人乳头瘤病毒16型长控制区上YY1结合位点的破坏可增强病毒诱导细胞永生化能力

人乳头瘤病毒16型长控制区上YY1结合位点的破坏可增强病毒诱导细胞永生化能力 人乳头瘤病毒 16 型长控制区上 YY1 结合位点 的破坏可增强病毒诱导细胞永生化能力 Ξ 董小平 刘周 伟红 () 中国预防医学科学院病毒学研究所 ,北京 100052 ( ) 摘要 细胞转录调节因子 YY1 可抑制人乳头瘤病毒 16 型 HPV 16癌基因启动子 P97 的活性 , YY1 位点的突变和缺失不仅可诱导 P97 活性增强而且可在全基因组内增强 E6 癌基因转录 , 同时使病毒对啮 齿 类 动 物 纤 维 细 胞 的 转 化 能 力 增 强 。为 了 观 测 人 乳 头 瘤 病 毒 16 型 长 控 制 区 ( ) HPV 16 L CR序列上 YY1 蛋白特异性结合位点破坏在完整基因组范围内对人原代包皮角源细 胞永生化能力的影响 ,将 HPV 16 YY1 位点突变株和野毒株转染至人原代包皮角源细胞 。筛选结 果表明 ,突变株可诱导形成永生化细胞 ,永生化能力明显高于野毒株 。对 4 株永生化细胞系 DNA 检测发现 ,均含有呈整合状态的 HPV 16 DNA ,其中 3 株的 E1/ E2 区域有缺失 。RNA 检测显示 ,4 株细胞内均有 E6/ E7 mRNA 的转录 。这表明 , HPV 16 L CR 上 YY1 蛋白特异性结合位点的破坏 , 可在完整基因组范围内增强病毒使人原代包皮角源细胞永生化的能力 。 关键词 人乳头瘤病毒 ,细胞转录调节因子 YY1 ,永生化 ,癌基因 ( ) “高危”人乳头瘤病毒 Human papillo mavirus , HPV基因组或病毒癌基因 ,可诱导原代角 〔1 ,2〕源细胞发生 永 生 化。多 种 细 胞 和 病 毒 因 子 可 影 响 HPV 16 早 期 基 因 启 动 子 P97 的 活 〔3〕性,从而可能影响位于 P97 下游的病毒癌基因 E6/ E7 的表达 。细胞转录调节因子 YY1 可 () 通过结合至位于 HPV 16 长控制区 Lo ng co nt rol regio n ,L CR的多个特异性结合位点对 P97〔4 - 6〕活性起抑制作用。我们以往的实验表明 , YY1 结合位点的破坏可能是病毒逃避宿主细胞 〔4 ,5〕监控系统 ,引起细胞发生转化甚至癌变的重要途径。在 HPV 16 全基因组范围内 , YY1 位 〔7〕点的突变可诱导 E6 特异性 mRNA 转录增加,并且使突变株对啮齿类动物纤维细胞的转化 〔8〕能力增强,这更加证实了这一学说的可 靠 性 。本 文 将 组 建 的 带 有 突 变 YY1 结 合 位 点 的 HPV 16 毒株转染人原代包皮角源细胞 ,以观测其对角源细胞永生化能力的改变 。 材料与方法 〔9〕 1 质粒构建 p1203 为 HPV 16 野毒株全基因组质粒 ,由 Dr1 P1 Howley 惠赠。pL XSN H16 E6 E7 为 HPV〔10〕16 E6/ E7 基因真核细胞表达质粒 ,由 Dr1D1 Galloway 惠赠。质粒 pDV390 、pDV1326 是我们以 p1203 为基 〔11〕本骨架建立的带有突变 L CR 序列的 HPV 16 全基因组 ,其构建过程及突变部位见文献。p H16 E6 - Ribo 我 〔7〕们构建的 HPV 16 E6 基因体外反向转录质粒 ,构建过程见文献。p H16 E7 - Ribo 为 HPV 16 E7 基因体外反 向转录质粒 ,构建过程如下 :以 Sp h ?和 Nsi ?水解质粒 p H16L CR E6 E7 ,除去质粒插入片段中 HPV 16nt17004 Ξ 首都医科大学附属口腔医院 ,北京 100050 1998 年 9 月 29 日收稿 ,11 月 27 日修回 。 ,561 区域序列 ; Klenow 酶末端处理后自身连接 ,所带 HPV 16 E7 基因片段为 nt1562,875 。 ( ) 2 细胞培养 人原代包皮角源细胞 Human p rimary keratinocytes f ro m foreskin , H Kf F购自 Pro moCell 公司 , ( ) 在无血清的角源细胞培养液 Keratinocyte growt h medium , KGM中生长 。 