大血藤对破骨细胞活性及成骨细胞增殖分化作用的研究.doc

大血藤对破骨细胞活性及成骨细胞增殖分化作用的研究.doc 大血藤对破骨细胞活性及成骨细胞增殖分化作用的研 究 [摘要]该研究采用1α，25-(OH)2VitD3诱导兔骨髓细胞法获得破骨细胞，以形态学观察、HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色来鉴定破骨细胞，用TRAP+细胞计数、TRAP活力测定和骨吸收陷窝的数量及面积来检测大血藤对破骨细胞分化及骨吸收功能的影响。培养MC3T3-E1Subclone14(小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14)细胞，用MTT法、碱性磷酸酶活力测定检测大血藤对其增殖和分化的影响。结果表明大血藤醇提物和水煎物低、中、高剂量组(2，20，200mg?L-1)对破骨细胞分化及骨吸收功能具有抑制作用，并具有剂量依赖性。大血藤醇提物和水煎物低、中剂量组具有促进MC3T3-E1Subclone14细胞增殖分化的作用，说明大血藤对骨质疏松有一定的防治作用，这种作用可能是通过抑制破骨细胞活性和促进成骨细胞增殖分化来实现的。 [关键词]大血藤;破骨细胞;成骨细胞;骨吸收;增殖分化 大血藤为木通科植物大血藤Sargentodoxacuneata(Oliv.)Rehd.etWils.的干燥藤茎，味苦，性平，归大肠、肝经，具有清热解毒，活血，祛风止痛的作用，用于跌扑肿痛，风湿痹痛等[1]。关于骨质疏松的中医病因病机，各医家都有自己的论述。目前较为一致的观点是:骨质疏松的发生与肾、脾、瘀等都有关系，其中肾亏为主，脾虚为辅，血瘀是促进因素[2-3]。因此，中药防治骨质疏松症多从补益肝肾、强筋壮骨、 1 益气养血、活血化瘀入手。大血藤为传统中药材，是一种强壮补血药[4]，可能具有抗骨质疏松方面的药理作用。本文旨在研究大血藤对破骨细胞活性和成骨细胞增殖及分化的作用，为抗骨质疏松药物的开发提供理论依据。 1材料 1.1动物及细胞48h内新西兰大白兔，购自贵州省畜牧研究所实验基地，清洁级，合格证号SCXK(黔)2012-001;MC3T3-E1Subclone14小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14，购自中国科学院细胞库。 1.2药物及样品的制备大血藤(四平市百草堂中药饮片有限公司，批号20130401，产地四川)。取大血藤100g，用75%乙醇1000mL回流提取3次，时间分别为3，2，1h，过滤，合并提取液，经减压浓缩、冷冻干燥后，得到醇提物浸膏备用。取大血藤100g，用水1000mL煎3次，时间分别为2.5，2，1.5h，过滤，合并提取液，经减压浓缩、冷冻干燥后，得到水煎物浸膏备用。 1.3试剂破骨细胞α-MEM培养基(Gibco公司，批号1532454);成骨细胞α-MEM培养基(Gibco公司，批号1510464);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批号140502);青，链霉素(Solarbio公司，批号20140718);ToluidineBlue(Sigma公司，批号BCBG4799V);抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒(Sigma公司，批号SLBJ7300V);抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)测试盒(南京建成生物工程研究所，批号20140805);L-抗坏血酸(Sigma公司，批号A7506);β-甘油磷酸钠(Sigma公司，批号G5422);地塞米松(Sigma公司，批号D1756);碱性磷酸酶(AKP)测 2 试盒(南京建成生物工程研究所，批号20140805);BCA法蛋白定量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20140803);MTT(GENVIEW公司，批号46170204106);Tritonx-100(MPBiomedicals，批号M2528)。 