丙酮酸乙酯对新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤的保护作用研究

丙酮酸乙酯对新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤的保护作用研究 丙酮酸乙酯对新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤的保护作 用研究 单位代码: 分类号: 学 号: 密级:公开 ?‖菇办孑 博士学位 论文目:丙酮酸乙酯对新生大鼠脑缺血缺氧白质 损伤的保护作用研究 合作 导 师 年月 日原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 、卞,., 论文作者签名: 立缘.啦: 日期: 趁互:臣: 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论 文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 保 密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名:立蘧亟导师签名:乏至垄日 期: 碱查:厶至山东大学博士学位论文 目录 中文摘要. 英文摘要. 符号说明. 引 言.. 第一部分新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤及丙酮酸乙酯的干预作用研究 材 料和结果??. 讨论??.. 附图表??.. 参考文献??.. 第二部分丙酮酸乙酯对 新生大鼠缺血缺氧后脑内炎症反应的作用研究 材料和方法结果??. 讨论??.. 附图表??.. 参考文献??.. 第三部分丙酮酸乙酯在新生大鼠脑缺血缺氧白质损 伤保护中的抗凋亡作用 材料和方法结果??. 讨论??.. 附图表??.. 参考文 献??.. 全文总结. 致谢? 攻读学位期间发表的学术论文 学位论文评阅及答辩 情况表? 英文文章 英文文章??..山东大学博士学位论 文?.??..? .?.?..??.?.?.?..?...?.?..?.?.?...??.?. ....?.?.?..??.?.?...?.?..?.?.?...?..?..??...?...?.。. ?.??.?.。?。?.??..?.?.?.。?.?.?.?.. ??..??.?.?.?.??。?.?.??....?...?.?.??.?.?..?.? ? 甜 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要靶细胞。缺血和感染是导致新生儿的两大主要原因,最终病理结果均为白 质的损伤与丢失。对新生儿缺血缺氧性脑损伤的治疗,目前国内外尚无统一、 有效的治疗,探寻更有效的治疗方法己成为围产医学中的重要课题。丙酮酸 乙酯 ,是一种安全、稳定且极易被细胞摄取的物质,已在 动物实验中被证实具有较强的抗炎和自由基清除作用。研究表明,丙酮酸乙酯具 有一定的神经保护作用,但有关于其在白质损伤中的作用及机制研究尚无报道。 本试验在未成熟大鼠制备的脑缺血缺氧损伤动物模型基础上,研究丙酮酸乙酯对 缺血缺氧所致白质损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。 方法: 将日龄未成熟新生大鼠随机分为三组:对照组、缺血缺氧组 组、丙酮酸乙酯干预组组。对照组仅切开颈部皮肤;缺血缺氧组结扎 右侧颈总动脉伴缺氧环境% ;丙酮酸乙酯干预组:建立新生大鼠 脑缺血缺氧模型,于缺血缺氧后 、、分别三次给予丙酮酸乙酯山东大学博士学位论文 /腹腔注射,体内评估丙酮酸乙酯对白质损伤的保护作用。 .新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤及丙酮酸乙酯的干预作用研究:对照组、组、 组分别于术前、术后天、天、天、天、天、天固定时间点测 量幼鼠体重,比较各组幼鼠的生长发育情况;在模型建立后天、天、天, 通 过组织切片染色观察新生大鼠缺血缺氧后脑白质损伤的病理变化;应用免 疫组化方法对不同发育阶段的晚期少突胶质前体、未成熟、成熟标志物进 行检测,观察缺血缺氧后的损伤情况及丙酮酸乙酯的作用。 .丙酮酸乙酯对新生大鼠缺血缺氧后脑内炎症反应的作用研究:缺血缺氧后 天、天,应用免疫组化分别对星形胶质细胞标志物、小胶质细胞标志物进行检 测,观察两种炎性细胞的激活情况;缺血缺氧后小时、小时、天、天, 分别提取各组新生大鼠脑组织蛋白,应用酶联免疫吸附实验检测肿瘤 坏死因子一?、白细胞介素一 一的表达情况。 .丙酮酸乙酯在新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤保护中的抗凋亡作用:缺血缺氧 脑损伤后,应用免疫荧光双标检测幼鼠脑内少突胶质细胞凋亡情况,应用 检测各组幼鼠脑室周围白质内 、、一 的蛋白表达水平,并进行相关性分析。 结果: .