μμ3 H Kf F 细胞永生化实验 H Kf F 细胞转染采用 LipofectAM IN E 法 , 5g 质粒 DNA 同 10l LipofectAM IN E ( ) Gibco 公司产品室温作用 30 分钟 。将作用后的 DNA 滴加至 60mm 约 70 %,80 %生长丰度的单层细胞培 养皿中 ,次日 PBS 洗后换液 。细胞在无血清的 KGM 中继续培养 ,每周换 2 次液 ,8 周后光镜下观测生命延长 2 + ( ) 细胞 life - expanded span。将 生 命 延 长 细 胞 继 续 置 于 含 有 10 %小 牛 血 清 、2mmol/ L Ca的 混 合 培 养 液 () DM EM/ KGM ,1 :3 ,v : v进行筛选 、传代 ,4 周后观测永生化细胞 。 μ4 Sout hern 转印杂交 收集单层培养永生化细胞 ,在 100g/ ml 蛋白酶 K、015 %SDS 的条件下裂解细胞 ,提 μ取细胞 DNA 。10g 细胞 DNA 经不同的内切酶作用后进行 018 %琼脂糖凝胶电泳 。DNA 转印按常规法进 32 α行 。DNA/ DNA 杂交所用同位素- P - dA TP 为 Amersham 公司产品 ,缺口翻译反应试剂盒为 Pharmacia 公 司产品 。以 HPV 16 全基因组序列按试剂盒提供方法进行探针标记 。杂交 、洗膜以及放射自显影按常规法进行 。 ( 5 PCR HPV 16 L CR 区域扩增引物为 H16 - 7004 5’ - C T GC TAACC TA GA TCA GT T TCC T T TA GGAC - 3’ , ) () nt17004 - 7032和 H16 - 123 5’ - TCC T GT GGGTCC T GAAACA T T GCA G - 3’ , nt1123 - 99; E6/ E7 区为 H16 ( ) ( - 35 5 ’ - CC GAAA TC GGT T GAACC GAAA - 3 ’ , nt 35 , 56 和 H16 - 890 5 ’ - CCA T T GGTACC T2 ) (GCA GGA TCA GCCA T G - 3’ ,nt1890 - 864; E1/ E2 区为 H16 - 849 5’ - GAAACC TAA TC TACCA T GGC T G - 3’ , μ) () nt1849 - 871和 H16 - 3889 5’ - CAC GCCA GTAA T GT T GT GGA T GC - 3’ ,nt 3 889,3 867。1g 细胞 DNA 与 ( ) μ 1U Taq 多聚酶 Pharmacia 公司产品、2mmol/ L 4 ×dN TP 混匀 ,50,100l 总体积行 PCR 反应 。反应条件为 :94 ?1 分钟 ,57 ?40 秒 ,72 ?1 分钟 ,共 30 个循环 。 () ( 6 细胞 RNA 提取 收集培养的永生化角源细胞 100mm 培养皿,加 2ml 裂解液 4mol/ L guanidinium isot h2 μ) iocyanate ,015 %sarcosyl ,25mmol/ L 柠檬酸钠 p H710。等量酚抽提后异丙醇沉淀 。300l 裂解液重新溶解离 心沉淀物 ,等量异丙醇沉淀 。细胞 RNA 溶解后经 DNA 酶 37 ?水解 1 小时 ,酒精沉淀后 - 80 ?保存 。 μμ7 RNA 探针制备 制备 RNA 探针采用体外转录法 。1g p H16 E6 - Ribo 和 1g p H16 E7 - Ribo DNA 经 Hind 32 μαμμ?完全水解后 ,分别与 50Ci - P - U TP ,400mol/ L A TP 、C TP 、GTP ,1U RNasin ,10mol D T T 在 10U T7 ( ) RNA 多聚酶 Pro mega 公司产品的作用下体外转录 1 小时 。加 5U DNA 酶 37 ?作用 1 小时 ,除去 DNA 模 板 。反应物经 5U 蛋白酶 K 37 ?作用 15 分钟 ,酒精沉淀纯化 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,放射自显影鉴定 。 μ8 Nort hern 转印杂交 50g 细胞 RNA 经含有甲醛的 1 %琼脂糖凝胶电泳后按常规法进行核酸转印 ,杂交探 6 针为体外转录的 E6/ E7 反向特异性 RNA ,取 5 ×10cp m 标记探针在 7 %SDS ,1mol/ L NaCl 条件下 68 ?