鸡致病性大肠埃希氏菌耐氧氟沙星质粒的检测

鸡致病性大肠埃希氏菌耐氧氟沙星质粒的检测 鸡致病性大肠埃希氏菌耐氧氟沙星质粒的 检测 20ChineseJournalofVeterinaryScienceandTechnologyVo1.30No.72000 2.3免疫鸡对NDV强毒攻击的抵抗力试验鸡于免疫后第6 周用致死剂量NDVF48E9强毒攻击.攻毒后第3d开始发病, 被毛粗乱.食欲减退,难站立,第4d开始死亡.剖梭见死亡 鸡腺胃乳头有出血点,咽喉部被粘膜克塞,气管,食管十二指肠 牯膜出血,腔上囊水肿.各组鸡存活率见2. 表2NDV强毒攻击后各组鸡的存活率 组别试验鸡数死亡鸡数存秸鸡数存话率() I1]832728 ?112g8182 ?10199000 3讨论 peHNM质粒是含有NDVH基因的重组表达质粒.雏鸡 用其免疫后l周,血清中HI抗体水平开始升高在免疫后第6 周用致死剂量的NDVF48E9标准强毒攻击,用质粒pcHNM 免疫组存活率为81.82.脂质体DNA免疫组为9O.OO.表 明用该质粒DNA免疫鸡能耐受致死剂量的强毒攻击.已知质 粒DNA接种后第2,3d就开始表达目的产物.抗原蛋白在细 胞内台成后,可通过主要组织相容性复合物(M促进质粒DNA被组织细胞 吸收 参考文献: [1]萨姆布鲁克』.费里奇EF.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指 南[M].第2版金冬雁,黎孟枫等译.北京:科学出版社, l996.I6,28. [2]胨吉祥,李广林.薛飞群,等.禽流感HA基因疫苗脂质体 的制各及其理化性质研究[J]中国兽医, 1999,(3)230,232. [3:RagE,CarsonPA,ParkerSE.a1.Introderma[gene immunization:ThepossibleroleofDNAuptakeinthe inductionofcellularimmunityt-oviruses[M].ProcNad AcadSci.USA.1994.95l9,9523. 鸡致病性大肠埃希氏菌耐氧氟沙星质粒的检 .,p.--卢雷连成,韩文瑜,王兴龙,王世若,江文正,张艳-5,冯现伟 —,,一— 放军军需大学基础部,吉林长春130.62)5s.J).了y( 摘要:对分离的2O株鸡瓣致病性大肠埃希氏茵进行药敏试验.筛选出13株耐氧氟沙星(OFL)的菌株.进行质粒提 取,电涑和转化试验-获得1袜由质枉介导的耐OFL多重耐药菌株.谊菌株对参试的l1种抗生素垒部耐药,其中OFL MIC高于50Fg/mL该茵R质粒电津可见6紊带,转化大肠埃希兜茸DH5口在台20,ug/mLOFI的LB平糠筛选得到转 化子.该转化子含有原茵株ee2.7×10b的质粒.获得原茵株部分耐药性.连续转化5次.均获得耐OFL的转化干.证 宴谊茵株对OFL的耐药性由质粒介导. 关键词:鸡致病性大肠埃希氏茵;氧氟沙星}耐药豆垂 中围分类与jI————j最磊B——三章编号:l0..64l9(200.]07一?2.o3 氟喹诺酮(FQNS)类药物是一类新型的抗菌药,因具有抗 菌谱广,与其他抗苗药无交叉耐药性,体内丹布广,口服易吸收 等优点-近年来已成为化学台成抗感染药物中发展最迅速,疗投 最突出的药物...井广泛用于兽医l临床和医学临床.然而.经过 十多年的临床应用表明.该类药物亦有耐药性,而且越来越普 遍.氟喹诺酮类药的作用机理主要在于抑制细菌DNA旋转 酶的活性.普遍认为其耐药机制可能主要起因于染色体基因突 变改变DNA物的耐药机制提供了叉一重要内容 l材料与方法 l_l菌种鸡致病性大肠埃希氏菌菌株为1999年3,5月从 长春市农业科学院,中日联谊小动物医院的病鸡肠道或肛拭标 本中分离获得20株细菌.经常规鉴定确定为大晒埃希氏菌后. 用半固体培养基在4?下保存.受体苗大肠埃希氏苗DH5和 JM109一由本校生化教研室提供. l_2质粒pUCl9(2.69x10b),pGEX5x-l(495×10.b) 由本校生化教研室提供,pBluescript口(2.97×10)由本校兽 医研究所提供,用于测定耐氧氟沙星(OF1,)质粒分子量. Ll3药品与试井4抗生索药敏纸片购自北京天坛药物生物技 中国兽医科技第30卷第7期200(}年2l 术开发公司.