冷自体心脏停搏液对离体兔心肌结构的影响（可编辑）

冷自体心脏停搏液对离体兔心肌结构的影响（可编辑） 冷自体心脏停搏液对离体兔心肌结构的影响 遵义医学院硕士研究生 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。学位论文中除了特别加以标注和致谢的地方外,不包 含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的 启发和所做的贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签字日蝴:洲;年黔日 学位论文作者签卿河 遵义医学院学位论文版权使用 本人完全了解遵义医学院有关保留、使用学位论文的规定,即:遵义 医学院有权保留并向有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘,允许 论文被查阅和借阅。本人授权遵义医学院可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索,可以公布学位论文的全部或部分内容,可以 采用影印、缩印或其它复制手段保存学位论文,即:遵义医学院具有学位 论文的数字化制品复制权,信息网络传播权和汇编权。保密的学位论文在 解密后适用本授权书。 导师签名: 签字日期劬叼?年一月、日 英文缩略词表 缩略词 英文全称 中文全称心肌缺血一再灌注损伤 组氨酸一色氨酸一酮戊二 酸心脏停搏液 冷自体血心脏停搏液体外循环 缺血预适应 透射电镜 . . 重碳酸盐缓冲液超氧化物歧化酶 丙二醛 热休克蛋白 氧自由基 苏木素一伊红染色 ? 目 录 、 论文:冷自体血心脏停搏液对离体兔心肌结构的影响 中文摘要英文摘要前言“??“??““一?“?一“ 刖舌“””“““”一“”““?? “一”““”?““?“”一““”“ 材料与方法? 结果? 讨论结论参考文献、 综述:冷自体血心脏停搏液对术中未成熟心肌保护作用的特 点,~’、 一 、? 致射、 作者简介遵义医学院硕士学位论文 中文摘要 冷自体血心脏停搏液对离体兔心肌结构的影响 中文摘要 目的:本研究通过对比冷自体血心脏停搏液、液及.液对离体兔心肌含 水量、显微结构、超微结构、肌原纤维超微结构损害程度及细胞核超微结构损害程度 的影响,探讨冷自体血心脏停搏液对离体兔心肌结构的影响及对心肌的保护作用机 制。 方法:选取体重在?普通级健康成年家兔只雌雄不拘,随机分为冷 自体血心脏停搏液组组、液组组及.液组组,每组各 只。分别建立离体兔心脏灌注模型,离体心脏达稳定状态后各组随机抽取一只取左 心室组织分别做标本及电镜标本作为本组显微结构及超微结构的正常对照:各组 剩余只家兔分别灌注相应停搏液,灌注结束并再次达稳定状态后分别取一块左心 室心肌组织约××大小做染色标本,对比观察心肌组织显微结构心 肌纤维、横纹、心肌间质血管的变化:取卜块左心室心肌组织约××大 小做电镜标本,对比观察心肌组织超微结构肌原纤维、细胞核、闰盘、肌浆网和 横小管、细胞间质血管的改变;参照线粒体评分方法,对肌原纤维及细胞 核的超微结构损害程度进行分级、评分;剩余心肌组织用电子天平称重后,烤箱烘干, 测定心肌细胞含水量。 结果:与正常心肌结构对比,三组心肌组织的显微结构均有不同程度的损害,其 中组与组心肌结构的破坏程度基本一致,组破坏程度较组与组明显加重。 与正常心肌结构对比,三组心肌组织的超微结构均有不同程度的损伤,其中 组与组心肌超微结构的破坏程度差别不明显,组破坏程度较组与组明显加重。 