萆薢总皂苷对大鼠慢性高尿酸血症和肾小管尿酸转运体1表达的影响.doc

萆薢总皂苷对大鼠慢性高尿酸血症和肾小管尿酸转运体1达的影响.doc 萆薢总皂苷对大鼠慢性高尿酸血症和肾小管尿酸转运 体1表达的影响 [摘要] 目的:研究萆薢总皂苷对大鼠慢性高尿酸血症的防治作用及对肾脏尿酸转运体1(urate transporter 1，URAT1)表达的影响。 方法:90只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、萆薢总皂苷(total saponin of Dioscorea，TSD)高、中、低剂量组(300，100，30 mg?kg-1)、苯溴马隆(10 mg?kg-1)组。以氧嗪酸钾联合乙胺丁醇复制大鼠慢性高尿酸血症模型，第3周开始灌胃给药，每天1次，连续4周，测定血尿酸、尿尿酸、尿酸排泄量、黄嘌呤氧化酶(XOD)活性;RT-PCR法、免疫组化法分别测定大鼠肾小管细胞URAT1 mRNA和URAT1蛋白的表达。 结果:模型组大鼠血尿酸水平显著升高，尿尿酸排泄减少，肾脏URAT1 mRNA和URAT1蛋白高表达。TSD能剂量依赖性地降低高尿酸血症大鼠的血清尿酸水平，增加尿尿酸浓度和尿酸排泄量，降低肾脏URAT1 mRNA和URAT1蛋白的高表达，其作用与苯溴马隆相近;对高尿酸血症大鼠XOD、尿量无明显影响。 结论:TSD有明显的抗高尿酸血症作用，可能是通过抑制大鼠肾脏URAT1的高表达而减少尿酸的重吸收。 [关键词]萆薢总皂苷;高尿酸血症;尿酸转运体1;黄嘌呤氧化酶高尿酸血症(hyperuricemia，HUA)是一组嘌呤代谢紊乱和/或尿酸排泄障碍所致血尿酸(uric acid，UA)增高的异质性疾病。HUA除与痛风发作密 切相关外，流行病学及临床试验发现HUA与多种心血管事件危险因素，如高血压、糖尿病、血脂异常、肥胖等有密切的关系[1-3]。研究表明，UA的排泄受多种基因和蛋白调控，其中，尿酸转运体1(urate transporter 1，URAT1)主要介导尿酸的重吸收，通过与多种单价的有机阴离子和少数无机阴离子交换实现对尿酸的重吸收，其过程不受膜电压和细胞内外pH的影响，是一个电中性的尿酸盐交换子[4-5]。 萆薢是临床上治疗痛风和高尿酸血症的常用中药之一，具有利湿浊、祛风湿的功效，含粉背皂苷A、原粉背皂苷A、纤细薯蓣皂苷、原纤细薯蓣皂苷[6]。目前发现，萆薢及其有效部位具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤及对心血管系统的作用[7]。笔者的前期研究表明:萆薢总皂苷(total saponin of Dioscorea，TSD)有明显的抗高尿酸血症作用，其作用机制包括促进尿酸排泄，抑制黄嘌吟氧化酶活性[8]。URAT1在肾脏尿酸盐重吸收的过程中起重要作用，研究发现URAT1为促尿酸排泄药物作用的靶点，TSD很可能通过调节肾脏尿酸转运蛋白，进而促进尿酸排泄，降低血清尿酸水平。本课题采用氧嗪酸钾联合乙胺丁醇复制大鼠慢性高尿酸血症(尿酸排泄减少型)模型，阐明TSD对大鼠高尿酸血症的防治作用及URAT1的影响。 1 材料 1.1 药品与试剂 TSD由本课题组提供，提取物中总皂苷质量分数为61.2%，文中剂量为提取物量。薯蓣皂苷元对照品(中国食品药品检定研究院，批号111539-200001)。苯溴马隆片(德国赫曼大药厂，批号101111);氧嗪酸钾(Alderich);乙胺丁醇(上海信谊天平药业有限公司，批号 110815);尿酸测定试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司，批号20111028);黄嘌呤氧化酶试剂盒(南京建成生物研究所，批号20110504);尿酸盐重吸收转运子1抗体(Anti-OAT4L/URAT1，北京博奥森生物技术有限公司);SP-9000免疫组化染色试剂盒及DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);Trizol试剂(Invitrogen公司);逆转录试剂盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)(Fermentas公司)，PCR 扩增套装[宝生物工程(大连)有限公司]，DL2000 DNA Marker (上海生工生物工程公司);引物采用Prime Primer 5.0软件设计，由上海生工生物工程公司合成。 1.2 动物 雄性SD大鼠，体重(200 ? 20) g，SPF级，由安徽省医学实验动物中心提供。合格证号SCXK(皖)2011-002。分笼饲养，自由饮水、饮食。 