包括氨苄青霉索(AMP),强力霉素(DO),卡那霉 素(KM),氯霉索(CMP),庆大霉素(GM),链霉索(sM),刺复平 (RA),环丙沙星(C1P)氧氟沙星,诺氟涉星(NOR),多粘菌素B (PB).OI~’L注射液由中蓑合资四川奇力制药有限公司生产 琼脂糖,RNase购自华黄生物工程公司. 1.4培养基LB培养基,普通培养基按常规方法制各. 1.5药敏试验按WHO推荐的纸片法.即改良kirbyBatter 法.判定标准噩结果解释参照NCCLS. L6质粒挺取质粒的小量制备和大量制备及纯化,按碱裂解 法进行-. 1.?质粗电痞挂锄I按文献r3]进行 1.8R质粒的转化与筛选感受态的制备及转化按文献3.4] 进行.分别采用CaC12处理法和PEG-80(}0处理法.并作适当 改良.用含20#g/mLOFL的LB平板在37?培养l6,l8h 后筛选转化子. 2结果 2.1药敏试验分离菌株药敏试验结果.试验菌的耐药率达 100,耐药最少的3种最多的u种.其中对OFL的耐药率为 65.转化子与原菌株药敏试验结果见表l,转化子获得了包 括OFL在内的4种耐药特性. 表1转化子与原菌株耐药谱对比 I:1lAMPDOKMCMPGMSMRACIIOFLNORPB 菌株s610116666656 转化192020256】41666620 注.表中教字表示抻茁环直径(mm).其中药敏纸片直径为6mm 2.2质枉提取瘦检测l3株耐()FL的多重耐药菌R质粒检 出率为lOO.最少可见2条质粒带.最多7条质粒带= 2.3耐()FL质粗的转化以分离的耐11种抗生素的鸡致病 性太肠埃希氏菌为供体菌.大肠埃希氏苗DH5n为受体菌.用 CaCI.珐和PEG法制备感受态,在古20Fg/mLOFL平板筛选 转化子.所得转化子提取质粒与原供体苗质粒有共同带型;将 转化子获得质粒提取后再行DH5.转化.获得同样转化子.连续 5旋转化结果一致.太肠埃希氏菌JMI(}9作受体菌.转化多敬 均未获得转化子 2.4耐OFL质枉分干量以pUC19,pGEX一5X—l,pBIucscrr 为标准质粒.测得转化子质粒为2.7×10?h. 3讨论 3.1已有研究表明.细菌染色体发生突变的频率比较低.而且 由突变而获得的抗药类型往往是单一的.另一方面耐药率逐年 增高及糖肽类,5一硝基眯唑类药物在经过几十年之后都导致了 质牡介导的耐药性-.因而细菌对氟喹诺酮类药物耐药性的迅 速发展与广泛交互传播的这一事实.人们推测有抗氟喹诺酮药 物质粒的存在.本试验获得了介导OFI耐药眭的质粒,分子量 为2.7×10.b?这一质粒还与GM,SM,NOR,CIP的耐药性有 关.这与氟喹诺酮类药物本身具有拮抗质粒的作用就不可能存 在耐氟喹诺酮类药物的质粒嘲的观点不一致;目前报道有消除 质粒能力的物质越来越多.有化学合成物.如SDS,氟赈酸:棚. 有中草药提取物如板竹,瓜蒌嘲,但都是针对某些菌的某些 耐药质粒而言.消除率也十分有限.没有一样物质对各种细菌的 所有耐药质粒都有消障作用.氟喹诺酮类药物也不例外t它们 虽然能不同程度地消除某些菌株的质粒?但并不能消除某一菌 株所有质粒,耐氟喹诺酮类药物的多重耐药菌株可”检测出耐 GM,CBPC,CXM等质粒:?就是很好的例证因此不能否认介 导耐氟喹诺酮类药物质粒的存在. 我们是在筛选耐GM的转化子时偶然发现有的转化子也 具有耐OFL的特性.于是了这一试验以前未见耐OFL 质粒的报道.可能是耐OFL质粒转化比较困难.不易获得转化 子的缘故.不同的质粒对受体菌的敏感性相差很大t同一质粒 有的受体菌容易吸收.有的却很难.因而不同的质粒都有其最适 受体菌;另一方面,同一受体菌采用什么样的方法.2本试验结果显示 耐药株普遍具有多重耐药性.而且对氟喹 诺酮类药物的耐药存在交叉耐药现象.质粒橙测耐OFl的菌 株都获得了1种上的质粒,来见到单一耐OFL的菌株本试 验所检太眄埃希氏菌耐药率为100,最少耐药3种.最多耐药 l1种(供试药敏纸片L1种).其中对3种氟喹诺酮耐药率分别 是CI[‘77.8,NOR77.8.OFL65.0.同时耐上述3种药 物的耐药率为55.j.提示临床应用该类药物,当一种无效时 不应更换同类的其它药物.但目前兽药市场很多药品不注明主 要用抗菌药物学[M]上海:上海科学技术出版 社.1989268,275. Ca]AcarJF,FrancoualS.Theclinicalproblemsofbacteral 22ChineseJournalofVeterinaryScienceandTechnologyVol30No.72000 [3] [43 [53 [6] resistancetothenewquinolones[J].JAmimaerobChe一[73 mother,1990,28(B):207. 