 温度下流出色谱柱，低沸点组分在较低的柱温时先流出柱，高沸点组分 随柱温升高不断从色谱柱中洗脱出来，使各组分都得到良好的分离。在 优化程序升温时，应先选择适当的初始温度，从图2可知，初始温度为 90?时有利于各组分的分离，因此初始温度设定为90。C。接下来再调整 程序升温的速度，可使未分离的组分得到有效的分离。在优化程序升温 时要综合考虑各种影响因素，既要使各组分得到有效的分离，又要使各 组分峰形对称。最终柱温为:初温90 ? 保持8min 以5?,min升至250? 保持2min 。 1(3载气流速的确定载气流速会影响分离效率和分析时间，当低流速 时，分离度高，但出峰时间延长，峰形变宽，色谱峰出现拖尾。通过试 验，确定流速为1(2ml,min。 1(4进样量与指纹图谱的关系 在研究GC指纹图谱时，供试品溶液的 进样量也是影响其指纹图谱色谱分离的主要因素之一。供试品溶液的浓 度、进样量越大，其指纹峰越多，但供试品溶液的浓度和进样量过大， 则不利于供试品溶液中各组分的有效分离;过小，指纹峰就少，其特征 性就差。 图4为积雪草供试品溶液进样量相差4倍时的指纹图谱，由图可知， 在同一条件下，当进样量较小时，其指纹图谱的指纹峰有21个 在设定 的积分条件下 ;而当进样量较大时，指纹峰数可达36个。从各指纹峰 的分离度上看，由于指纹峰的保留时间与进样量无关，在同一条件下， 当进样量增加时，各指纹峰在与进样量小时相应的出峰时间处出峰，从 而可能导致在进样量大时指纹峰各峰展宽，使部分指纹峰发生重叠，分 离度变小，将不利于各指纹峰达到有效的分离。因此，在建立指纹图谱 时，供试品溶液的进样量既影响其指纹图谱各指纹峰的数量，又是影响 其分离度。经实验选择进样量为1(Oul为最佳。 1(5其它色谱条件的确定气相色谱分析时气化室温度应高于柱温，故 确定为235。C。本研究采用的检测器为氢焰离子化检测器，检测器的温 度一般要高于柱温，并不得低于1009C，以免水气凝结，本试验中最高 柱温为250"C，所以确定检测器温度为270。C。 2供试品溶液的制备 挥发油的提取一般采用水蒸气蒸馏法。积雪草 挥发油蒸馏提取方法，已在前期雪抑乐的制备过程中优选获得。而不同 供试品溶剂对GC指纹图谱也有一定影响，故本试验主要对供试品萃取溶 剂进行考察。由于积雪草挥发油能溶于石油醚，乙酸乙酯等有机溶剂， 故可以考虑采用这些溶剂将其提取出来。然而考虑乙酸乙酯与水相互间 溶解度均较大，所以考虑采用石油醚。石油醚中较常用的有石油醚 30"--" 60"C 与石油醚 60"--90? ，故对这两种石油醚进行考察。经试验， 醚 30"一60? 为本品的萃取溶剂。 3参照物的选择在气相色谱指纹图谱的研究过程中，参照物起到帮助 辨认指纹峰，计算组分的相对保留时间和相对峰面积的作用。选择一个 合理的参照物，有助于指纹图谱研究工作的顺利完成。可选择指纹图谱 中稳定且峰面积适中的、与被测指纹图谱中的相邻色谱峰完全分离 R 大于1(5 的已知结构的组分作为参照物。经试验，选择石竹烯为参照 物。 4方法学考察 4(1稳定性试验按《中药注射液指纹图谱研究的技术要求 暂行 》 规定考察供试品的稳定性:取同一供试品，分别在不同时间检测，考察 色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。由于积雪草供试品溶液 在常温下易挥发损失，故将其置于密闭容器中低温保存，经稳定性试验 表明供试品溶液在8h内色谱峰的相对保留时间、峰面积比值基本,致 性。 4(2精密度试验按《中药注射液指纹图谱研究的技术要求 暂行 》 规定考察供试品的精密度:取同一供试品，连续进样5次以上，考察色 谱峰的相对保留时问、峰面积比值的一致性，采用GC铝I]定指纹图谱， 单 峰面积超过总峰面积5,以上的各共有峰的峰面积比值的相对标准偏差 RSD不得大于3,。第8批药材供试品溶液连续进样5次，指纹图谱中各色 谱峰的相对保留时间RSD值及单峰面积超过总峰面积5,以上的各共有 峰的峰面积比值RSD值均小于3,。 