1.4仪器RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);LGJ-12型冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司);3111型CO2培养箱(Thermo);BX51TF型正置研究型荧光显微镜(Olympus);XD20-RFL型倒置荧光相差显微镜(宁波舜宇仪器有限公司);1510型酶标仪(Thermo);S-3400N型扫描电子显微镜(Hitachi)。 2方法 2.1兔骨髓细胞的分离和诱导培养参照吕享等[5]的方法，将出生48h内的乳兔断颈处死，75%乙醇浸泡消毒，在无菌操作台中剥离后肢股骨和胫骨，置于冷的PBS中，用无菌纱布剥除软组织后，将骨干置于含α-MEM全培养基(含10%胎牛血清，青霉素100U?mL-1，链霉素100g?L-1)无菌培养皿内，然后用灭菌的手术剪刀将骨干纵向剪开，轻刮出骨内的细胞直至骨内表面变白，剪碎骨干合并含细胞培养基于具塞玻璃管中经漩涡震荡1min左右，过200目细胞筛后配成所需细胞悬液，按照1,2×106个/孔的密度接种于24孔培养板(0.5mL/孔)内，置于5%CO2，37?饱和湿度条件下培养。24h左右用PBS洗掉未贴壁细胞，加入含1×10-8mol?L-1的1α，25-(OH)2VitD3的培养基进行诱导，并计为第1天，然后每3d更换一次含1×10-8mol?L-1的1α，25-(OH)2VitD3的全培养基。 2.2破骨细胞的鉴定形态学观察:在培养过程中于倒置显微镜下观察细胞生长状态。 3 HE染色:按照2.1项下方法培养细胞，于第7天进行HE染色。参照甄茹等[6]的染色方法染色后，经乙醇梯度脱水后于显微镜下观察。 TRAP染色:将1.0cm×1.0cm玻片经清洗、泡酸过夜后，双蒸水冲洗、纱布擦净，于高压灭菌后，于超净工作台内放入无菌的24孔培养板中，每孔1个，加入适量PBS浸没备用。按照2.1项下方法培养细胞，于第8天进行TRAP染色。方法按抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒进行，染色后经二甲苯透明、中性树胶封片，于显微镜下观察。 骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色:取骨磨片，将其修剪成0.6cm×0.6cm大小后，用PBS超声波清洗3次，75%乙醇浸泡2h以上，于超净工作台内紫外灯照射，每面各1h后，放入无菌24孔培养板中，每孔一个并加入适量PBS浸没，置CO2培养箱2h以上，备用。按2.1项下方法培养细胞，于第8天进行骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色。参照吕享等[7]的染色方法染色观察。 2.3分组各取1.2项下制备的大血藤醇提物和水煎物浸膏200mg溶到1mLDMSO中，制成200g?L-1的储备液，梯度稀释到20，2g?L-1备用。实验分为7组:空白对照组、醇提物低剂量组(EL，2mg?L-1)、醇提物中剂量组(EM，20mg?L-1)、醇提物高剂量组(EH，200mg?L-1)、水煎物低剂量组(WL，2mg?L-1)、水煎物中剂量组(WM，20mg?L-1)、水煎物高剂量组(WH，200mg?L-1)。 2.4对骨髓细胞向破骨细胞分化和骨吸收功能的影响按2.1项方法分离培养细胞，按2.3项下方法分组，分化实验每组设4个复孔，骨吸收功能实验每组设3个复孔，置于37?，5%CO2培养箱中培养。