肌原纤维超微结构损害程度参照分级评分:组.?.,组 .?.,组.?.,组、组损伤程度比组明显减轻,组与 组间无统计学差异乃.,组与组、组与组间有明显统计学差异尺.。 细胞核超微结构损害程度参照分级评分:组.?.,组. ?.,组.?.,组、组损伤程度比组明显减轻,组与组间无 统计学差异.,组与组、组与组间有明显统计学差异/.。遵义医学院硕十学传论文 中文摘要 心肌含水量:组.?.,组.?.,组.?.,组与 组无统计学差异侈.,与组相比较,组、组心肌含水量较少,且差异有 统计学意义.。 结论:经缺血再灌注后,离体兔心肌组织结构有不同程度的损伤,冷自体血心脏停搏 液对心肌结构的保护作用效果与液相当,且优于.液。 关键词:冷自体血心脏停搏液、离体兔心脏灌注模型、心肌缺血一再灌注损 伤、心肌 结构、心肌保护 遵义医学院硕十学位论文 英文摘要 ; 喜曼量曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼孽曼曼毫曼皇曼皇曼曼曼曼曼皇曼皇舅 .一 一 鼍量葛皇皇皇鼍一 一 一一? :,, ,,. , . : :, . . , ’ . . ×, . × , ,, , 。 .., : . ,.. , . ., . ’ 英文摘要 遵义医学院硕士学位论文 .土. ..士.. : .士.. .. ,. . .士..’: .士.. 。士..,.. : . . .士. ..:.. .士.. .., .. : . . . : ,, 遵义医学院硕十学论文 西 .?上 刖 吾 在心脏外科手术中,心肌保护是决定体外循环 ,下 手术成功的重要保障之一,良好的心肌保护不但能减轻手术过程中的心肌缺血一再灌 注损伤,还能使术后心功能的恢复时间缩短,降低各种术后并发症术后低心排、心 衰等的发生率。自从开展心脏外科手术以来,人们对心肌保护措施的研究涵盖了整 个围术期,其中术中的保护至关重要。术中心肌保护除了要求术者有熟练的操作技巧 以缩短心肌缺血时间外,还需应用合适的心脏停搏液对心肌进行额外的保护。 “心脏停搏技术”首先由提出,既使用高钾停搏液使心脏停搏,取得满 意效果。术中心脏停搏不仅使手术野干净,更重要的是减轻心肌损伤。据统计,目前 心肌保护液配方有余种,按离子成分分为细胞内液型像如液、液、 液等和细胞外液型像.液、液、液等,按是否含血分为 含血停搏液和不含血停搏液两类,不含血停搏液又分为晶体停搏液和胶体停搏液。 .液及其改良液是传统的冷晶体停搏液,因其制备简单、灌注方便,目前 在临床上应用较为广泛。但等?报道,.液对未成熟心肌有损害作用。 其不足表现为:?不能提供氧和营养物质:?缺乏理想的酸碱平衡和胶体的缓冲:? 大量灌注时,若回收可稀释血液,若丢弃可造成血液浪费;?高钾可能造成冠状动脉 内皮细胞的损伤;?引起心肌冷挛缩。 基于冷晶体心脏停搏液的不足,临床上出现了含血心脏停搏液,它是在冷晶体心 脏停搏液的基础上加入充氧血制各而成,除了低温、高钾等作用外,还有氧和血的作 用。冷自体血心脏停搏液 ,首先在深圳市 儿童医院心胸外科应用于临床,自年以来己完成各种婴幼儿心脏直视手术多 例,收到了良好临床效果。冷自体血心脏停搏液是在转机前经主动脉抽取一定量的动 脉血,与晶体液混合配制,除了具有普通含血心脏停搏液的所有优点外,还具有其独 特地优势。张青、沈定荣、孟保英等?已经过各种临床实验证明其心肌保护的优势。 心肌组织形态学改变是心肌功能改变的基础,结构的改变将直接影响到术后心功 遵义瓦学坑硕十学伊论文 前言 能的恢复。