丙酮酸乙酯对新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤具有显著保护作用 丙酮酸乙酯提高了新生大鼠缺血缺氧后的成活率:对照组幼鼠饮食、活动均 正常;工组新生大鼠死亡率.%,出现不同程度的异常反应;丙酮酸乙 酯干预组死亡率降为.%。 丙酮酸乙酯改善了幼鼠缺血缺氧脑损伤后的生长发育情况:术前各组新生大 鼠体重无显著性差异.,缺血缺氧后天至周幼鼠体重增长速度 较对照组明显缓慢.,丙酮酸乙酯干预使幼鼠的体重生长速度显著 增快.。 不同时间点组织切片染色可见:对照组脑白质结构正常,染色清晰;缺 血缺氧后新生大鼠脑白质细胞水肿、结构疏松、纤维紊乱,后期炎性胶质细 胞增生活化,脑室扩大明显,可出现软化灶。丙酮酸乙酯显著改善了缺血缺山东大学博士学位论文 氧后脑白质病理变化、抑制了侧脑室的扩大程度。 晚期前体、未成熟在缺血缺氧后明显损伤,数量较对照组显著减少 .,同时髓鞘相关蛋白表达亦显著减少.,出现低髓鞘化。 丙酮酸乙酯干预显著减轻了缺血缺氧导致的不同发育阶段的损伤与丢 失,改善了白质区域的髓鞘化程 度.。 .丙酮酸乙酯减轻了新生大鼠缺血缺氧后脑内的炎症反应水平 新生大鼠缺血缺氧后天、天脑内小胶质细胞、星形胶质细胞显著激活, 活化细胞数量明显增多.,丙酮酸乙酯有效抑制了不同时间点两种 炎症反应细胞的活化增生.。 对照组新生大鼠脑内存在少量的、 表达;缺血缺氧后小时 新生大鼠脑内表达水平即开始上调,天后较对照组有更显著升高, 直到缺血缺氧后天仍维持在较高的水平,较同日龄对照组比较差异均有 显著意义.,丙酮酸乙酯显著降低了幼鼠脑内不同时间点?的 表达水平.; 的表达水平于缺血缺氧后小时、小时、 天、天亦呈逐渐升高趋势.,丙酮酸乙酯使各时间点 的表 达显著下降.。 .丙酮酸乙酯在新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤保护中的抗凋亡作用 免疫荧光双标结果显示,缺血缺氧后天脑室周围白质少突胶质细胞前体 存在明显凋亡,凋亡细胞数量较对照组明显增多.,丙酮酸乙酯使 凋亡细胞数量显著减少.。 新生大鼠缺血缺氧脑损伤后白质内凋亡因子一显著激活., 腹腔注射丙酮酸乙酯降低了一的激活水平.。 丙酮酸乙酯对促凋亡蛋白的作用 新生大鼠脑缺血缺氧损伤后白质蛋白表达水平较对照组明显升高 .,丙酮酸乙酯干预使表达水平显著降低.。 丙酮酸乙酯对抗凋亡蛋白一的作用 新生大鼠脑缺血缺氧后白质一表达水平显著降低.,丙酮酸乙 酯明显升高了脑损伤后一的表达水平.。 /值与凋亡呈正相关山东大学博士学位论文 相关性分析显示:同一时间点,缺血缺氧后新生大鼠脑白质内/一值 增高与凋亡增多成正相关性。丙酮酸乙酯显著降低了缺血缺氧后 /一值,对细胞凋亡起保护作用。 结论: .本实验成功建立了日龄未成熟新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤模型,该模型 以少突胶质细胞前体损伤为主、与人类早产儿脑室周围白质损伤病理相似。 .丙酮酸乙酯对未成熟大鼠缺血缺氧所致白质损伤具有显著的保护作用,能改 善缺血缺氧后幼鼠的生长发育情况。 .丙酮酸乙酯抑制脑缺血缺氧后炎症 反应细胞的激活、降低其调控的炎症因子 的表达水平,抗炎作用参与了丙酮酸乙酯的白质损伤保护作用。 .凋亡是缺血缺氧少突胶质细胞损伤的重要机制,丙酮酸乙酯具有显著的抗凋 亡作用,可抑制促凋亡因子的产生,升高抗凋亡因子的表达水平。 .该研究为临床治疗早产儿缺血缺氧性白质损伤提供丰富的动物实验信息及依 据,为进一步研究早产儿白质损伤的防治提供了可能的干预手段和理论依据。 关键词:缺血缺氧;白质损伤;少突胶质细胞; 丙酮酸乙酯; 炎症反应;凋亡 山东大学博士学位论文 ?:,,. .。 / . . ., , .., ?., .。: .:;%; /, ,. .山东大学博士学位论文 .?.,?一?., ,一.:..., ..,,, .... ... .?. .., .., ? 一仪 一..山东大学博士学位论文 .?. ..., .’.. :.....?,..,..?.. . :; ;; ;; 山东大学博士学位论文 缩写 ..主要英文缩略词表 英文全称 .?’,一 ?曲 ..中文名称 细胞淋巴瘤蛋白. 半胱氨酸天冬氨酸酶 中枢神经系统 ,.二氨基联苯胺 ’,二脒基..苯吲哚盐酸 酶联免疫吸附法 丙酮酸乙酯 异硫氰酸盐荧光素 胶质纤维酸性蛋白 苏木素.伊红染色 缺氧缺血 高迁移率族蛋白 高倍镜视野 辣根过氧化物酶 离子钙接头分子. 白介素一 脂多糖 髓磷脂碱性蛋白 核因子. 光密度 少突胶质细胞 少突胶质前体细胞 日龄 磷酸盐缓冲液 苯甲基磺酰氟山东大学博士学位论文 .【 脑室周围白质软化 十二烷基硫酸钠 三羟甲基氨基甲烷缓冲盐液 四甲基乙二胺 肿瘤坏死因子.‘ 脑室周围白质损伤 山东大学博士学位论文 引言 围生医学及新生儿重症监护技术近年来有了长足发展,早产儿存活率逐渐升 高。早产儿机体发育不成熟、机体功能不完善,比足月儿更容易遭受各种损伤, 尤其是脑损伤,与之伴随的早产儿神经发育障碍的发病率亦呈明显上升趋势。根 据神经病理学分类,早产儿脑损伤可分为:?脑白质损伤 ,,包括脑室周围白质软化 ,和弥散 性脑白质损伤;?