24h左右更换含1×10-8mol?L-1的1α，25-(OH)2VitD3和各剂量药物的全培养基， 4 然后每3d更换1次上述含药培养基进行药物干预，药物干预到第8天进行TRAP染色、TRAP活力测定和骨磨片骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色。 TRAP染色:染色方法同2.2项下的TRAP染色，然后统计整张玻片上的阳性细胞数。 TRAP活力测定:先用0.2%TritonX-100裂解，然后按照抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)测试盒说明书进行，于酶标仪上检测530nm处吸光度(A)，数据，根据说明书上的计算换算成金氏单位(U?L-1)。 骨磨片骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色:根据2.2项下骨磨片骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色方法进行，然后用ImageProPlus6.0软件统计整张骨磨片的骨吸收陷窝的数量和面积。 2.5对成骨细胞增殖的影响采用MTT法进行细胞增殖实验。将处于对数生长期的MC3T3-E1Subclone14细胞悬液以每孔5×103个接种至96孔板内，按2.3项分组，并增设不含细胞只含全培养基的对照组，每组设6个复孔，置37?，5%CO2培养箱中培养。24h左右更换含各剂量药物的全培养基进行药物干预，药物干预48h后每孔加入5g?L-1MTT溶液20μL，继续培养4h后终止。吸弃各培养孔上清液后，分别加入150μLDMSO，微孔板振荡器振荡10min，使结晶物充分溶解，酶标仪于490nm波长下比色，记录吸光度(A)，细胞相对增值率=(A实验组-A空白对照)/(A空白对照-A完全培养基对照)×100%。 2.6对成骨细胞碱性磷酸酶活力的影响[8-9，13]将MC3T3-E1Subclone14细胞以1×104个/孔的密度接种到96孔培养板，按照2.3项分组，每组设4个复孔，置37?，5%CO2温箱中培养。24h左右 5 更换含L-抗坏血酸(50mg?L-1)、β-甘油磷酸钠(10mol?L-1)、地塞米松(1×10-8mol?mL-1)和各剂量药物的全培养基进行药物干预，药物干预72h后，弃培养液，用PBS缓冲液轻洗2次，每孔加入细胞裂解液100μL(1%TritonX-100)4?裂解30min，按照碱性磷酸酶试剂盒的操作表进行操作，根据说明书上的计算公式换算成金氏单位。金氏单位定义:每1g组织蛋白在37?与基质作用15min产生1mg酚为1个活力单位。同时用BCA法测定其蛋白浓度。按说明书上的计算公式计算酶活力。 2.7统计学处理所有的实验数据均以?s表示，采用SPSS20.0统计软件进行方差，P<0.05表示具有显著性差异，P<0.01表示有极显著性差异。 3结果与分析 3.1破骨细胞的鉴定破骨细胞为贴壁细胞，边缘呈不规则形态。破骨细胞经HE染色后胞浆呈粉红色，胞核呈浅蓝色，多核。破骨细胞经TRAP染色后会在酶活性部位形成不溶性红色染料，在显微镜下，可以清晰地看到胞浆呈紫红色的阳性细胞，即为破骨细胞。和破骨细胞共培养后的骨磨片经甲苯胺蓝染色后会形成以紫蓝色串珠样连接，形态各异的骨吸收陷窝，骨吸收陷窝形态主要有L形、圆形、椭圆形、腊肠形等，见图1。 3.2大血藤提取物对骨髓细胞向破骨细胞分化和骨吸收功能的影响对TRAP染色阳性细胞数量的影响:大血藤醇提物和水煎物的低、中、高剂量组均可显著抑制TRAP染色阳性细胞数目(P<0.01)，见图2。各组TRAP染色情况见图3。 对TRAP活力的影响:各组TRAP活力值都小于空白组，且与空白组相 6 比，大血藤醇提物和水煎物中剂量组具有显著性差异(P<0.05);大血藤醇提物和水煎物高剂量组具有极显著性差异(P<0.01)，表明20,200mg?L-1的大血藤提取物和水煎物均能显著性抑制破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶活力，见图4。 