杂交 48 小时 。洗膜以及放射自显影按常规法进行 。 ( 9 引物延长试验 所用引物为 HPV 16 E6 区反向序列 H16 - 287 5’ - CA GCA TA T GGA T TCCCA TC TC - 3’ , 32 ) ) ( μμ Pnt 278,267。30g 细胞 RNA 与 100ng 引物混匀变性 、退火后 ,在 5U M - ML V Gibco 公司产品,10Ci () - dC TP Amersham 公司产品,1mmol/ L dA TP、d GTP 、d T TP ,1U RNAsin ,1mmol/ L D T T 的条件下进行 cDNATM ( ) 序列延长 。反应完毕后加 5U RNase ON EPro mega 公司产品37 ?消化 30 分钟 ,除去 RNA 。酚化 ,酒 精沉淀 ,溶解后进行 6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,胶干后做放射自显影 。 结果 1 HPV 16 全基因组 DNA 可诱导原代角源细胞生命周期延长 为了观测 HPV 16 野毒株和突变株对 H Kf F 细胞的永生化能力 ,将组建的 HPV 16 YY1 结合位点突变株 、HPV 16 野毒株 、HPV 16 E6/ E7 基因表达质粒以及其他对照质粒 ,分别转染 H Kf F 细胞 。连续培养 6,8 周 ,传代 2 次左右 ,未转染的细胞以及接受阴性对照质粒转染的 ( ) 培养细 胞 p ML - 2D 和 p SV2 - neo 体 积 变 大 , 肿 胀 , 最 终 脱 落 。而 接 受 HPV 16 DNA 和 E6 E7 表达质粒转染的培养皿中 ,在大量的死亡细胞间存在有活细胞 。经继续传代 ,可在无血 清的 KGM 中继续分裂繁殖 。但在两次转染中 , HPV 16 野毒株质粒 p 1203 只在一次试验中诱 导出现生命延长细胞株 ,而 HPV 16 突变株和 E6 E7 基因表达质粒在两次转染试验里均诱导 () 出现生命延长细胞株 表 1。光镜下观测各组转染细胞株 ,形态无显著差异 ,但与正常 H Kf F () 细胞相比 ,细胞体积略小 结果未显示。 2 YY1 位点突变的 HPV 16DNA 可诱导 H Kf F 细胞永生化 为了进一步观测由于转染 HPV 16DNA 形成的生命延长细胞是否具有永生化细胞的特 + + 点 ,我们将无血清的 KGM 培养液改换为含有 10 %小牛血清 、2 mmol/ L Ca 的混合培养液 , 以促进原代细胞进一步分化 。在换培养液 2,3 周后 , HPV 16 野毒株质粒 p 1203 诱导的生命 + + 延长细胞株停止分裂 ,细胞肿胀 、死亡 。其他细胞株可耐受高浓度的血清和 Ca 的筛选 ,并 分裂繁殖 。我们将更换混合培养液后连续传代 20 次的细胞株认定为永生化细胞株 ,表 2 显示 两株突变 HPV 16 和 E6 E7 表达质粒转染的细胞株均为永生化细胞株 。截至本文发稿为止 , 所有细胞株都已传至 50 代左右 ,细胞形态无显著性差异 。 表 1 HPV 16 DNA 可诱导原代角源细胞形成生命表 2 转染 YY1 结合位点突变株可诱导形成永生化 延长细胞 细胞 Table 2 Transfectio n of t he YY1 binding site mutat2 Table 1 HPV 16 DNAs induced life - expanded spans ed HPV 16 DNAs o n t he p rimary ker2 in t he p rimary keratinocytes f ro m foreskin ati nocyt es yielded t he i mmo rt alized cells 生命延长细胞a 质粒 DNA 质粒 DNA永生化细胞 Immo rtalized clo ne a Life - expanded span Plasmid DNA Plasmid DNA 实验 1 Exp 11 实验 2 Exp 12 实验 1 Expt11 实验 2 Expt 12 p1203 - - p ML - 2D - - pDV390 + + p SV2 - neo - - pDV1326 + + p1203 + - pL XSN H16 E6 E7 + + pDV390 + + a2 + 永生化细胞 : 经含 10 % FCS 、2 mmol/ L Ca的混合培pDV1326 + + 养基筛选 ,连续传代 20 次以上 。 