非脑实质区出血,包括脑室周围脑室内 出血、蛛网膜下腔出血 及脉络丛出血等;?其他部位损伤,如脑实质、小脑、脑干等。脑白质损伤是早 产儿最常见的脑损伤类型,主要发生于胎龄周的早产儿,己成为新生几脑 损伤的重要形式。 脑白质的损害可以破坏神经元之间、皮质和皮质下中枢之间的信号传递,继 而导致临床上出现学习记忆能力障碍、视觉空间能力下降及精神运动功能的缺 陷,造成严重的神经、运动系统后遗症。研究显示:早产儿在围生期发生脑白质 损伤后,%一%在学龄期会表现出认知和学习障碍,%一%可产生视觉异常 ,超过%的患儿可出现不同程度的永久性运动功能障碍,脑瘫发生率可达%口。 被认为是导致脑瘫发生的最主要危险因素,存在脑白质损伤的患儿发生脑瘫 的危险几率将增加倍瞄。早产儿脑白质损伤严重影响患儿的学习及生活能力, 其后遗症的治疗和护理也给社会和家庭带来严重的经济负担。因此,研究早产儿 白质损伤的发病机制及治疗策略,对于提高早产儿生存生活质量、降低残疾发生 率、减轻社会经济负担有极其重要的意义。 病灶伴随着血管的发育而发生,大脑白质主要由细长且无侧支循环的穿 支动脉供血,这一特点决定了脑白质区,特别是侧脑室前角附近、后三角区白质 及侧脑室外侧和背侧白质区域更容易受到缺血缺氧性损伤。病灶多为双侧性,也 可表现为单侧发病。早产儿有两种病理类型,即和弥散性白质损伤。 以脑室周围深部白质的局灶性坏死及坏死后囊性变为病理特点,脑白质正常组织 结构破坏,坏死边缘部位轴突肿胀,部分破裂,后可见胶质瘢痕、软化囊腔形成; 弥散性白质损伤多见于长期存活的早产儿,少见囊腔性改变,主要以弥漫性髓鞘 化障碍、胶质瘢痕形成为特点。近年来,弥散性白质病变成为早产儿的主 山东大学博士学位论文 要类型,典型的发病率已不足%瞄。 脑白质的主要成分为神经纤维及神经胶质细胞,包括少突胶质细胞 ,、星形胶质细胞、小胶质细胞 、室管膜细胞及脉络丛上皮细胞。作为脑白质的主 要组成细胞,神 经胶质细胞能够合成并分泌一系列神经活性物质,帮助维持脑内环境的离子平 衡,起到支持、绝缘和屏障作用。是脑白质中数量最多的胶质细胞,其次是 星形胶质细胞。在胚胎发生时起源于神经管的神经上皮细胞,在神经胶质中 发育最晚。直到围产期,少突胶质前体细胞 ,才开始从室管膜和室下层迁移,经过一定距离的迁移后形成有髓神经纤维 的髓鞘。在由先祖细胞到成熟少突胶质细胞的发育中,其形态、表达产物和功能 呈现一个渐变及连续的过程。的发育分为个阶段:先祖细胞、早期少突胶 质前体细胞、晚期少突胶质前体细胞、未成熟、成熟哺。成熟的是中 枢神经系统 ,的髓鞘形成细胞,能合成等 髓鞘蛋白,包绕神经纤维的轴突形成髓鞘口。通过对不同发育阶段的特异性 细胞表面抗原进行分析,发现晚期少突胶质前体是早产儿脑白质损伤的关键靶细 胞随。等研究证实:高度危险的发育与人脑白质发育期一致,在孕龄 周,晚期前体细胞和未成熟是脑室周围自质的主要细胞群,此期正是 发生的高峰期,表明晚期前体和未成熟细胞是发生的潜在靶细旧。 晚期前体和未成熟细胞进一步分化发育为成熟,如果损伤发生在髓鞘 形成之前,将使白质髓鞘化受损,最终导致脑白质发育不良和脑室扩大,促进 发生。 近年来,有关于早产儿脑白质损伤的机制一直是国内外研究的热点。大量研 究显示,对损伤的易感度具有一定的成熟依赖性,处于快速分化期的晚期 前体对于各种打击如:缺氧缺血、氧自由基攻击、兴奋性氨基酸以及炎症细胞因 子具有很高的敏感性。相对于成熟,少突胶质前体对各种损伤因素更加敏感、 耐受性更低 ,但具体机制目前还不甚清楚。早产儿存在着抗氧化防御缺陷 及反应的延迟,不利于对抗各种损伤,也就造成了围生期脑白质的易损性。因此, 在早产儿脑白质损伤的发病机理中,的选择易损性起着决定性作用。 现有研究表明,缺血缺氧?,和感染是导致新生儿脑山东大学博士学位论文 白质 损伤的主要原因。现有的动物模型也主要是建立在这两大原因之上,包括 诱导脑缺血缺氧和脂多糖,注射 】。对缺血缺氧 损伤尤为敏感,缺血缺氧对个别脑区的的损伤程度甚至比神经元更为明显 。早产儿缺血缺氧所致脑白质损伤发病率高、神经后遗症明显,而目前对新生儿缺 血缺氧性脑病的治疗仅局限于支持对症治疗,尚缺乏促进神经再生的有效手段。 因此,正确认识早产儿缺血缺氧脑白质损伤发生的特点及机制、探寻治疗白质损 伤更有效的方法已成为围产医学中的重要课题。 丙酮酸乙酯 ,是稳定的亲脂性的丙酮酸酯化物,其分 子式为。:。,相对分子质量为.,电中性,化学结构稳定。原本 作为一种工业原料而被广泛应用。最先用于动物实验是作为丙酮酸的替代物。丙 酮酸是机体能量代谢的主要中间产物,当机体氧供应充足时丙酮酸在线粒体内氧 化为乙酰辅酶,维持三羧酸循环;当氧供应不足时在乳酸脱氢酶的作用下转化 为乳酸,为机体供能 。同时,丙酮酸也是重要的内源性抗氧化剂和自由基清除 剂。等最初研究发现丙酮酸具有抗氧化作用,可以减少氧自由基的产 生,是有效的活性氧清除剂 。但是,丙酮酸在水溶液中不稳定,容易快速自发 的反应生成一羟基一一甲基一一酮戊二酸,这是一种有潜在毒性的物质,它可以 自发的环化脱水生成烯醇内酯,抑制线粒体内三羧酸循环中一酮戊二酸氧化脱 羧基形成琥珀酰辅酶酰的反应 。