因此,心肌缺血缺氧后显微结构及超微结构的改变可以作为心肌损害的客 观评定指标,反应心肌的功能改变阳。 心脏术后心肌组织都会有不同程度的水肿,是心肌缺血一再灌注损伤后引起的继 发性反应。体外循环心脏手术由于血液稀释、炎性因子释放及心脏停跳等,可导致心 肌水肿。有研究表明,心肌缺血损伤超过,就会出现明显的细胞水肿,引。心肌 组织含水量的极小幅度增加就能引起明显的心功能异常阳’训。心肌组织水肿可降低室 壁的顺应性,进而引起心脏舒缩功能的异常,易出现术后心律失常、低心排及 心衰等 严重并发症,严重影响了心脏的做功能力。因此,可以推断减少缺血一再灌注后心肌 的水肿程度可以减轻心肌的损伤,进而利于术后心功能的恢复。通过对心肌含水量的 测定可以间接评估心肌水肿的程度。 在光学显微镜下可观察到正常状态下心肌细胞有如下表现:心肌纤维平行排列整 齐,横纹清晰可见,连续整齐,间质无水肿,细胞核清晰,细胞质呈均匀的伊红染色, 细胞间质小血管管壁细胞排列整齐,无细胞碎片。有研究表明?,经过缺血一再灌注 损伤后的心肌光镜下表现出一定程度的损伤性改变。可表现为:心肌细胞间隙增宽, 间质水肿,心肌纤维连续性遭到破坏,发生断裂、扭曲、溶解等改变,细胞质凝聚, 伊红染色不均匀,横纹排列不规则。 心肌细胞的超微结构改变主要包括肌原纤维、闰盘、细胞间质血管及细胞核的形 态学变化,另外还有横小管、肌浆网、微血管内皮细胞及线粒体的改变。肌原纤维是 心肌细胞胞浆的主要成分,是心肌舒缩运动的结构基础。闰盘是心肌纤维间 的连接结 构,横位的桥粒和中间连接使心肌纤维间的连接牢固,纵位部分的缝隙连接是细胞间 化学信息的交流和电冲动传导桥梁。细胞核是细胞中最显著的结构,是细胞中最重要 的细胞器,是生命活动的控制中心,通过调节基因的复制、转录和翻译影响细胞的生 物学行为,同时也是生命代谢活动的控制中心。心肌细胞的肌管系统包括横小管和肌 浆网,横小管主要将兴奋由基膜传导至每个肌节。肌浆网多与一侧的终池形成二联体, 二联体可以将电兴奋从肌膜传到肌浆网膜,使肌浆网释放钙离子。有大量的研究表明 川,心肌在缺血后会出现超微结构的改变,并随着缺血时间的延长改变愈加明显。 再灌注会加重损伤的程度,经过缺血一再灌注后的心肌超微结构主要表现为:肌原纤 维溶解及断裂,肌丝排列呈现出各种形式的紊乱,带增宽,线、线结构异常,表 遵义医学院硕十学仿论文 前言 现为增宽、凝聚,甚至扭曲变形:细胞核周围间隙扩张,核膜完整性遭到不同 程度破 坏,出现皱褶及断裂,染色质出现不同程度的溶解,异染色质异常堆积,核仁模糊或 消失。横小管和肌浆网不同程度的扩张,严重扩张的肌浆网成池状、成片出现;闰盘 广泛扩张,结构模糊、迂曲,连接间隙明显增宽,在相邻的细胞侧面亦会出现较多的 闰盘’刮。心肌结构的改变与心肌功能的改变是一致的。肌原纤维的破坏,将影响到 肌节的正常结构,影响到术后心肌的正常舒缩运动;细胞核结构的破坏将严重影响细 胞内各种蛋白的合成,进而影响心肌组织的稳定和功能的发挥;横小管和肌浆网结构 的损害,将对心肌兴收耦联产生影响;闰盘形态结构的改变将影响心肌细胞问的连接 及化学信息的交流、电冲动的传导。 本课题组前期已有临床实验证实冷自体血心脏停搏液对未成熟心肌有一定的保 护作用,但由于临床取材的限制,未能对心室肌结构进行研究观察,且未有成人心脏 手术中应用的报道。本实验采用成年家兔作为实验对象,建立离体兔心脏缺血一再灌 注模型,对比冷自体血心脏停搏液、液、.