[doc] 正常人外周血淋巴细胞IL—2受体免疫放射测定

[doc] 正常人外周血淋巴细胞IL—2受体免疫放射测定 正常人外周血淋巴细胞IL—2受体免疫放射 测定 i明兑磁扫上,鑫昝I逄 苏州医学院 ACTAACADEMIAEMEDICINAESLrZHO~t1991}11(4)’275 7一z77 正常人外周血淋巴细胞IL一2受体免疫放射测定 V 垦堂冯树一步呜张学光茅子均R.1- (苏州医学院病理生理学教研室) 掩要采用I标记小鼠抗人?一2受体(P55)的抗Tac(CD~)单克隆抗体成功地建立r凡IL一 2受体的免疫放射分析法.动志观察了凡外周血淋巴细胞经PHA刺擞24,48和7后IL--2受悻表 达的时问曲线?通过Scatchard作图分析表明I一抗Tac单克窿抗体与PHA活化的述三十时点 的T淋巴纲胞的最大结台窖量(B,)分别为43000位点/细胞,54000位点/细胞和61000位点/细胞. 车研究为临睐IL--2受体检{昊j提供,种简便的免疫放射测定法. 美薯词人淋巴细胞}lL一2受体;免疫放射分析 中圈法分类R446.62 自I976年Morgan等发现TCGF(1979改 称?一2)以来,人们很快证实了它在激活利 增强免疫反应过程中起着极其重要的生物学 作用,这种作用的正常发挥首先依赖于IL一2 和靶细胞膜上的皿一2受体(IL一2Rj结 合[.近年来不少学者利用放射性同位素标 记IL一2或抗IL一2R的单克隆抗体进行了 IL一2R的研究r,我ff]用.I标记了抗人IL 一 2R的单克隆抗体抗Tac,成功地建立了人 IL,2R的免疫放射测定法. 材料与方法 一 ,试剂 1.单抗}抗Tac(CDzs)(批号80l223)利 T3(CD3)(批号900423)分别为小鼠抗人IL一 2R和小鼠抗人总T细胞的单克隆抗体,由武 汉生物制品研究所提供. 2.PHA:广州蹉工所产品,批号8905I. 3.Na”‘I中科院原子能所产品,放射性 浓度6l42kBq/mm,批号90IOl1. 4.RPMI1640培养渍:美国GIBCO产品, *江苏省科学技术委员会资助谭 加入20retoolHEPES,5×l0mol2一ME, i00u/ml青霉亲,loov$/ml链霉索和l0灭 活新生小牛血清. 二,抗体碘标记 抗Tac单抗经氯氨T法进行sI标记.用 ScphadexGS0分离.放射性活度51400dpm/ ns,放射性游离穰小于2. 三,I一抗Tac与淋巴细胞的结合反应 及结合nsI一抗Tac的分离 取正常供血员外周血(取自苏州市中心 血库).肝素抗凝,用0.OlmolpH7.2PBS l:l稀释后,经淋巴细胞分离液t海试 剂二厂产品,比重1.077士0.02)分离淋巴细 胞,用RPMI1640培养液调整细胞浓度为2 ×IO~/ml,然后移至2d孔培养板置37?CO 培养箱用08/mlPHA刺激2{d8年?72h. 培养后的淋巴细胞经PBS充分洗涤后,加入 一 定浓度的I一抗Tac,非特异结合组加入 IS0倍未标记的抗Tac,总反应体积为20l 内吉Ixl个待测细胞.在37恒温水浴中温 育20rain,使结合反应达到平衡,然后加入 第ll卷 PBS2ml(璜冲)薅止反应.结台与游离标记抗 体的分膏采用滤庾抽滤法,先用l9型空气滤 膜(上jI红光造纸厂产品),负压冲冼l0次后 用,一免疫计数嚣确定放射性计敦(cpm 值). 四,间接免疫荧光试验将PI’L~刺檀c 24,48和72h的淋巴细胞进行间接免疫荧光 试验,一抗采用单克廛抗体L(CD3)(工作浓 度为lt100).待涮细胞在加入一抗后置d? 冰箱过夜,然后经啉充分洗涤后,舂加入 FITC标记的兔抗鼠【BG荧光抗体(武汉生物 制品研究所产品.批号8904)置4-c冰箱 60ram,PBs陡3次后,涂片.倒置荧光显傲镜 观察.计敷L阳性细胞,得到阳性百分散后, 再计算培养细胞中T细胞的总教. 