因此,丙酮酸乙酯作为一种治疗药物在临床上 的应用受到了一定限制。 为了找到一种稳定的、具自由基清除作用的丙酮酸衍生物,研究者们近年来 进行了大量的试验工作。等于年研究发现林格氏丙酮酸乙酯溶液较丙 酮酸溶液更稳定,无毒性,能极大的改善肠系膜缺血再灌注后肠粘膜结构和功能 的损伤程度。同时发现,相同摩尔浓度的丙酮酸乙酯比丙酮酸的保护作用更加显 著。此后有关于丙酮酸乙酯对各种疾病模型的保护作用研究倍受关注。丙酮酸 乙酯的保护作用机制主要集中于以下方 面:作为丙酮酸的前体物质,丙酮酸乙酯 在细胞内外通过酯类水解产生丙酮酸,后者形成后作为代谢底物进入三羧酸循环 提供能量引。在能量代谢障碍相关疾病中,产生的丙酮酸作为代谢物能够降低细 胞浆中/比值,维持细胞磷酸化状态;/比值增高, 丙酮酸乙酯也可以作为代谢产物,减少的消耗,减轻线粒体的损害。这能部山东大学博士学位论文 分解释丙酮酸治疗失血性休克、心肌缺血再灌注模型等的作用机制 。另一方面, 由于丙酮酸乙酯的酮基具有较强的抗氧化性能,无需酶的催化便可降低。。的产 生,因此丙酮酸乙酯是一种有效的抗氧化剂和活性氧清除剂乜,提示其可以用于 氧化应激相关疾病的治疗。第三,作为一种有效的抗炎物质,丙酮酸乙酯能够抑 制炎症信号转导通路的激活、减少早期炎症因子如?、? 及晚期炎症 因子高迁移率族蛋白一? ,一的合成或释放、 促进抗炎因子的生成和释放等 ’?,对感染及非感染性炎症都有明显的抗炎作 用。 年,等人首先在体外培养的神经细胞中报道了丙酮酸乙酯的 神经保护作用乜。通过清除内源性和外源性。。,对抗脂质过氧化,丙酮酸乙酯 能明显减轻多巴胺诱导的细胞毒性。随后,有关于丙酮酸乙酯神经保护作 用的研究逐渐展开。丙酮酸乙酯能够显著减轻海人酸诱导的海马神经元的损心, 对缺血性脊髓损伤也显示出一定的保护作用瞳。在成年大鼠的大脑中动脉阻塞模 型中,丙酮酸乙酯能显著减轻缺血后的脑损伤,改善后期脑功能,并且在该模型 中损伤后仍为干预治疗的有效时间窗乜’。以上研究结果提示,丙酮酸乙酯 能够对抗多种氧化应激引起的神经损伤,是一种潜在的神经系统保护物质,具有 很大的研究价值。 对于早产儿白质损伤目前尚缺乏有效的治疗手段,已证实丙酮酸乙酯具有一 定的神经保护作用,但是有关于丙酮酸乙酯对白质损伤的作用及机制尚未见报 道。本实验通过建立新生鼠脑缺血缺氧模型,探讨丙酮酸乙酯对新生大鼠白质损 伤的保护作用及其 可能的机制,为临床诊断和治疗早产儿白质损伤提供丰富的动 物实验信息及依据,探索可能的治疗途径和治疗靶点。 参考文献 【 ,, ,,,, , ,...,:.山东大学博士学位论文 【】 ,,,. :, ..,:?. 【】 ...,:. ...,:. 【, ,, ,. :..,:?. 】 ,, ,./..,:. 】 ,...,:. 】毛健.感染与早产儿脑白质损伤.急救医学., :.. 【 ,,,, ,.、析 . . ,:?. 【】 ,,..., ,:. 】 ,.. ..,, ?. 】, ,...,,?. 山东大学博士学位论文 梁涛,李淑蓉,邓其跃等.在嗅鞘细胞中的表达及活性检测.第三军医 大学学报.,:.. 】周爱儒主编.生物化学.第版.北京:人民卫生出版社,:.. ....:?. 】 .?. ., :. , ,, ,’/..,:?. , ,,,, .,..,: .】林心情,施毅.丙酮酸乙酯对脓毒症保护作用研究进展.中国呼吸与危重监 护杂志.,:.. , ,...,:?. . :.., :?. 【】 ,, ....?:. ,,,,.?..,: .】,, ,,,,.、? ? .. ,:?. ,,. 气山东大学博士学位论文 ?.., ?: .【】 , ,, ,..., :. 山东大学博士学位论文 第一部分 新生大鼠脑缺血缺氧白质损伤及丙酮酸乙酯的 干预作用研究 缺血缺氧脑损伤是新生儿脑损伤的重要形式,尽管当前孕期监测和新生儿重 症监护等医疗技术高速发展,但其发生率却无明显降低。脑室周围白质软化 ,为早产儿所特有的缺血缺氧性脑损伤, 是早产儿死亡及运动智能发育障碍的主要原因之一。新生儿缺血缺氧导致的脑白 质损伤,最典型的病变为神经纤维的髓鞘化障碍、脑白质发育不良。损伤是 白质损伤的中心环节和主要原因。未成熟脑白质中的对各种损伤高度敏感, 缺血缺氧可导致的大量死亡及分化发育障碍,且和有髓神经纤维的改变 发生早,不依赖于神经元的损害?。因此,损伤作为缺血时脑白质损伤的重要 原因,受到越来越多的重视乜。 对于早产儿脑白质损伤的动物模型,目前主要选用鼠、兔等,通过结扎供血 动脉诱导脑缺血缺氧 或脑内注射兴奋性毒素、脂多糖等产生脑白质损伤,不同的 动物及造模方法都有各自不同的特点。参考既往研究呤吲,本实验采用永久性结 扎新生大鼠单侧颈总动脉联合低氧法建立缺血缺氧性白质损伤模型。该模型 可使幼鼠术后数月结扎侧脑血流明显下降,发生类似人类脑白质损伤的病理学改 变。在建模基础上应用染色、免疫组织化学技术,观察缺血缺氧后脑白质病 理变化、不同发育阶段少突胶质细胞损伤及髓鞘发育情况,同时探讨丙酮酸乙酯 干预对缺血缺氧后白质损伤的保护作用。 材料与方法 一、 实验材料 一主要试剂及来源 .乙醚:天津市化学试剂三厂 .丙酮酸乙酯:美国公司 .