pL XSN H16 E6 E7 + + a Immo rtalized clo ne : selected wit h mixed medium co n2 a 生命延长细胞 :连续培养 8 周 ,传代 5 次以上 。2 + taining 10 % FCS , 2 mmol/ L Caand co ntinuo usly passaged a Life - expanded span : co ntinuo usly cult ured mo re t han mo re t han 20 times. 8 weeks , passaged mo re t han 5 times. 3 永生化细胞株中存在有完整的 HPV 16 L CR 和 E6 E7 区序列 为了观测永生化细胞株中 HPV 16 DNA 的存在方式 ,提取细胞 DNA 进行 So ut her n 转印 杂交 ,同时采用 PCR 技术测定病毒主要早期区域的完整性 。采用 HPV 16 单切点酶 Bam H I 、 无切点酶 Hind ?和未加内切酶分别处理细胞 DNA 进行 So ut her n 转印杂交 。结果显示 ,4 株HPV 16 突变株诱导的永生化细胞系中均含有 HPV 16DNA ,并且病毒 DNA 呈整合状态存在 () 图 1 ,表 3。PCR 扩增结果表明 ,在 4 株永生化细胞系中可检出病毒 L CR 区 、E6 E7 区序列 , () 而 E1/ E2 区在 3 株细胞系中未能检出 表 3。同时 ,对扩增出的 L CR 片段进行电泳及序列分 () 析证明 ,仍分别带有与转染 DNA 相同的特异性核苷酸改变 结果未显示。 图 1 Sout hern 转印杂交检测永生化细胞系内 HPV 16 DNA λN : 未酶切 ; H : Hind ?,在 HPV 16 DNA 上无切点 ;B :Bam HI , HPV 16 DNA 单切点酶 ,M :- DNA Hind ?片段为分 子量标记 。P : HPV 16 全基因组 DNA 作为阳性对照 。 Figure 1 Identificatio n of HPV 16 DNAs in t he immortalized clo nes wit h Sout hern blot hybridizatio n. N : No n - digesting ; H : Hind ?, wit ho ut cut ting site o n HPV 16 DNA ; B :Bam HI , single cleavage site o n HPV 16 λDNA ; M :- DNA Hind ?f ragment , used as molecular weight mar ker . P : HPV 16 whole geno me as t he po sitive co n2 t rol . 表 3 永生化细胞株中 HPV 16 基因组存在方式和早期区域分布 Table 3 The p hysical stat us and dist ributio n of viral early regio ns of HPV 16 in t he immortalized clo nes b HPV 16 早期区域a 永生化细胞株病毒 DNA 状态 The early regio ns of HPV 16 Immo rtalized clo ne Physical stat us of viral DNA L CR E6/ E7 E1/ E2 pDV390 - A Integrate + + + + + - pDV390 - B Integrate pDV1326 - A Integrate + + - + + - pDV1326 - B Integrate a : So ut hern 转印杂交结果 。The result s of So ut hern blot hybridizatio ns1b : PCR 检测结果 。The result s of t he PCR amplificatio ns1 4 病毒癌基因在永生化细胞中持续性转录 为了了解 HPV 16 癌基因在永生化细胞株中的功能状态 ,用 No rt her n 转印杂交和引物延 长试验检测了 E6/ E7 mRNA 转录情况 。