前列腺组织二氢睾酮结合蛋白与性激素作用的研究【精品论文】

前列腺组织二氢睾酮结合蛋白与性激素作用的研究【精品】 前列腺组织二氢睾酮结合蛋白与性激素作用的研究 【摘要】 目的 测定前列腺组织中DHT结合蛋白的DHT结合容量，研究睾酮、 雌二醇、孕酮对DHT结合容量的影响，初步DHT结合蛋白与性激素作用的 性质。方法 20例正常前列腺组织，制备组织胞浆提取液，乙醚萃取去除提取 液中所有的内源性类固醇激素，加入3H-DHT测定结合容量，并以等量和10倍 量的T、E2、Po与3H-DHT竞争DHT结合容量。结果 前列腺组织胞浆单纯DHT 结合容量是(0.0143?0.0022)nmol/g湿组织，T、E2与DHT竞争结合蛋白的作 用较强，降低DHT结合容量的作用比较明显，Po的结合作用较弱，对结合容量 的影响较小。 结论 前列腺组织胞浆中的DHT结合蛋白组成复杂，性质各异， 有很强的结合DHT能力，与T、E2、Po相互作用，共同影响前列腺组织中DHT 的状态。 【关键词】 前列腺 雄激素 雌激素 孕激素 雄激素结合蛋白 【Abstract】 Objectives This experiment is to quantify the total DHT (Dihydrotestosterone)-binding ability of DHT-binding proteins in prostate by assaying the DHT-binding capacity, and to study the change of DHT-binding capacity causing by the combination of T(Testosterone), E2(Estrodiol), Po(Progestosterone) and DHT-binding protein, and to analyze preliminarily the effects of sex hormone on DHT-binding protein of prostate.Method To obtain cytosolic fracions from 20 normal tissues taken from accident-death corpses without serious diseases, and then to remove all the endogenous hormone from the cytosolic fracions by ether stripping.To assay the content of the bound 3H –DHT. To add the same dose of T、E2、Po to compete against 3H –DHT for DHT protein, and then to add 10 times dose of T、E2、Po to compete with 3H –DHT for DHT protein. Results The alone DHT- binding capacity of the cytosolic fractions in prostate is (0.0143?0.0022)nmol/g wet tissue. T and E2 have more obvious effect on reducing the DHT-binding capacity of the cytosolic fraction while Po has less effect on reducing the DHT-binding capacity. Conclusions There are many kinds of DHT-binding proteins in the cytosolic fraction in prostate tissues and their mechanisms are different. The proteins have strong DHT-binding capacity, and they interact with T、 E2、Po to affect the DHT state in the prostate tissues. 【Key words】 Prostate Androgen Estrogen Progestosterone Androgen-binding protein 前列腺组织中存在多种二氢睾酮(Dihydrotestosterone， DHT)结合蛋白,,,，这些蛋白的性质和生理作用尚不十分明确。