小鼠单克隆抗体:美国公司山东大学博士学位论文 .小鼠单克隆抗体:美国公司 .小鼠单克隆抗体:美国公司 .山羊抗小鼠:美国?公司 .山羊抗小鼠:美国?公司 .正常山羊血清:北京中杉金桥生物技术有限公司 .显色液:武汉博士德生物工程有限公司 .免疫组化试剂盒:北京晶美生物工程有限公司 试剂:封闭液,%山羊血清 试剂:生物素化二抗 试剂:标记链亲和素 试剂:底物缓冲液 试剂:显色液 .多聚甲醛:上海碧云天生物技术有限公司 .包埋剂:美国公司 .各种浓度乙醇:天津市大茂化学试剂厂 .二甲苯:天津市大茂化学试剂厂 二实验主要仪器及器材 .常压缺氧舱:× 密闭有机玻璃舱,顶端有两个直径 小孔与 外界相通一孔通氮氧混合气体,另一孔与测氧仪相通,底层铺有钠石灰以 吸收。及湿气。山东济南有机玻璃制品厂定制 .型便携式数字测氧仪:杭州梅城电化分析仪器厂 .%。%。特种气体:山东济南德洋特种气体有限公司配制 .手术器械:山东新华医疗器械厂 .医用注射器:山东新华医疗器械厂 .数显电热恒温箱:江苏太仓科教器材厂 .超纯水系统:德国公司 .全自动高压灭菌器:德国公司 .电子天平:上海精科公司 .真空干燥箱:上海精宏公司山东大学博士学位论文 .普通冰箱:日本公司 .超低温冰箱:日本公司 .冰冻切片机:德国公司 .恒温恒湿孵育箱:上海林频仪器公司 .微量加样器:宁波镇海玻璃仪器厂 .旋涡混合器:上海精科公司 .手术外科显微镜:日本公司 .普通光学显微镜:日本公司 .显微镜摄像机:日本公司 .扫描仪:日本公司 .各种型号医用玻璃瓶、组织研磨器、玻璃器皿、胶塞、冲洗瓶、孵育盒、 定 时器、试剂存放槽等,由山东大学齐鲁医院心血管病实验中心提供。 三主要试剂及溶液配制 .%多聚甲醛 多聚甲醛 . /的 混合后边搅拌边加热,温度不超过。加热至。以上时滴加 至总量 , 至澄清每 滴加约滴。冷却后加. 调整值为.,置?冰箱备用。 .. 溶液 . .. . 加双蒸水至 .. 溶液 . 。.. ..加双蒸水至 .%蔗糖溶液 山东大学博士学位论文 蔗糖 加. 溶液至 .%蔗糖溶液 蔗糖 加. 溶液至 ..%溶液 加双蒸水至 ..%: %: 加双蒸水至 . 二、动物模型制作 一实验动物及分组 ?雌鼠,孕一天,只,清洁级,由山东中医药大学实 验动物中心提供动物生产许可证号:鲁。孕鼠在本实验室 动物房饲养,自由饮食,室温?一?,每日光照小时早点至晚点, 相对湿度保持在%一%,饲养过程中保持环境安静、尽量减少刺激。新生鼠按 出生同龄 ,计算,出生时设定为。生后幼鼠数量调整为一 只/窝,至幼鼠出生后第天进行实验操作,共只,体重.., 性别不拘。同窝幼鼠应用随机数字表随机分为三组进行实验: 假手术组简称对照组,组 缺血缺氧组简称实验组,组 缺血缺氧丙酮酸乙酯干预组简称药物干预组,组 二造模方法 .将新生大鼠用无水乙醚麻醉,取仰卧位,固定头部及四肢。 .碘伏消毒颈部皮肤,取颈部正中长 约切口。 .逐层分离皮下组织及筋膜,找出血管神经束,钝性分离右侧颈总动脉,用? 手术丝线永久结扎血管近端及远端,避免损伤迷走神经。 山东大学博士学位论文 .缝合皮肤,碘伏消毒,整个手术时间控制在分钟以内。 .术后将幼鼠置于?水浴箱内分钟,待其苏醒后,将其置于有机玻璃缺 氧舱内,通以含%氧气的氮氧标准混合气体中,持续小时,流量?. /。 密闭箱底部置于。水浴中以保持恒温,缺氧开始的分钟内气体流速为 /,以使箱内气体快速达到平衡。 .缺氧完成后将动物置于?水浴箱内放置?分钟,至体温和活动恢复正 常,返回母鼠身旁喂养。 .对照组仅游离右侧颈总动脉,不予结扎动脉和缺氧,以尽量消除手术应激的 影响。模型建立过程中造模不成功或者死亡的新生大鼠被剔除实验,另随机 选取相同喂养条件下的新生大鼠按照相同建模步骤进行差额补齐。 三丙酮酸乙酯治疗 .丙酮酸乙酯林格液的配制 丙酮酸乙酯原液浓度为 /,将丙酮酸乙酯与林格液按照:的体积 比进行稀释,震荡均匀,高压灭菌后保存于。冰箱备用。丙酮酸乙酯具有一定 的挥发性,抽取后应尽快混入林格液中。 .丙酮酸乙酯干预 新生日龄幼鼠于缺血缺氧后 、、分别三次腹腔注射丙酮酸 乙酯,注射量按照 /体重计算。对照组与 组注射同等体积的灭菌生 理盐水。 三、脑组织标本采集及固定 一取材时间 缺血缺氧后的第天、第天、第天 ,,取对照组、缺 血缺氧组及药物干预组存活大鼠各只,共只,进行染色及免疫组织化 学染色,观察皮层下及脑室周围白质损伤情况。 二脑组织标本采集及固定方法 .应用乙醚将幼鼠深度麻醉,仰卧位固定于手术台上。 .用镊子夹起幼鼠腹部皮肤,用眼科剪在上腹部剪口,沿前正中线向上剪 至颈部,剥离皮下结缔组织,翻开皮肤。山东大学博士学位论文 .沿肋骨边缘剪开腹腔上部,沿前正中线剪开胸骨,暴露幼鼠心脏。 .用镊子小心清理心包周围组织,在幼鼠心脏上滴加少许生理盐水。 .将灌注针针头插入左心室并固定, 快速灌注高压灭菌的生理盐水,保持一定 的液体滴注速度。用眼科剪在右心耳剪开一小口,使体内血液排出。如此滴 注直到肝脏变白、心脏流出液变清,表明灌注效果良好。 .以%多聚甲醛固定液进行灌注,多聚甲醛滴入幼鼠血管后,幼鼠可出现全 身肌肉抽动,待幼鼠肝脏变硬、身体僵硬时,停止灌注固定。 .