1.3 仪器 7112型优利特生化仪(广西桂林优利特有限公司);PCR仪(Bio-Rad Laboratories，2000Alfred Nobel Drive，Hercules，CA);BioSens SC810凝胶成像系统(上海山富科学仪器有限公司);Eppendorf 5430R台式高速冷冻离心机(Eppendorf公司);Image-proplus图像处理系统;Leica rm2135 切片机;Bm-ii型病理组织包埋机。 2 方法 2.1 模型复制、分组与给药 以氧嗪酸钾(200 mg?kg-1， sc)+乙胺丁醇(250 mg?kg-1， ig)，每天1次，连续6周，复制慢性高尿酸血症模型[9-10]。氧嗪酸钾溶于羊毛脂石蜡混合溶剂(质量比为3?2，在70 ?下混合而成)，容积为0.5 mL?kg-1，乙胺丁醇溶于0.5%羧甲基纤 维素钠溶液中，灌胃容量为1 mL?kg-1。90只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、TSD高、中、低剂量组(300，100，30 mg?kg-1)、苯溴马隆(10 mg?kg-1)组，每组15只。第2周末在乙醚麻醉下，大鼠眼内眦取血测定血尿酸水平，第3周开始灌胃给药，每天1次，连续4周，药品用前以0.5%羧甲基纤维素钠(0.5%CMC-Na)配制混悬液，正常组和模型组给等量溶媒。 2.2 血清尿酸、尿尿酸、尿酸排泄量、黄嘌呤氧化酶测定 给药第15，28天取血测定血尿酸(SUA)和黄嘌呤氧化酶(XOD)浓度，末次给药后，取大鼠肝脏1 g加生理盐水制成10%组织匀浆，离心取上清液测定XOD浓度。给药第13,15，26,28天，用代谢笼收集大鼠24 h尿液，测定尿尿酸浓度(UUA)，计算24 h尿酸排泄量(24 h UUA)。 2.3 免疫组织化学染色 取肾组织置于10%中性福尔马林溶液中固定，乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片，连续切片厚5 μm;采用SP法进行免疫组化染色，一抗浓度1?200，阴性对照采用PBS替代一抗。DAB显色，苏木素轻度复染。每组随机取8只大鼠肾脏，每只肾脏做3张切片，每张切片取3个高倍(×400 倍)视野。采用Image-proplus 6.0 图像分析系统进行半定量分析，结果以平均吸光度IA表示。 2.4 RT-PCR检测肾小管细胞URAT1 mRNA 分别取各组大鼠皮质肾组织0.1 g，按照 Trizol试剂说明提取总RNA，鉴定RNA的纯度及完整性。按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA后扩增URAT1基因片段，引物上游: 5′-CTCAGCCGCAGTTCCCCACCAC-3′，下游: 5′-CCCTTCTGCGCCCAAACCTATCTG-3′，扩增片段长度404 bp;以GAPDH作内参，上游:5′-TGGGGCCAAAAGGGTATCATCTC-3′，下游: 5′ -GCCGCCTGCTTCACCACCTTCTT-3′，扩增片段长度455 bp;扩增条件均为94 ?预变性2 min，94 ?变性30 s，58 ?退火35 s，72 ?延伸45 s(×35);72 ?延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在凝胶影像分析仪上进行成像，计算URAT1 mRNA和GAPDH mRNA平均吸光度(IA)的比值。 2.5 统计学处理 所测数据用?s表示，数据的统计学处理采用SPSS 17.0统计软件包，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，选择LSD和S-A-K显著性检验法，P<0.05表示有统计学意义。 3 结果 3.1 TSD对高尿酸血症大鼠SUA水平和XOD活性的影响 与正常组比较，模型组、各给药组给药前SUA水平均显著升高(P，0.01)，模型组与各给药组间SUA水平无显著性差异。模型组大鼠给药第14，28天SUA均维持在较高水平(P，0.01)，表明氧嗪酸钾联合乙胺丁醇可以成功复制慢性高尿酸血症模型。与模型组比较，苯溴马隆组、TSD高、中、低剂量组大鼠血尿酸水平均明显降低，高、中剂量组差异具有显著性(P<0.01，P<0.05)，TSD高、中、低剂量间作用呈现一定的量效关系，表明TSD对慢性高尿酸血症大鼠具有降尿酸作用，见表1。 与正常组比较，第14天模型组大鼠血清XOD轻度升高，第28天大鼠血清XOD和肝脏XOD未见明显升高，表明用氧嗪酸钾联合乙胺丁醇复制的慢性高尿酸血症，大鼠体内尿酸产生未见明显增加。与模型组比较，第14天TSD中剂量组血清XOD明显降低，TSD高、低剂量组血清XOD无明显差异。第28天各组间大鼠血清XOD和肝脏XOD活性无明显差异，见表2。 