五,数据处理按下列公式求出’I一抗 Tac与待翊i细胞的结音量[‘=: 一 趣警籀鹋 获得特异性结合位点/每细胞(B)值后, 再计算B/F(P为游离标记的维度),以B/F 对B进行Scatcl~rd作图,计算最大结合容量 (k)和平衡解惠常敷(Kd). 结纂 一 ,”I一抗Tac和PHA擅c活淋巴细胞特 异结合的饱和曲线及Sc~tctmrd作图. 静止舶T淋巴绷撼很步表达皿一2R.当 其=唛囊活后则表达出大量的IL一2R.为了探 讨l一抗Tac与PHA活他的T淋巴细胞 (24,8和72h)的结合挣性.我们将一定敷量 的蠹活r琳皂细臆与不同{l量的”I一抗 Tac在pH7.2,37”C的条件下一起孵育.从而 绘村出饱和曲线,并以B/F对B进行 Scat~Imtd作图(见圈l,2,3).从图可见,’I一 抗-Tac与PHA棚蠢24h后的T淋巴细胞的 矗为43000位点/细臆,平衡解离常敷为 1.2B×10.-mo】/L}48h后的.r淋巴细胞的B_I 为54000位点/细胞,平衡解寓常数为1.44 ×l’tool,L}72h后T淋巴细胞的B为 6l000位点/细胞;平衡解离常数为1.68x 10_.mot/L. 1 达敷 量,结果表明,无论是在加入相同稀释度的 I一抗Tac后通过测定特异的I一抗Tac结 合量计算获得的每个细胞特异结台的位点 数,还是通过Seatclmrd作图得出的(图 d)均提示,在我们所选的时l可范围内,随着刺 激时间的延长,淋巴细胞表达一2R的数量 增加.到72h时受体表达到高峰,这与文献报 道相吻台J. 田’PHA刺激人外周血T淋巴细胞TL一2R 表达的时问曲线 讨论 一 211L一2R系统在免疫反应中起着 极为重要的作用,引起了众多学者的关注.对 IL一2R的某些特性目前借助现代分子生物 学技术和受体分析技术已肯初步TU.为了 进一步探讨rL一2R表达的规律和机制,我们 用NaI标记了抗人IL一2R的单克隆抗体 一 抗Tac-成功地建立了人淋巴细胞?一2R 的免疫放射分析法.并从同的时间动态研 究了PHA激活的T淋巴细胞?一2R表达的 动力学,为进一步研究打F了良好的基础.从 Scatc~d作图分析可见.PHA刺激24,d8和 72h后.T淋巴细胞表达?一2R的最大结台 容量分别为43000位点/细胞,54000位点/ 细胞和61000位点/细胞.国内朱迅,杨贵 贞[c只报道了PHA刺激72h后T淋巴细胞 表达lL一2R的最大结台容量为32000位点/ 细胞,与我们的结果差别较大,而我们的结果 与国外学者报道的结果相吻合[5朋.说明我们 建立的方法可用于临床对IL一2R的检测. (奉文得到苏州医学院棱医学研究室江一民教 授指导和帮助-特此致谢) ?考文献 rI]Roi3~RJ.Int~r1.cukitt2’cm,ol’icu.~aL恒t[unc? ticn.1mmunoIToday1084I5i203 r2]R01)bRJ,clall,Retcnlionofh_岫Iq且lactiviryfd’ lowin8radioiodinalio~l0lhumanmluk2.J [mmur~olMdtx血1985l8Il15 r31wer.曲IJw,d.Hn州waffinityIL一2 r=arullysi~byIL一2daI?llc一 [】vcwllb’x:上Larll[一r?叩【时an!it~dy PC6Jlmmunc,l1985l135i3988 ]朱迅,杨贵贞.凡带巴}-I胞IL一2受体免硷放射 分析中华棱医学杂志1090)10(1)36 r5]RoI:~RJ.BTa1.LowandhighaffilliIyIlurrc cep~omf0rinrl咖”n2.Jp眦I蝴1;[60: ll26 [63Oeprmr刑.d.Rcgulmionir|lcr[cukllI2 .l0rex~ioa.JImmr~olJ984~1333054 (1991年1月【口牧格) l0一×霉器\啦姆球璋毒嚣.碧