4(3重现性试验按《中药注射液指纹图谱研究的技术要求 暂行 》 规定考察供试品的重现性:取同一批号的供试品5份以上，按照供试品 溶液的制备和检测方法制备供试品并进行检测，考察色谱峰的相对保留 时间、峰面积比值的一致性。采用GC$O定指纹图谱，单峰面积超过总峰 面积5,以上的各共有峰的峰面积比值的相对标准偏差RSD不得大于3 ,。取第8批药材5份，按供试品溶液的制备和检测方法制备供试品并进 行检测，指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间RSD值及单峰面积超过总 峰面积5,以上的各共有峰的峰面积比值RSD值均小于3,。 5指纹峰的技术参数 国家食品药品监督管理局《中药注射液指纹图谱研究的技术要求 暂行 》规定了指纹图谱中共有峰和非共有峰的面积占总峰面积的百 分数，以及未达到基线分离的共有峰面积计算方法等不同技术参数。《中 药注射液指纹图谱研究的技术要求 暂行 》规定中药材的供试品图谱 中各共有峰面积的比值与指纹图谱各共有峰面积的比值比较，单峰面积 占总峰面积占总峰面积大于或等于10,，而小于20,的共有峰，其峰面 积比值差值不得大于?25,;单峰面积占总峰面积大于或等于5,，而 小于10,的共有峰，其差值不得大于?30,:单峰面积占总峰面积小于 5,的共有峰，峰面积比值不做要求，但必须标定相对保留时间。未达 基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该 组各峰的相对保留时间。非共有峰总面积不得大于总峰面积的10,， 本课题按上述规定，采用气相色谱法对10批积雪草样品进行分析， 根据所得的指纹图谱 部分积雪草指纹图谱及其数据见附 ，标定其中 共有指纹峰。结果表明，在10批样品中标定出32个共有指纹峰，其平均 峰面积总百分含量为91(62?9(12。lO批样品虽均含有32个主要特征成 分，但每批样品之间还是存在差异，如l批及9批药材在相对保留时间为 7及9批药材在相对保留时间为1(847附近有一色谱峰，而2，8批此处未 检测到峰;8批药材在相对保留时间为2(176处有一色谱峰，但而其余9 批此处未检测到峰。除此以外，每批样品的峰面积，峰面积比值间均存 在一定差异。这些差异可能与药材采收季节有关，另一个原因是由于积 雪草中挥发油含量较低，挥发性成分对热敏感，在干燥、贮存、运输中 低沸点物质与高沸点物质损失不一致。为减少药材差异对制剂的影响， 应尽可能固定药材的采收时节，贮存、加工等条件。 结 论 本课题根据国家食品药品监督管理局《中药注射剂指纹图谱研究 的技术要求 暂行 》，采用气相色谱法对积雪草挥发油的指纹图谱进行 研究。积雪草挥发油由水蒸气蒸馏法提取;供试品溶液的溶剂经考察采 用低沸点的石油醚 30,60? 对指纹图谱无干扰;通过考察不同条件 下的分离效果，优选出的色谱条件为:色谱柱:HP-5Ms石英毛细管柱 30m 焰离子化检测器 FID ，检测器温度270。C，气化室温度235。C;进样量: lul。经方法学考察，所建立的色谱方法稳定性、精密度、重现性良好; 按所确定的色谱条件和测定方法，先后对10批积雪草药材挥发油成分的 气相色谱指纹图谱进行研究，标定出32个共有指纹峰，各指纹峰的相对 保留时间和峰面积比值的相对标准偏差RSD均符合规定，相似度均大于 O(90。经上述研究所建立的积雪草挥发油指纹图谱标准，符合《中药注 射剂指纹图谱研究的技术要求 暂行 》，为积雪草药材挥发油的质量评 价以及正在研制的抗抑郁新药雪抑乐的质量标准提供了科学依据。 参考文献 [1]中华人民共和国药典[M](北京:化学工业出版社，2005:一部附录64 [2]陈瑶(积雪草的资源分布与生药鉴别[J](中国中药杂志，2000， 25 4 :199―202 [3]徐皓(积雪草药理作用的研究[J](氨基酸和生物资源，2005， 27 2 :17-20 [43赵宇新(积雪草的研究进展[J](中国中医药信息杂志， 2002，9 8 :81―84 [5]柴逸峰(中药指纹图谱