No rt her n 转印杂交结果显示 ,利用 HPV 16 E6 及 E7 特异性反义 RNA 探针与 4 株 HPV 16 突变株诱导的永生化细胞 mRNA 杂交都出现阳性杂交 () 条带 ,其反应强度在各细胞系间有所差异 图 2。引物延长试验也显示 ,利用 HPV 16 E6 特异 性反向引物同 HPV 16 毒株诱导形成的永生化细胞 mRNA 作用后 ,在逆转录酶控制下可形成 ( ) 特异性的 cDNA 延长物 ,其电泳位置与预期泳动位置相符 图 3。这些结果表明 ,在 HPV 16 毒株诱导的包皮角源永生化细胞中病毒癌基因呈持续性转录 。 图 2 Nort hern 转 印 杂 交 检 测 永 生 化 细 胞 株 中 HPV 16 E6 E7 mRNA 转录 1 . HPV 16 原毒株全基因组诱导的包皮角源细胞系作 为阳性对照 ;2 . 子宫颈癌细胞系 C33a 作为阴性对照 : 3 ,4 . pDV390 诱导的两个细胞系 ; 5 , 6 . pDV1326 诱导 的两个细胞系 。 Figure 2 Identificatio n of t he t ranscrip t s of HPV 16 E6/ E7 in t he immortalized cells by Nort hern blot hybridizatio n 1 . The immo rtalized keratinocytes induced by t he p roto2 t ype HPV 16 DNA was used as t he po sitive co nt rol ; 2 . Cervical carcino ma cell line C33a used as a negative co n2 t rol ; 3and 4 . Two separated clo nes induced by pDV390 ; 5 and 6 . The clo nes induced by pDV1326 . 讨论 HPV 16 属高危 HPV ,与子宫颈癌的发病密切相关 。HPV 16 基因组可使人 、鼠多种角源细胞发生永生化 ,因此这一实验常被用于检测 HPV 的转化能力 。以往实验中所用的毒株为 〔1〕HPV 16 原毒株,与 HPV 16 野毒株相比 , HPV 16 原毒株在 E1 区 nt 1138 位有一“G”的缺失 〔9〕突变 。这一突变明显增强了 HPV 16 原毒株对人原代角源细胞的永生化能力。实验结果表 明 , HPV 16 野毒株质粒 p 1203 对人原代包皮角源细胞的转化能力很弱 ,与突变株相比几乎不 能形成永生化细胞株 。对 8 例子宫颈癌标本中 HPV16 E1 区序列分析结果显示 ,仅一例带有 () 与 HPV 16 原毒株相同的“G”缺失突变 董小平等 ,未发表资料。这说明自然存在的 HPV 16 多以 HPV 16 野毒株为主 。这也可能是 HPV 16 的感染率高而癌变率低 、潜伏期长的原因之 一 。 〔12〕YY1 蛋白调节系统广泛存在于子宫颈癌细胞系以及 HPV 易感细胞中。L CR 序列上 YY1 位点的破坏可使癌基因启动子 P97 活性增加 ,更为有意义的是这些突变可在全基因组内 〔7〕〔8〕使 E6 mRNA 转录增强,并且促进病毒基因组对小鼠纤维细胞的转化能力。作为 HPV 易 感细胞的原代包皮角源细胞 ,对于检测 HPV ,特别是高危粘膜感染的 HPV 的转化作用具有十 分重要的意义 。与野毒株相比 , HPV 16 YY1 位点缺损突变株对人原代角源细胞永生化能力明显增强 。这表明 YY1 蛋白抑制系统的破坏可增强病毒永生化能力 ,特别是 HPV 16 的转化 作用 。感染带有 YY1 位点破坏的 HPV 16 将具有更高的致癌可能性 。虽然病毒核苷酸序列 改变的时相尚不清楚 ,但我们以前对两例子宫颈癌原发灶标本和相应淋巴结转移癌标本中 〔4〕HPV 16L CR 序列分析证明 ,该段序列从原发灶到转移癌的病程中无改变。L CR 区 YY1 结 合位点的突变和缺损是自然存在的 ,还是在感染细胞后发生的 ,尚无定论 。进一步进行这方面 图 3 引物延长试验检测永生化细胞系中 HPV 16 E6 mRNA 转录 1 ,5 :pDV390 诱导的两个细胞系 ;2 ,6 :pDV1326 诱导的两个细胞系 ;3 ,7 :两株 HPV 16 原毒株全基因组诱导的包皮 角源细胞系 ,作为阳性对照 ;4 ,8 :p SNL XH16 E6 E7 诱导的两个细胞系 ;9 :子宫颈癌细胞系 C33a ,作为阴性对照 。 ? 指示特异性延长产物 。右侧 DNA 序列电泳作为分子量标记 。 Figure 3 Identificatio n of t he specific t ranscrip tio ns of HPV 16 E6 gene in t he immortalized cells by p rimer extensio n test 1 and 5 : Two separated clo nes induced by t ransfecting wit h pDV390 ; 2 and 6 : The clo nes induced by pDV1326 ; 3 and 7 : Two immo rtalized keratinocytes induced by t he p rotot ype HPV 16 DNA , used as t he po sitive co nt rols ; 4 and 8 : The clo nes induced by p SNL XH16 E6 E7 ; 9 : Cervical carcino ma cell line C33a used as a negative co nt rol . ?indicates t he spe2 cific extensio n p ro duct s. The DNA sequence pat tern in t he right part is used as t he molecular indicato r . 的研究将有助于探讨 HPV 致癌机理 。 在 4 株突变 HPV 16 全基因组诱导的永生化细胞中 ,3 株带有 E1 和 E2 区的缺失 。这与HPV 16 阳性子宫颈癌细胞内病毒基因组多呈整合状态 ,并且 E1 和/ 或 E2 区多缺失的现象相 吻合 。病毒基因组在整合过程中 E1/ E2 区的缺损被认为是诱导病毒癌基因过量表达并引起 〔13〕宿主细胞癌变的重要途径。而病毒的 L CR 区和癌基因 E6/ E7 区在 4 株永生化细胞中均完 好存在 ,这也同在子宫颈癌组织和子宫颈癌细胞系中 HPV 16 基因存在情况一致 。这再次从 细胞水平证实了 HPV 基因组在整合至宿主细胞 DNA 过程中病毒基因组重新组合 、分布及存 在的特点 。 HPV 癌基因的有效表达 ,对于维持 HPV 转化细胞及 HPV 阳性子宫颈癌细胞系的转化细 〔14〕 胞表现型十分重要 ,加入癌基因反义 RNA 序列可使转化细胞或癌细胞的生长特性消失。 我们建立的永生化细胞株中均具有不同量的 HPV 16 E6/ E7 基因转录 ,但从永生化细胞的病 毒癌基因表达量分析 ,似乎与原始转染的 HPV 16 毒株无关 , E1/ E2 区的缺失也对癌基因转录无明显的影响 。其他资料也显示 , HPV 癌基因在细胞中的拷贝数以及转录情况与已形成的肿 〔15〕瘤的恶性度 、预后和肿瘤细胞系的生长特性并无显著关系。因而 ,我们推测 YY1 结合位点 的缺失 ,以及病毒基因组在整合过程中 E1/ E2 区的缺失 ,可诱导病毒癌基因的过量表达 ,这种 过量表达使宿主细胞有可能失去正常细胞的生长特性 ,从而转变为永生化或转化细胞 。形成 转化细胞后 YY1 位点缺失或 E1/ E2 缺失所带来的生物学效应对细胞的生长特性可能就影响 不大 ,因而需要有其它致癌因素协同或进一步作用才能发展为癌细胞 。 参 考 文 献 1 Hawley - Nelso n P , Vo usden K H , Hubbert J M , et al . HPV 16 E6 and E7 cooperate to immo rtalize human fo reskin ker2 atinocytes. EMBO J , 1989 , 8 : 3905 - 3910 2 Sang B C , Barbo sa M S. Increased E6/ E7 t ranscriptio n in HPV 18 - immo rtalized human keratinocytes result s f ro m inacti2 vatio n of E2 and additio nal cellular event s. Virology , 1992 , 189 :448 - 455 3 Fuchs P G , Pfister