小心剥取脑组织并修块,立即将之置于%多聚甲醛中固定小时。 .将脑组织依次移入%、%的蔗糖溶液.进行梯度脱水至标本下沉 至瓶底。 .使用低温恒冷切片机于一。进行组织块包埋,包埋好的组织块保存于 一?冰箱备用。 .将低温恒冷切片机头温设定于一?,箱温设定于一?进行连续冰冻冠状切 片,片厚 ,每间隔张取张,分别进行、、、、?、 荧光双标及染色。切片置于一冰箱保存备用。 四、组织切片睢染色 一研究时间点 取造模后天、天、天的对照组、实验组和药物干预组大鼠脑组织切片 进行染色,光镜下观察皮层下白质、脑室周围白质及脑室病理变化。每组每 个时间点取用?只幼鼠脑组织,每个脑组织取张切片进行染色。 二实验步骤 .将切片从冰箱中取出,室温晾置 。.室温,水化 。.切片浸入苏木素中,染色约 。.流动自来水冲洗 。.%盐酸乙醇分化 。.流动自来水冲洗 。.%稀氨水返蓝数秒,自来水冲洗 。山东大学博士学位论文 .切片浸入伊红染液中 。.流动自来水冲洗 。.%、%、%、%酒精梯度脱水。 .无水乙醇、各。 .二甲苯、各 。.中性树胶封片固定,室温晾干。 五、免疫组织化学 一研究时间点 、、染色分别于缺血缺氧后第天、第天、第天进行。 用于标记晚期前体,标记未成熟,标记成熟,用于观察白质髓 鞘化程度。每种检测指标,对照组、缺血缺氧组及药物干预组存活大鼠各只。 二免疫组织化学步骤 .将切片从冰箱中取出,室温晾置 。.将切片置于.的液中水化 。..%。封闭 ,以消除内源性过氧化物酶的活性,漂洗 次。 .加入%的山羊血清室温封闭 ,甩去封闭液,滤纸吸除多余的水分。 .加入稀释的一 抗,。避光孵育过夜,以代替一抗作为阴性对照。、 稀释浓度为:,稀释浓度为:。 .室温下复温 ,漂洗 ×次。加入稀释的山羊抗小鼠或山 羊抗兔生物素化二抗,。孵育 ,漂洗 ×次。 .加入辣根过氧化物酶标记链亲和素复合物,。孵育一 ,漂洗 ×次。 .避光,室温,加入新鲜配制的显色液,在显微镜下观察显色情况,待 显色充分而标本背景较浅时,双蒸水冲洗终止染色,时间约需 。.不同浓度酒精梯度脱水。 .用二甲苯进行透明。 .中性树胶封片,室温晾干。山东大学博士学位论文 .显微镜下观察染色结果,以细胞膜或细胞浆有棕黄色颗粒沉着为阳性染色, 行图像采集。 六、侧脑室面积指数计算 为比较不同时间点各组幼鼠的脑室面积扩大程度,我们采用脑室面积指数进 行统计。每只幼鼠大脑取材部位为前囟前开始收集切片,每张取张, 共取张,切片经染色后,使用扫描仪在同等条件下进行扫描。将扫描的图 像应用软件进行分析,按照灰度的不同分别描示两侧脑室与整个脑片的 面积。脑室面积指数双侧侧脑室面积之和/整体脑面积 %哺’。 七、图像采集及分析 、免疫组化的分析,采用计数高倍镜视野阳性染色细胞数目的方法。 应用倒置显微镜采集图像,用? .软件进行图像分析。 每个脑块取张切片,每张切片取阳性细胞表达最丰富的视野采集张图片,计 数×视野下的阳性细胞数目,每个视野的实际面积为. 。张切片阳 性细胞数目的均值代表一只幼鼠。每个时间点每组幼鼠统计数目为只。 染色采用平均光密度值 ,进行统计。倒 置显微镜采集图像后,用? .软件进行图像分析。选取× 镜下切片,随机选取脑室周围白质区域同一部位的个视野采集图像,计算每个 视野阳性染色的平均值。以阳性染色与空白区交界处为背景,计算 平均值时将其减除。 八、统计学处理 采用.统计软件分析,各组数据均以均数?标准差表示。每组数据 进行正态性分布检验,根据方差齐性检验结果,两组间比较采用两样本检验, 多组间比较采用单因素方差分 析。.表示差异具有显著性意义, .表示差异有非常显著性意义。 山东大学博士学位论文 毋士田 口代 .实验动物数量分析 实验中对照组新生大鼠存活率%/;组死亡率.%/, 最终进入结果分析只,大多于造模过程中或造模后小时内死亡,以缺氧过 程死亡最为明显;组死亡率为.%/,最终进入结果分析只。 .术后一般情况 各组新生大鼠术前进食、活动正常。工组新生大鼠在颈总动脉结扎 内出现不同程度的异常行为反应,主要表现为呼吸微弱、皮肤苍白、肌肉震颤以 及活动减少。置于温箱中恢复 后,新生大鼠的循环状况有一定程度改善, 呼吸较平稳,但仍差于对照组。缺氧期间,新生大鼠皮肤苍白加重、呼吸进一步 变浅,烦躁不安,可出现四肢抽动、甚至频繁点头状抽搐,少数新生大鼠因呼吸 衰竭而死亡。缺氧结束后,新生大鼠皮肤逐渐转为红润,异常活动减少,返回母 鼠身旁 后未再见异常反应。组亦存在上述异常反应,但反应程度较 组明显减轻。 .体重增长速度 对照组、组和组,每组随机选取只,测量每只大鼠造模前的体 重。对照组、组、组术前平均体重分别为.?.克、..克、 .?.克,各组间体重无显著差异.。从术后第天起至术后周, 固定时间点测量各组大鼠体重数据见表卜。术后第天组幼鼠无明显的 体重增长,对照组则增长为.?.克,两组比较差异有统计学意义.。 术后第天,组体重缓慢增长,平均体重为..克,对照组为. ?.克,两组比较差异有显著统计学意义.。至生后周,工组体重 都明显轻于对照组,差异有统计学意义.。应用干预后的幼鼠, 术后天体重增长为.?.克。至术后天,组大鼠的体重生长速 度慢于对照组,但显著快于组.。图 .