萨姆布鲁克J.费里奇EF,曼尼阿蒂斯J.分子克隆实验 指南[M].第2版.金冬雁译.北京:科学出版社,1995. 马洛伊SR.斯图特KJ.泰勒RK.医用细菌遗传学实验 指南[M:.绦建国等译.北京:科学出版社,1998. 林健梅.范昕建.冯萍.等.革兰氏阴性杆菌氟喹诺酮耐药 株的实验研究EJ].中国微生态学会杂志,1998.10(1): 21,23. 陈小英.陈知本.金黄色葡萄球菌RN1304及其变异株的 质粒消除与转导EJ3.中国药科大学.1989,20(3): 】52,】54 [8] [9] [10] [11] 谢一俊.林成水.董新平一等 氏苗耐药性质粒的研究EJ]. 14(5):77,99. 氟哌酸体外消除鼠伤寒沙门 中国人兽共患病杂志,1998一 陈群.黄苓和黄连对大肠杆菌R质粒消除作用的实验研 究[J].广东医学院,1998,16(1):1,3. 美玛丽.李振勇,左玉花.等.中药蒌仁对大肠杆菌的消除 作用简报[J].中国人兽共患病杂志一1995—11(1):25 郭维植.中药板竹体外抗肠道致泻苗及消除耐药性的实 验研究[J].中国微生态学会杂志,1998—10(3): 146,147. 黄加权.高美英.大肠杆菌耐药现状与耐药质粒分析[J]. 中华传染病杂志.1996.14(2):70,73. 克霉净治疗家免皮肤真菌 , 疫所 病的效果 J 孙融冰,杜文金,黄引贤. 山东’i—0322.华南农正天毛医学系,广东广州51o6421. / 摘要:用自配的4种复方抗真茵药——克霉净l,3,7和8号治疗人工发病免14只聂田间自然发病兔3000多只,先 使用酊荆后潦上膏卉6一症状轻者用药1班.重者用药9班.治愈率平均95以上.克霉净1,7号效果较好. 关键词:之苎?苎;皇里至;茎毫些墨堕堑!造瘟茎墨 中图分娄号:S859.799.1文献标识码:B文章编号:10006419(2000)07002203 1995年左右.在广东省部分地区的兔群中流行一种传染挂 极强的人兽共患病-.病兔皮肤潮红,出现皮屑,毛易脱落,有 渗出液,结痂,脱痴.特别容易继发葡萄球菌病.影响兔的生长发 育.尤为严重的是,本病也能传染给人.特别是小孩.作者等5 人在对本病作流行病学调查时有4人被感染.主要表现体癣,手 癣及头癣.为了弄清病因.我们进行了病原的分离和鉴定.发现 其主要病原有2个属3个种4个型,即毛癣苗属的石膏样毛癣 苗(I型,?型和V型).黄癣菌(许兰氏原型)及念珠苗属的热带 念球菌.未分类2种同时.我们用分离菌人工感染敏感兔复 制出了本病一并从中叉分离到与原始菌种培养特性和形态结构 相同的真菌ll】.众所周知.真菌病的治疗是非常困难的,虽然药 物有多种.但总的来看药物疗效较低,用药次数较多,时间较长, 且叉极易复发;而采用人用药则成本高,疗程长.很不经济.为 了解决生产实际问题,找到治疗本病简便而叉经济的药物.我们 进行了抗真菌药筛选试验,结果表明益康唑,水杨酸,苯甲酸,冰 醋酸,大蒜素及蜂胶都有不同程度的抑菌作用.在进行不同组方 抑真菌试验后,将筛选出的克霉净7,8号连同以前筛选的克霉 净1,3号对人工发病兔和自然感染兔进行抗真菌比较试验. 1材料与方法 1.1茵种石膏样毛癣菌I型一,A.?型A…C…V型 BBl,BIa,},A.黄癣菌+CA.念球菌菌丝,同时进行真菌培养 1.5自然发病兔的浩疗先用镊子去掉痂皮和病毛,洙上酊 剂.湿润病灶.再涂上膏剂.根据病情轻重不同.使用1,3次, 一 般症状轻者1次,中度者2次,重者3次即可治愈. 1.6真茵的分离和鉴定按文献E23进行 2结果 2.1克霉净1号,7号治疗人工发病兔试验结果见表1. 2.2克霉净1,3,7和8号治疗自然发病兔试验结果见 表2. B和B”菌株感染兔的耳根部采样镜检孢子和菌丝.同时 进行真菌培养.均为阳性.其余未看到孢子和菌丝,也未分离到 真菌.说明克霉净1号和7号对石膏样毛癣苗(T型,?型和V 型).黄癣苗(许兰氏藤型)及念珠苗属热带念珠菌人工发病兔的 疗效为除B和t感染兔的耳根部无效外.其余生部痊愈=由 表1,2可知:克霉净1,7号的酊膏剂对轻度病兔l攻用药即可 100治禽,而对中等和严重的病兔则1号比7号疗效好.治愈 率可选95.O以上.但7号药比1号药能较快促进新毛生长; 膏剂比酊荆的疗效好,新毛生长较快i克霉净3,8号药对应肤刺 激性较强,有时易损伤皮肤,反应较大.