液对离体兔心室肌细胞结构的 影响,揭示冷自体血心脏停搏液对心肌的保护作用,从而为冷自体血心脏停 搏液在临 床上的进一步推广应用提供实验依据和理论基础。 遵义医学院硕十学位论文 材料与方法 材料 .实验动物 普通级健康成年家兔只,雌雄不拘,由广东省医学实验动物中心提供,许可 证号:粤。 .实验仪器 ....型电热恒温干燥箱常州市华普达教学仪器有限公司 .型摊片机 .型切片机 .型超薄切片机 型包埋机 生物组织自动脱水机湖北省孝感市亚光医用电子技术公司 显微镜 数码显微摄像系统 一透射电镜美国 型电子天平上海天精密仪器有限公司 动物手术器械深圳市孙逸仙心血管医院手术室 小动物实验台深圳市孙逸仙心血管医院动物实验室 改良装置自行组装 .主要实验试剂 .. 戊巴比妥粉剂 肝素钠:单位,江苏万邦生化医药股份有限公司 液德国克勒化学制剂 %醛溶液深圳市孙逸仙心血管医院病理科提供 电镜标本固定液.%戊二醛%多聚甲醛,中山大学电镜室提供 ..主要溶液的配置 平衡液 遵义医学院硕:上学位论文 材料与方法 . / . / . / . / . 儿 . / . / .液儿儿/ / . / %戊巴比妥钠溶液取戊巴比妥钠,充分溶于生理盐水中,室温 避光保存。 方法 .实验分组及处理 只家兔按随机数字表法分为三组,每组只,分别为冷自体血心脏停搏液组 组、液组组、.液组组。每只取出心脏后均建立离体心 脏灌注模型,离体模型达稳定状态后,各组随机选取一只心脏,剪取块左心室心肌 组织约××大小放入%甲醛溶液中固定,做染色,作为观察心脏显微 结构的正常对照标本;剪取.块左心室心肌组织约××大小放入电镜固 定液中做电镜标本,作为观察心脏超微结构的正常对照标本。各组其余家兔离体心脏 灌注相应停搏液,灌注方法详见下述,实验结束后留取标本观察心肌组织纤维结构变 化、超微结构变化及心肌含水量。 .离体兔心脏灌注模型的建立 离体兔心脏灌注模型采用自行组装的改良装置,家兔用配置好的% 戊巴比妥钠/进行腹腔注射麻醉,麻醉后取仰卧位固定在动物实验台上, 遵义医学院硕士学位论文 材料与方法 先行颈部切口,游离气管,行气管插管防止开胸时胸膜损伤导致肺不张,用简易 呼吸器辅助呼吸。胸部皮肤剪毛、消毒、铺无菌单后,依次切开皮肤、肌肉层,粗剪 刀剪开胸骨,充分暴露心脏及大血管,胸骨切开后立即经耳缘静脉给予肝素 钠 /注射,全身肝素化。组用注射器经主动脉根部快速抽取动脉血约 为/,如图留待配置冷自体血心脏停搏液,抽血过程中勿使心脏出现室颤 及停跳,抽血完毕后快速取出心脏,组、组开胸肝素化后直接取出心脏。 心脏取出后用冷平衡液约?快速冲洗,并轻轻挤压,将残血冲洗干净, 主动脉根部稍加修整立即从剪下心脏到开始灌注?平衡液,时间应小于连 于自制装置如图,图,开始灌注?平衡液,灌注液温度保持在 .。,灌注压力保持在为.,平衡液通以混合气体: %:%,/,将肺动脉根部剪开以保证冠状动脉回流通畅,灌注液过程中 将心脏移入?保温缸内,灌注后离体心脏达到稳定平衡状态。 图:主动脉根部抽血 图:自制装置 图:连接方式 .冷自体血心脏停搏液的制备 将组家兔中自主动脉根部抽取的动脉血与事先配好的晶体母液均匀混合血 液: 晶体母液:,保持浓度/,配置完成后浸入冰屑中制成?冷停搏液备 用。 .灌注方法 组、组、组离体兔心脏达稳定状态后,分别灌注冷自体血心脏停搏液、 液、.液,灌注量为/,灌注压力保持在?,内灌完, 遵义医学院硕士学位论文 后重复灌注一次,灌注量为/,整个过程使心脏停跳,心脏停跳期 间,将心脏悬挂在保温缸内,保持心脏周围温度.。