组织病理学变化 本研究采用新生鼠脑缺血缺氧模型引起一种不完全性可逆的白质损伤。光镜 下观察,各时间点对照组新生鼠皮层、白质区域层次清楚,细胞排列整齐有序, 形态结构正常,染色清晰。神经纤维排列致密,走向整齐。组与组新山东大学博士学位论文 生鼠左侧大脑皮层、白质 结构基本正常,未发现明显的病理学改变。 缺血缺氧后天,工组新生大鼠的结扎侧大脑皮层下以及脑室周围白质组 织结构紊乱、疏松,内可见多个囊性疏松坏死区域;脑室周围白质细胞水肿,细 胞周围间隙增宽,可见部分细胞凋亡,凋亡细胞呈核固缩和胞浆溶解;白质神经 纤维排列紊乱,成网状和条索状。但大脑皮质区域结构清晰,细胞排列整齐,形 态正常,仅可观察到少数神经元细胞水肿。组新生鼠脑白质染色仍偏淡, 但损伤情况较工组明显改善,白质疏松和神经纤维紊乱明显好转,未发现明显 的凝固性坏死和囊状病变,部分白质结构接近于正常。图卜 缺血缺氧后天,工组幼鼠结扎侧脑白质疏松水肿较前减轻,但脑组织结 构层次与对照组相比仍不清晰;出现不同程度的胶质细胞增生,在囊性坏死区可 见散在分布的胶质细胞增生区;脑室进行性扩大。组结构稀疏化程度明 显减轻,见较少的胶质细胞,无明显胶质瘢痕形成。侧脑室较组明显缩小, 但较对照组仍扩张明显。图卜 缺血缺氧后天, 工组较对照组脑白质染色仍浅且疏松,部分幼鼠可出 现脑白质软化灶,脑内核团组织如内囊、尾状核发育不清,侧脑室扩大明显。 组白质染色介于对照组与组之间,组织结构稍紊乱,脑室扩大较工组减轻。 图卜 .丙酮酸乙酯对缺血缺氧后脑室扩大的作用 脑室扩大是缺血缺氧所致脑白质损伤的病理改变之一,本研究应用脑室面积 指数来反映后侧脑室扩大情况。如图卜所示,对照组、、各个时 间点侧脑室形态规则。组缺血缺氧天后,即可见双侧侧脑室扩大,形态不 规则,结扎侧脑室扩大较对侧更为明显,随后脑室呈现进行性扩大。各时间点 组脑室面积指数较对照组明显升高表卜,差异均有显著统计学意义 .。而干预有效阻止了各时间点脑室扩大,脑室面积指数均高于 组.。其中时,完全抑制了缺血缺氧后侧脑室的扩大,与对照组 比较无差异.。图卜,卜 .免疫组化评估丙酮酸乙酯对数量的影响 前体与不成熟细胞是脑白质损伤的主要靶细胞,应用免 疫组化方法评估 缺血缺氧后的损伤情况及丙酮酸乙酯的保护作用图卜,卜。、、 山东大学博士学位论文 分别标记晚期前体、未成熟与成熟,采用阳性细胞计数与染色 的平均光密度对各组数量、髓鞘化程度进行比较表卜。 晚期少突胶质前体: 新生鼠脑白质仍以晚期前体为主,对照组新生鼠脑白质中存在大量的 细胞,主要分布于胼胝体、扣带回及皮层下白质。根据免疫组化染色结果, 阳性染色主要位于细胞膜,细胞形态规则,染色均匀。与对照组比较,缺血缺氧 后天,工组晚期前体阳性细胞数目显著低于对照组同日龄新生大鼠 .,且细胞形态不规则,边缘不齐,阳性染色不均,呈颗粒状,显示 组新生大鼠存在前体的明显受损和丢失。组数量较组明显增 多.,细胞形态接近于正常,提示能显著改善缺血缺氧所致前体 的损伤。 未成熟少突胶质细胞: 日龄新生大鼠的脑白质内存在较多的未成熟。未成熟的分布与晚期 前体相似,主要位于胼胝体及皮层下白质,阳性表达亦主要位于细胞膜,染 色分布均匀,边缘整齐。组新生鼠脑白质未成熟数目较对照组减少% .,细胞形态发生改变,类似受损前体。干预后,未成熟的数 目明显增多,较同日龄幼鼠差异有显著统计学意义.。 成熟少突胶质细胞: 为成熟标记物。成熟为髓鞘形成细胞,染色用于评估成熟 损伤程度及脑白质髓鞘化程度。时,对照组幼鼠脑白质可见阳性颗粒, 呈棕黄色,沿神经束成行排列,主要分布于扣带回、胼胝体及外囊部位。有髓神 经纤维形态规则,边界清晰,结构致密,密度均匀,染色深。缺血缺氧后,幼鼠 脑白质内的染色明显浅于对照组,有髓神经纤维形态不规则、排列松散,提 示后新生鼠脑白质内存在髓鞘形成障碍。与对照组比较,工组染色的平均 值显著下降.。注射后,的表达水平明显升高,有髓神经纤维形 态较为规则,平均值与工组比较亦有显著提高.。 山东大学博士学位论文 讨论 是早产儿脑损伤的重要形式,与脑瘫、智力低下等神经功能障碍密切相 关。在体重 的新 生儿中,脑白质损伤的发病率为%一%;在胎龄 周的新生儿中发病率为%一%,远高于在足月儿中的发病率,患个月时 脑瘫发生率高达%豳。作为脑白质的主要组成细胞,神经胶质在早产儿脑损伤 的发病机制、病理变化中占有重要地位,对脑功能恢复起着关键作用。深入研究 神经胶质缺血缺氧损伤机制,对探寻有效的治疗策略和干预手段具有重要意义。 脑白质中数量最多的细胞类型是少突胶质细胞。相对于其他细胞, 发育较晚,前体在胎龄周时才逐渐开始分化发育转化成为成熟。由此推断, 胎龄越小的早产儿脑白质中,前体细胞数量越多。依据抗原表达、形态和功能, 可将的发育分为个阶段:先祖细胞、早期少突胶质前体细胞、晚期少突胶质 前体细胞、未成熟、成熟。研究证实,早产儿好发于胎龄周的早产 儿,此时一的晚期少突胶质前体是构成其脑室周围白质的主要细胞类型,且 胎龄越小,少突胶质前体的数量越高阳。在新生鼠脑缺血缺氧损伤模型中,通过 对不同发育阶段的易感性进行分析发现:少突胶质前体细胞对缺氧缺血损伤最 为敏感,最易发生凋亡,而发育成熟的抵抗力较强口。