3.2 TSD对高尿酸血症大鼠尿量、UUA浓度、24 h UUA的影响 各组大鼠尿量无明显差异。与正常组比较，模型组大鼠第14，28天 UUA，24 h UUA显著降低(P，0.01)，表明氧嗪酸钾联合乙胺丁醇可以显著减少大鼠尿酸排泄。与模型组比较，苯溴马隆组和TSD各剂量组大鼠第14，28天 UUA浓度、24 h UUA均有一定的增加，其中TSD高、中剂量组作用显著，差异具有显著性，且不同剂量组间呈现一定的量-效相关性，表明TSD有促进尿酸排泄的作用，见表3。 3.3 TSD对高尿酸血症大鼠肾组织中URAT1蛋白表达的影响 正常组大鼠肾组织细胞内URAT1蛋白呈弱阳性表达，可见少量棕黄色的染色物质;模型组大鼠肾组织细胞胞浆或胞膜布满棕黄色物质。与正常组比较，模型组IA显著增高(P<0.01);与模型组比较，TSD高、中剂量组、苯溴马隆组大鼠IA均显著降低(P<0.01)，见图1，2。 3.4 TSD对高尿酸血症大鼠肾脏组织URAT1 mRNA表达的影响 正常组大鼠肾组织URAT1 mRNA表达呈弱阳性，模型组大鼠肾组织URAT1 mRNA的表达显著增高(P<0.01)。与正常组比较，模型组IA比值显著增加(P<0.01);与模型组比较，苯溴马隆组、TSD高、中剂量组IA比值显著降低(P<0.01)，低剂量组IA比值有降低的趋势，但差异无显著性，见图3。 4 讨论 4.1 氧嗪酸钾联合乙胺丁醇可以成功复制大鼠慢性高尿酸血症模型 黄嘌呤氧化酶(XOD)是生成尿酸的关键酶，嘌呤代谢关键酶缺陷导致嘌呤利用障碍或嘌呤氧化酶活性增强是尿酸生成增加的主要原因。人体内的尿酸约2/3经肾脏排泄，近端肾小管对尿酸重吸收增加或分泌减少是尿酸 排泄减少的主要原因。目前已证实，90%以上原发性高尿酸血症是因肾近端小管对尿酸的重吸收增加和/或分泌减少所致[11]。 大多数动物体内存在尿酸酶，可以将体内尿酸进一步分解为尿囊素。尿囊素为无毒物质，水溶性良好，极易随尿排出体外，很少在体内蓄积。灵长类在进化过程中，编码尿酸酶的基因发生突变，缺乏尿酸酶，尿酸是机体嘌呤核苷酸代谢的最终产物。故人类血尿酸水平远远高于其他携带尿酸酶的物种。因此在大鼠、小鼠体内建立慢性高尿酸血症模型有一定的难度。本课题组前期研究发现，建立起高尿酸模型后，随着时间的推移，大鼠血尿酸水平有降低的趋势[12]。 前期研究表明TSD对酵母引起的大鼠高尿酸血症(尿酸产生增多型)有显著的降尿酸作用。本文进一步研究TSD对尿酸排泄减少型高尿酸血症是否也有作用，同时观察其降尿酸作用是否与尿酸转运蛋白有关。 腺嘌呤是一种含氮杂环嘌呤类化合物，给大量腺嘌呤后，磷酸核糖焦磷酸和谷酰胺增加，体内谷酰胺磷酸核糖焦磷酸转移酶、黄嘌呤氧化酶活性增加，尿酸合成加速，增加血中尿酸含量。根据目前较多文献介绍的方法[13-15]，课题组先采用腺嘌呤200 mg?kg-1+乙胺丁醇250 mg?kg-1复制大鼠慢性高尿酸血症模型，结果发现大鼠血尿酸升高明显，但同时肾脏损害较为明显。结合本实验目的，本模型存在两个不足:一是出现明显的肾功能损害，进而可能影响到肾小管尿酸转运蛋白的尿酸转运功能，二是既有尿酸产生增多，又有尿酸排泄减少，不利于观察药物促进尿酸排泄作用。 氧嗪酸钾盐为尿酸酶抑制剂，可抑制尿酸分解，增加体内尿酸水平， 乙胺丁醇可竞争性抑制尿酸从肾脏的分泌，合并给药后，双重抑制尿酸从肾脏的排泄，导致体内血尿酸水平升高，类似于人类尿酸排泄减少型高尿酸血症。与正常组比较，给药前模型组大鼠血尿酸水平显著升高，并维持在稳定的状态，第14，28天血尿酸水平仍然明显升高，而大鼠血清和肝脏XOD未见明显升高，模型组大鼠UUA，24 h UUA均显著降低，且第28天与第14天的结果相似，表明用本法复制的高尿酸血症主要是由于尿酸排泄减少，而不是尿酸产生增多。 本实验同时测定了大鼠肾脏功能指标，与正常组比较，模型组大鼠血肌酐轻度增加，血尿素氮无明显差异，尿肌酐虽有减少趋势，但差异无显著性，肌酐清除率和尿酸清除率均显著降低。肌酐清除率和尿酸清除率降低可能是轻度肾功能损害，也可能是造模剂抑制尿酸和肌酐排泄的结果，后者可能性更大。肾脏病理学检查，未见明显损害。 4.2 URAT1促进尿酸重吸收，为促尿酸排泄药物作用靶点 尿酸经肾脏转运时需要依赖肾小管上皮细胞刷状缘侧(管腔膜)和基底外侧膜上的转运蛋白，这些转运蛋白的过量表达或表达不足，均能影响尿酸排泄，导致高尿酸血症。URAT1主要位于肾皮质近曲小管的上皮细胞刷状缘膜，是肾小管腔尿酸重吸收至肾小管上皮细胞内的主要转运蛋白，在肾脏尿酸盐重吸收的过程中起重要作用[4]。由555个氨基酸残基，12个跨膜区域以及位于细胞内部的-NH2和-COOH末端组成，是一个完整的跨膜蛋白。研究发现URAT1为促尿酸排泄药物的靶点，与URAT1有亲和力的药物或试剂，作用于管腔膜可以促尿酸排泄[16]。