作者自 2001年2月至2007年5月实验测定DHT结合容量来描述这些结合蛋白总 的DHT结合能力，并以睾酮(CT)、雌二醇(E2)、孕酮(PO)与DHT竞争结合蛋白 的作用研究正常前列腺DHT结合容量的变化，并初步分析DHT结合蛋白与性激 素作用的性质。 1 和方法 1.1 前列腺组织标本 20例正常前列腺组织取自无严重疾患的健康男性尸体，年龄22,44岁，平均35.7岁。组织块获取距临床诊断死亡时间,15min。所有组织均经病理证实。组织获取后以冰生理盐水洗净血迹，保留腺体实质部分，滤纸吸干，置入液氮中冻结，然后转放-70?冰箱存放待用。 1.2 试剂 3H-DHT购自中国科学院上海核技术开发公司(1.2.4.5—3H -DHT，放射性比强度:50ci/mmol，放化纯度:,95%，放射性浓度:1mci/mmol)，检测仪器为BECKMAN公司LS-6500型液态闪烁记数仪。E2、T、PO为SIGMA公司产品。 1.3 实验方法 (1)胞浆提取液准备:制备胞浆提取液,,,，去除胞浆提取液内源性类固醇激素，将胞浆提取液加入2倍体积的乙醚(萃取类固醇激素)，均匀而柔和震荡2min，静置6h，1000g离心1min，去除上层乙醚，重复1次，去乙醚后，静置过夜，以挥发残余乙醚，吸取所需量的下层样品。(2)3H -DHT结合和测定:3H-DHT溶液准备:0.4ml3H-DHT试剂加入1.2ml 99%乙醇混匀，取50μl溶于4950μl甘油磷酸盐缓冲液,1nM 磷酸二氢钾(KH2PO4)，氢氧化钠(NaOH) 微调至pH 7.4，含10% 甘油(Glycerol) (v/v) ,，3H -DHT终浓度为50nM。T、E2、Po溶 23下一页 液:先配置5mm pH激素浓度的异丙醇溶液，用99%乙醇稀释10倍，再以上述甘油磷酸盐缓冲液稀释1000倍，此浓度500nM，为3H -DHT溶液浓度的10倍，留取一部分备用;另一部分继续甘油磷酸盐缓冲液稀释10倍，浓度50nM，等同于3H -DHT溶液浓度，备用。另配不含任何激素的空白对照溶液，过程同。闪烁液:PPO 6g 、POPOP 0.3g 、 萘 50g 溶于甲苯 1000ml。操作步骤:取已去除内源类固醇激素的样品，每一样品分为4份，每份350μl，分别加入20μl空白对照溶液、50nM的T溶液、50nM的E2溶液、50nM的Po溶液，然后所有样品溶液均加入3H-DHT溶液20μl，混匀，静置孵育18h。加入2倍体积的乙醚，均匀而柔和震荡 2 min(萃取未结合的3H-DHT)，1000g离心1min，去除上层乙醚，吸取200μl下层样品。实验同时以2份350μl PGB缓冲液各加入20μl 3H -DHT溶液分别作为空白对照记数(步骤同前)和总记数(略去乙醚萃取步骤，其余同前)。 以上全部操作在4?进行。 将吸取的200μl样品加入蛋白酶K(终浓度100μg/ml)、SDS(终浓度0.5%)，37?过夜，加入5ml闪烁液，轻微震荡2h做液闪记数。 以上为等量激素的竞争结合实验，再用500nM的T溶液、E2溶液、Po溶液替换相应的激素溶液，其余步骤同，做10倍激素的竞争结合实验。 根据已知3H -DHT含量的计数:(总记数cpm-空白对照cpm)，和待测样品的计数:(样品cpm-空白对照cpm)计算样品结合3H -DHT含量。 实验为同一样品不同处理的自身配对设计，统计分析为t检验。 2 结果 2.1 前列腺组织胞浆单纯DHT结合容量是(0.0143?0.0022)nmol/g湿组织，均 数相当于4.2 ng/g湿组织。 2.2 与DHT等量性激素对胞浆DHT结合容量的影响，见表1。加入 T或E2的DHT结合容量低于单纯DHT结合容量，有显著性差异(P,0.05)，Po的作用无显著性差异(P,0.05)。等量时T和E2作用的DHT结合容量低于Po，有显著性差异(P<0.05)，但T和E2作用无显著性差异(P>0.05)。 2.3 10倍于DHT量性激素对胞浆DHT结合容量的影响见表1，不但T或E2作用的DHT结合容量低于单纯DHT结合容量，Po作用下的结合容量也低于单纯DHT结合容量，均有显著性差异(P,0.05)。