有研究显示,日龄大 鼠神经系统发育相当于人类足月或近足月的新生儿,该时期新生大鼠的脑白质内 主要为成熟,并已形成早期的髓鞘化引,此时单侧颈总动脉结扎联合低氧,造 成的脑部病变主要位于单侧皮质和海马神经元,不产生明显的白质损伤?。大鼠 脑白质的易损期是生后天,此时脑白质内以晚期少突胶质前体细胞为主,因 此进行早产儿脑白质损伤研究宜选用生后?天的未成熟大鼠口。根据等 的实验研究,日龄大鼠单侧颈总动脉结扎联合低氧操作难且幼鼠死亡率较高 ,本实验遂采用日龄大鼠建立脑缺血缺氧自质损伤模型。 大鼠脑的血供与人类相似,颈内动脉系统在大脑底部形成环,单纯 结扎一侧颈总动脉后,缺血侧大脑仍可以得到侧枝循环供血,不能造成理想的缺 血性脑损伤模型。单侧颈总动脉结扎联合缺氧处理才能在缺血侧大 脑形成缺血缺 氧脑病的病理改变 。实验表明,新生大鼠单侧颈总动脉结扎伴低氧可使皮层下 大脑血流降至脑基本血流量的%一%,造成选择性白质损伤,而灰质损伤不明山东大学博士学位论文 显。本实验通过结扎新生大鼠单侧颈总动脉伴随缺氧环境 ,造成脑 缺血缺氧白质损伤模型。在造模过程中,通过以下几点提高模型成功率:一是颈 总动脉准确分离并结扎。手术操作过程要熟练,控制手术操作时间,尽量避免牵 拉迷走神经影响生理功能。分离出血管后要见血管搏动、有动脉血通过才可结扎, 采用双重丝线结扎方式,确定血流被阻断;二是维持缺氧过程中低氧环境的稳定。 在缺氧开始的分钟内气体流速为/,使缺氧舱内的氧气浓度迅速降至 .%,后流量为./、持续小时,不定时检测舱内氧浓度维持在.%。 应用此法可使缺氧舱内达到低氧浓度并保持稳定;三是保持操作过程温度的恒 定。温度过高可加重脑损伤,增加新生鼠的死亡率;过低则对脑损伤起到一定的 保护作用,影响模型的制备效果。造模过程中,水浴箱温度设置在?,且缺 氧舱大部分浸于温水中保持舱内温度与水温接近,以减少温度对模型的影响。本 研究中幼鼠结扎侧脑组织光镜下均可见明显病理改变,各批次模型幼鼠脑组织病 变稳定,证明本实验缺血缺氧白质损伤动物模型是成功的。 本实验结扎单侧颈总动脉伴缺氧幼鼠的死亡率为.。实验中可观察到 组幼鼠发生惊厥,但缺氧后幼鼠返回母鼠身旁喂养,确切的惊厥发生率难以 统计。组新生鼠体重增长速度低于对照组,说明缺血缺氧延缓新生大鼠的生 长发育。推测缺血缺氧可能损伤了海马饮食中枢,导致幼鼠食欲下降、摄食活动 减少,生长发育速度减缓。丙酮酸乙酯干预降低了造模后幼鼠的死亡率,改善了 幼鼠的一般状况。同时,幼鼠体重增长速度与组比较有明显提高,提示丙酮 酸乙酯能改善幼鼠生长发育迟滞,这可能与其减轻缺血缺氧脑损伤相关。缺血缺 氧白质损伤可引起一系列的认知行为缺陷,本研究对缺 血缺氧动物模型的观察周 期较短,尚有待于进一步追踪观察丙酮酸乙酯的长期保护作用及对行为缺陷的改 善能力。 根据脑组织切片染色,该模型皮质结构、形态基本正常,病变主要集中 于白质区域。在脑白质损伤早期,即可观察到脑室周围及皮层下白质结构疏松、 纤维紊乱、细胞水肿;天后白质疏松水肿减轻,小胶质及星形胶质细胞出现增 生活化:周时可观察到实验组幼鼠脑白质软化灶形成、侧脑室明显扩大。该病 理变化过程与文献报道类似 。应用丙酮酸乙酯干预可显著改善白质疏松与神经 纤维紊乱的病理变化。白质损伤常伴随脑室扩大 ,实验发现缺血缺氧后天幼山东大学博士学位论文 鼠即出现侧脑室的扩大。脑缺血缺氧后前体损伤和丢失,致使成熟数目减 少,合成减少、髓鞘形成受阻,导致脑室壁张力强度降低,进一步脑室 扩大程度。丙酮酸乙酯可通过减轻的损伤抑制脑室扩大程度。 是白质的主要组成细胞,早产儿的重要病理特点之一是脑白质少突 胶质的丢失和髓鞘损伤。经历一系列形态变化和功能演变,少突胶质前体最 后分化发育为成熟的,而成熟是髓鞘形成的主要细胞。缺氧缺血损伤发生 后,晚期前体可出现大量凋亡,而未成熟和成熟则对损伤呈现出较强的 抵抗性,提示缺血缺氧和的成熟依赖易损性密切相关。易损性的机制 主要包括:氧化一抗氧化系统发育不平衡:在早产儿的脑白质中,分化十 分活跃, 在向成熟分化过程中合成大量的髓鞘膜、胆固醇及其他脂质, 使内源性过氧化物增加,细胞处于高度氧化状态,暴露于此环境下的极易受 氧化应激损伤。分化过程中的含有丰富的铁和铁结合蛋白,缺氧缺血时非蛋 白结合铁增多,这些游离铁可与过氧化物结合,形成攻击的羟自由基,从而 缺血缺氧易引起应激性氧化损伤。兴奋性毒性损伤:谷氨酸是哺乳 动物中最主要的兴奋性神经递质,以谷氨酸受体为主的兴奋性神经递质受体 过度活化可引起神经细胞死亡。急性脑缺血发生后的,脑室周围深部白质 损 伤部位部分轴突破裂,大量谷氨酸进入脑室周围白质。利用储藏在跨膜电位和 /浓度梯度的能量,电控的谷氨酸运载体可蓄积大量谷氨酸,通过受体途径 和非受体途径对起细胞毒作用。炎症反应介导的损伤:神经细胞 可以产生前炎症因子,表达黏附分子引发炎症反应。脑缺氧缺血后,小胶质及星 形胶质细胞被激活,活化的胶质细胞可释放一系列潜在的神经毒性物质和炎性因 子。通过增加血脑屏障的通透性,细胞因子可进一步激活小胶质细胞,并引发以 小胶质为起始的级联反应。当发生时,脑内可以检测到高浓度的损伤 的细胞因子,这些细胞因子激活少突胶质表面相应受体可导致细