,后重新灌注通以混合 气体的?平衡液灌注温度.?,灌注压力.,使心脏复跳并再次 达到平衡状态,后结束灌注。 .心肌显微结构的观察 .. 染色标本的制备 组、组、组灌注结束后,分别取左心室 大小的心肌组织块,放 入%甲醛固定液中充分固定,使组织经过脱水、浸蜡、包埋、修块、切片后, 制成 石蜡切片。 将石蜡切片放入?烤箱烘烤。 放入二甲苯中脱蜡。换新鲜的二甲苯,再次脱蜡。 依次放入无水乙醇,%乙醇,%乙醇,蒸馏水。 苏木精染色 ,流水洗去苏木精液。 %盐酸乙醇,稍水洗,蒸馏水冲洗。 .伊红液染色,蒸馏水稍洗。 依次放入%乙醇,%乙醇,无水乙醇,蒸馏水 放入二甲苯透明,三次,每次换新鲜的二甲苯,每次。 中性树胶封片,光镜下观察。 ..标本的观察 将制作好的标本放在光学显微镜下观察,每张切片随机选取个视野观察,应 用数码显微摄像系统采集图像,对比观察、分析汇总。组、组、组三组内分 别与 本组灌注停搏液前留取的正常心肌组织做自身对照,观察心肌缺血一再灌注 后的损伤 程度变化;组间两两对照,对比观察三组心肌肌纤维、横纹、心肌间质血管等 的损害 程度。 .超微结构的观察 ..电镜标本的制备 组、组、组灌注结束后,分别取左心室××大小心肌组织块,组 遵义医学院硕:学位论文 材料与方法 织切取时要求动作迅速、组织体积小、机械损伤小、低温操作。 前固定:将心肌组织放入.%戊二醛一%多聚甲醛一./磷酸缓冲液固 定以上。缓冲液冲洗次/次。 后固定:%饿酸一./磷酸缓冲液固定.以上,缓冲液冲洗次 /次。 脱水:依次用%、%、%、%、%乙醇逐级浸泡脱水,每次, %丙酮浸泡次,每次。 包埋:用丙酮混合液丙酮:包埋剂:浸泡:丙酮混合液?丙酮: 包埋:,浸泡;纯包埋剂浸泡过夜。 塑形:将组织放入包埋板中,?约至硬化。 切片:切卜 半薄切片,对照定位后切超薄切片,捞于铜网上。 染色:饱和醋酸铀、枸橼酸铅染色。 ..超微结构的观察 将制作好的切片放在电镜下观察,每张切片随机选取个视野,应用电镜图像 采集系统采集图像,对比观察、分析汇总。组、组、组三组标本组内分别与 本组 灌停搏液前留取的正常心肌组织做自身对照,比较心肌缺血再灌注后的超微 结构变 化,组间两两对照,观察三组心肌组织超微结构中肌原纤维、细胞核、闰盘、 肌浆网 和横小管、细胞间质血管等结构的损害程度。 ..参照线粒体评分计量肌原纤维损伤程度? 每个电镜标本随机选取同等放大倍数选取放大倍下个视野,按线粒体 评分法判断肌原纤维损伤程度,后计算每个标本肌原纤维损伤程度的平均得 分。评分标准为见图: 级分:肌原纤维排列整齐有序,肌节清晰不乱; 级分:肌纤维略有融合,肌节不清晰; 级分:肌纤维肿胀,肌丝紊乱、有断裂; 级:肌纤维成片状溶解。 遵义医学院硕士学位论文 材料与方法 级 级 级 级 图:肌原纤维超微结构改变分级透射电镜× .: ..参照线粒体评分标准计量细胞核损伤程度 每个电镜标本随机选取同等放大倍数选取放大倍下个细胞核,按线 粒体评分法判断细胞核损伤程度,后计算每个标本细胞核损伤程度的平均得 分。评分标准为详见图: 垄义医学院硕士学位论文 材料与方法 一 级分:核膜完整,结构清晰,核仁明显,染色质分布均匀; 级分:膜有皱折,核周有少量异染色质堆积,核仁模糊; 级分:核膜有断裂缺损,异染色质明显堆积,核仁不清; 级分:核膜溶解,核仁不见。 级 级 级 级 图:细胞核超微结构改变分级透射电镜×.:..