表1 20例标本性激素对DHT结合容量的影响(nMol/g湿组织) 3 讨论 二氢睾酮(DHT)是影响前列腺生理和引起前列腺组织增生最重要的雄激素,,,，前列腺组织中有高浓度的DHT，含量达到500ng/100g湿组织，而血浆DHT含量仅有(56?20)ng/100ml(每100g前列腺湿组织的体积约等于100ml)，其中游离DHT 极微量,,,，由于DHT是甾体激素，其游离状态易于依浓度梯度扩散进入/逸出组织细胞，有研究表明，前列腺组织中除外雄激素受体，还有多种DHT结合蛋白,,,，其中有高亲和力的性激素结合球蛋白,,,，组织中这些蛋白的存在可能起到类似血浆中白蛋白和性激素结合球蛋白的对雄激素的结合聚积作用，在组织中的游离DHT环境结合大量DHT形成“DHT库”，同时，蛋白与DHT的结合减少了局部游离DHT的浓度，有利于产生血浆游离DHT被动扩散进入组织的浓度梯度，易于前列腺利用外源的DHT，更促使组织中DHT的富积，便于其发挥生理作用,,,。然而这些蛋白的作用和性质还知之甚少。 胞浆是DHT产生和贮存的主要场所，而胞核是DHT-雄激素受体启动转录的部位，因此实验设计主要研究胞浆中的DHT结合蛋白的作用性质。 实验结果，前列腺组织胞浆的DHT结合容量为(0.0143?0.0022)nmol/g湿 组织，均数大约为4.2 ng/g湿组织 ，比较血浆中DHT含量仅有 (0.56?0.20)ng/ml(其中游离DHT极微量)，提示前列腺组织胞浆有很强的DHT结合能力，利于局部摄取和贮存DHT(包括胞浆局部产生和血浆来源)，最终有利于DHT进入胞核与受体作用。 T、E2、Po对胞浆DHT结合容量的影响， DHT结合容量只是反映结合DHT的量，由于结合蛋白的非特异性(如前列腺组织中的性激素结合球蛋白,,,)，在生理条件下实际结合DHT可能会受到其他激素(如雄激素、雌、孕激素)的影响，因此，从DHT结合蛋白与多种性激素的作用初步分析这些蛋白与激素的作用。 等量T、E2、Po与DHT的竞争作用: 与单纯DHT结合容量相比较，在同DHT等量存在的T、E2竞争作用下，结合容量显著降低，Po虽然降低了结合容量，但无显著性差异。说明T、E2具有明显的与DHT竞争结合蛋白的作用，提示在DHT结合蛋白中存在着与E2亲和力较高的蛋白(性激素结合球蛋白即是其一)， 由于雌激素以协同DHT诱导前列腺组织的生长,,,，因此E2参与竞争结合胞 浆DHT结合蛋白的作用可能是一种雌雄激素协调机制，有关与E2结合的这类蛋 白的性质和作用机制值得研究。而比较这T、E2与DHT竞争结合蛋白的作用结 果，E2作用的DHT结合容量略低于T的作用，无显著性差异。 DHT结合蛋白与T、E2、Po具有亲和力的性质，提示了蛋白组成的复杂性 以及同类固醇激素作用的广泛性;同时，T、E2、Po与DHT结合蛋白的竞争结 合将影响到局部游离DHT的含量，可能会对DHT的生理作用产生影响。 【参考文献】 1 江洪涛,陈昭典.前列腺组织性激素结合球蛋白的研究.中华男科学杂 志,2004,10(6):443,448. 2 江洪涛,陈昭典.前列腺组织双氢睾酮结合容量与年龄的关系及意义.中国男科 学杂志,2007,21(1):32,34. 3 Heracek J,Richard H,Martin H,et al. Tissue and serum levels of principal androgens in benign prostatic h 上一页13下一页 380. yperplasia and prostate cancer.steroids,2007,72(4):375, 4 Partin AW,Rodriguez R.The Molecular Biology,Endocrinology,and Physiology of the Prostate and Seminal Vesicles.In:Walsh PC,editor-in-chief.Campbell’s Urology.8th ed.Philadelphia:Elsevier science,2002.1235,1296. 5 Hryb DJ, Nakhla AM, Kahn SM, et al .Sex hormone-binding globulin in the human prostate is locally synthesized and may act as an autocrine/paracrine effector. J Biol Chem， 2002，19，277(29):26618, 26622. 6 彭轼平.良性前列腺增生症概论.见:吴阶平主编.吴阶平泌尿外科学. 济南:山 东科学技术出版社，2004.1125,1139.