苯溴马隆、丙磺舒均为URAT1抑制剂。氯沙坦和非诺贝特也是通过抑制URAT1基因表达而减少尿酸重吸收，降低 血清尿酸水平[17-18]。RDEA-594是最新开发的URAT1抑制剂，?期临床研究显示，本品治疗8 d，85.7%患者血尿酸水平降低到357 μmol?L-1以下[19]。 与正常组比较，模型组大鼠肾脏URAT1 mRNA 和URAT1蛋白表达显著升高，表明用本法复制的高尿酸血症可能主要是由于URAT1表达增加，对尿酸重吸收的功能增强而产生的。 4.3 萆薢总皂苷可能通过抑制高尿酸血症大鼠肾脏URAT1表达而减少尿酸重吸收 研究表明传统中药及其有效成分确有显著的降尿酸作用，调节肾脏尿酸转运蛋白可能是其作用机制之一[20-21]。本实验通过氧嗪酸钾配伍乙胺丁醇复制大鼠慢性高尿酸血症模型，与模型组比较，苯溴马隆组、TSD各剂量组大鼠血尿酸均明显降低，血清和肝脏XOD无明显差异， 24 h UUA均明显增加，且TSD呈现一定的量效关系，表明苯而大鼠UUA， 溴马隆和TSD均能降低高尿酸血症大鼠血清尿酸水平，TSD可能通过促进尿酸排泄发挥降尿酸作用。慢性高尿酸血症大鼠血清尿酸水平的升高与肾脏URAT1高表达致尿酸重吸收功能增强有关。苯溴马隆、TSD高、中剂量组可显著降低高尿酸血症大鼠肾脏URAT1 mRNA 和URAT1蛋白的高表达，表明TSD可通过抑制慢性高尿酸血症大鼠肾脏URAT1的表达而减少尿酸重吸收，促进尿酸排泄，URAT1可能为TSD干预高尿酸血症大鼠以维持体内尿酸盐平衡的作用靶点。 [参考文献] [1] 樊晓寒， 惠汝太. 高尿酸血症与心血管病[J]. 临床心血管病杂志， 2007， 23(5): 323. 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Potassium oxonate and ethambutol were adopted to establish the chronic hyperuricemia model. Since the third week， all the rats were intragastrically administered with drugs for 4 weeks， once a day， in order to determine their uric acid in serum and urine， uric acid excretion and xanthine oxidase (XOD). URAT1 mRNA and URAT1 protein expression in rat renal tubular cells were determined by RT-PCR and immunohistochemistry method respectively. Result: Serum uric acid level of the model group increased significantly， while uric acid excretion decreased， with high expressions of renal URAT1 mRNA and URAT1 protein. TSD could dose-dependently reduce the serum uric acid level of chronic hyperuricemia rats， increase the concentration of uric acid and uric acid excretion in urine， and reduce renal URAT1 mRNA and URAT1 protein expression. Its effects were similar with that of benzbromarone， but with no significant effect on XOD and urinary volume of chronic hyperuricemia rats. Conclusion: TSD has an obvious effect of anti-hyperuricemia. It may reduce the reabsorption of uric acid by inhibiting the high expression of rat renal URAT1. [Key words] total saponin of Dioscorea; hyperuricemia; URAT1; xanthine oxidase doi:10.4268/cjcmm20131427