对骨吸收陷窝数量和面积的影响:大血藤醇提物和水煎物各剂量组破骨细胞骨吸收陷窝数量都少于空白组，且与空白组相比具有极显著性差异(P<0.01)，见图5;大血藤醇提物和水煎物各剂量破骨细胞骨吸收陷窝面积都显著性小于空白组(P<0.05)，表明大血藤能显著性抑制破骨细胞的骨吸收功能，见图6。各组破骨细胞骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色情况见图7。 3.3大血藤提取物对成骨细胞增殖和分化的影响对MC3T3-E1Subclone14细胞增殖的影响:大血藤醇提物和水煎物的低、中剂量组增值率为正值，表明其能促进MC3T3-E1Subclone14细胞的增殖，其 中醇提物低、中剂量组和水煎物中剂量组A与空白组相比具有显著性差异(P<0.05);大血藤醇提物和水煎物高剂量组增值率为负值，表明其抑制了成骨细胞的增殖，见表1。 对MC3T3-E1Subclone14细胞碱性磷酸酶活力的影响:大血藤醇提物和水煎物各剂量组碱性磷酸酶活力值都大于空白组，表明大血藤对MC3T3-E1Subclone14细胞碱性磷酸酶(ALP)活力具有显著性促进作用(P<0.01)，见表2。 4讨论 大血藤是我国独有的植物，分布广泛，以藤茎入药，历史悠久。迄今已从大血藤中分到了多种化学 7 成分，主要有蒽醌、酚类、黄酮类、鞣质及皂苷类等。现代研究表明，大血藤具有抗菌、抗病毒、消炎、抗肿瘤、抗辐射等作用[10]。笔者经过文献调研，尚未发现有大血藤关于抗骨质疏松方面的药理作用研究。 破骨细胞来源于特定的破骨细胞前体，破骨细胞前体产生于骨髓，随后进入血循环，并在一系列信号分子的作用下迁移至骨吸收单元并发挥骨吸收作用，是骨吸收活动的主要功能细胞[11]。本研究中TRAP染色阳性细胞计数结果表明大血藤醇提物和水煎提物各剂量组均能显著性抑制破骨细胞的数量(P<0.05)，且具有剂量依赖性。培养基中所含的1α，25-(OH)2VitD3具有诱导破骨细胞前体分化成熟的功能，因此TRAP染色的细胞数目既包括成熟的破骨细胞也包括经诱导而来的破骨细胞，表明大血藤可以抑制骨髓细胞向破骨细胞分化。抗酒石酸酸性磷酸酶是破骨细胞的标志性酶，其活性可作为骨吸收能力和破骨细胞活力的标志[12]。本研究中TRAP活力测定结果表明大血藤醇提物和水煎物低、中剂量组能够显著性抑制TRAP活性(P<0.05)。骨吸收陷窝是破骨细胞骨吸收的直接结果，陷窝数量、大小直接反映破骨细胞骨吸收的能力。本研究中大血藤醇提物和水煎物各剂量组的骨吸收陷涡面积和数量的结果表明大血藤能显著性抑制破骨细胞的骨吸收功能(P<0.05)，且具有剂量依赖性。 MC3T3-E1Subclone14细胞是从表型各异的MC3T3-E1细胞系中分离出的亚克隆，其行为与原代培养的颅顶成骨细胞类似，是研究体外成骨细胞分化的理想模型[13]。成骨细胞负责骨基质合成、分泌和矿化，是骨形成的主要功能细胞，通过刺激成骨细胞增殖是治疗骨质疏松症的主要方法之一。本研究中大血藤醇提物中剂量组和水煎物低、中剂量组均对成骨细胞 8 具有显著性促进增殖作用(P<0.05)。碱性磷酸酶是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，是成骨细胞分化的特异性标志[14]。本研究中大血藤醇提物和水煎物各剂量组均能显著性促进MC3T3-E1Subclone14细胞的分化，且越接近中剂量组其促进作用越好。 综上所述，大血藤具有抑制骨髓细胞向破骨细胞分化和骨吸收功能的作用，同时也能促进成骨细胞的增殖和分化，将为大血藤作为抗骨质疏松候选新药的开发提供了体外理论数据，但其具体的抗骨质疏松作用仍需通过体内动物模型来进一步证明。此外，对大血藤活性部位及活性成分的深入研究，将对其药效物质基础的阐明具有重要意义。 [参考文献] [1]中国药典.一部[S].2010:19. 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