H. Transcriptio n of papillo mavirus geno mes. Intervirology , 1994 , 37 : 159 - 167 4 Do ng X - P , St ubenrauch F , Beyer - Finkler E , et al . Prevalence of deletio ns of YY1 - binding sites in episo mal HPV 16 DNA f ro m cervical cancers. Int J Cancer , 1994 ,58 :803 - 808 5 May M , Do ng X - P , Beyer - Finkler E , et al . The E6 - E7 p ro moter of ext rachro mo so mal HPV 16 DNA in cervical can2 cers escapes f ro m cellular rep ressio n by mutatio n of target sequences fo r YY1 . EMBO J , 1994 , 13 : 1460 - 1466 6 O’Co nno r M J , Tan S - H , Tan C - H , et al . YY1 rep resses human papillo mavirus t ype 16 t ranscriptio n by quenchingA P - 1 activit y. J Virol , 1996 , 70 :6529 - 6539 7 董小平 ,刘红 , Herbert Pfister1 YY1 抑制效应的破坏可促进 HPV 16 癌基因的转录 1 病毒学报 ,1999 ,15 :125 - 129 8 董小平 ,刘红 , Herbert Pfister1 人乳头瘤病毒 16 型长控制区域上 YY1 位点的缺失可增强病毒对小鼠纤维细胞的转 化能力 1 中华实验及临床病毒学杂志 ,1999 ,13 :5 - 8 9 Ro manczuk H , Howley P M . Disruptio n of eit her t he E1 o r E2 regulato ry gene of human papillo mavirus t ype 16 increases viral immo rtalizatio n capacit y. Proc Natl Acad Sci U SA , 1992 , 89 :3159 - 3163 10 Halbert C L , Demers G W , Galloway D A. The E7 gene of human papillo mavirus t ype 16 is sufficient fo r immo rtaliza2 tio n of human epit helial cells. J Virol , 1991 , 65 :473 - 478 11 刘红 ,董小平 ,刘延娜 ,等 1 构建来自宫颈癌并带有突变及缺失 L CR 的 HPV 16 重组体 1 中国病毒学 ,1996 ,10 :237- 243 12 董小平 ,刘红 , Herbert Pfister1 细胞转录调节因子 YY1 及其对人乳头瘤病毒 16 型早期启动子 P97 抑制效应广泛存 在于人上皮细胞 1 中华实验及临床病毒学杂志 ,1998 ,12 :217 - 222 13 Zur Hausen H. Human papillo maviruses in t he pat hogenesis of anogenital cancer . Virology , 1991 , 184 :9 - 13 14 Vo n Knebel Doeberitz M , Rit t muller C , zur Hausen H , et al . Inhibitio n of t umo rigenicit y of cervical - cancer cells in nude mice by HPV E6 - E7 anti - sense RNA. Int J Cancer , 1992 , 51 :831 - 824 15 Pfister H. Genital papillo mavirus infectio n . Sp rigen - Verlag , 1990 ,pp 127