心肌含水量计算 材料与方法 一道义医学院硕十学位论文 将剩余心肌组织吸干表面水分,用电子天平称重后,放 烤箱中烘干小 时,测定干湿重,计算心肌含水量。 心肌含水量湿重~干重/湿重×% .统计学处理 所有数据结果均以士?表示,应用 .统计学软件进行统 计学处理,数据进行正态分布及方差齐性检验,组问两两比较采用方差分析, 尺.为差异有统计学意义。 结果 遵义医学院硕士学位论文 .心肌显微结构观察 ..观察结果 冷自体血心脏停搏液组组 自身对照标本:细胞质呈均匀的伊红色,心肌纤维周围间隙较小、间质无水肿, 心肌纤维平行排列整齐、连续完整,横纹清晰、整齐,细胞核清晰,细胞间质小血管 内皮细胞排列整齐。 实验标本:细胞质偶有凝聚至有嗜伊红深染区,心肌纤维周围间隙因水肿而轻度 扩张,心肌纤维排列轻度扭曲,连续性遭到破坏,局部偶有断裂,横纹清晰可见,但 排列不规整,细胞核清晰,细胞间质小血管内偶见细胞碎片。 液组组 自身对照标本:结果同组自身对照标本。 实验标本:结果同组实验标本。 .液组组 自身对照标本:结果同组自身对照标本。 实验标本:细胞质凝聚至嗜伊红深染区较多,心肌纤维周围间隙因水肿而扩 张较 组、组加重,心肌纤维排列轻、中度扭曲,连续性遭到破坏,多见断裂、溶解, 横纹不清晰,排列不规整,细胞核可见,核周间隙增宽,细胞间质小血管内见 细胞碎 片。 .. 染色标本图像 一 一 一 ‘ .‰《?露 鬣丞覆斌、?。,.一 :× :× :× 图:正常对照肌纤维排列整齐,血管内皮细胞完整,横纹整齐、清晰 .: 遵义医学院硕士学位论文 结果 .、’ 二一 ??一 :× :× :× 图冷自体血心脏停搏液组肌纤维偶见断裂,微血管内可见细胞碎片,横纹排 列不整齐 .: , 日 二 ?、?~ :× :× : 图:液组肌纤维轻度肿胀,排列轻度扭曲,偶见深染区,横纹排列不整齐 , .: ~? 一 一 一一‘ ??? 。 ~。 、 :× :× :× 图:.液组肌纤维多见扭曲溶解,细胞核周围间隙增大,肌纤维重度肿胀, 横纹模糊不清。排列不整齐 :. ., , , 遵义医学院硕士学位沦史 结果 .超微结构观察 ..观察结果 冷自体血心脏停搏液组组 自身对照标本: 肌纤维连续完整,未见溶解及断裂,肌丝排列整齐,带、线、线清晰, 肌节结构无破坏,排列整齐,无收缩带形成。 细胞核核膜完整,无溶解及断裂,染色质均匀丰富,核仁明显。 闰盘结构正常,未见溶解、扩张。 间质微血管内皮细胞结构正常,未见崩解的细胞碎片。 肌浆网和横小管结构正常,未见扩张。 实验标本: 肌纤维连续完整,偶有断裂、点状及小片状溶解,少量肌丝排列出现轻度 紊乱,线、线无明显异常,肌节排列整齐,无收缩带形成,偶见个别肌节出现点 状或小灶状溶解。 细胞核核膜连续完整,核仁清晰,染色质分布均匀,细胞核偶见异染色质 边集。 闰盘结构正常,连续完整,无溶解,偶见扩张。 间质微血管内皮细胞结构正常,偶见崩解的细胞碎片。 肌浆网和横小管结构正常,轻度扩张。 液组组 自身对照标本:结果同组自身对照标本。 实验标本:结果同组实验标本。 .液组组 自身对照标本:结果同组自身对照标本。 实验标本: 部分肌纤维连续性遭到破坏,可见断裂,部分肌丝排列出现轻、中度紊乱, 少量线、线出现增宽、轻度扭曲,肌节排列整齐,无收缩带形成,少量肌节出 现 小灶状溶解。 部分细胞核核膜出现断裂、溶解,连续性遭到破坏,少量细胞核出现异染 遵义医学院硕士学位论文 结果 色质堆积、核仁消失。 少部分闰盘连续性遭到破坏,出现扩张、迂曲、结构模糊。 问质微血管内皮细胞结构正常,偶见崩解的细胞碎片。 肌浆网和横小管中度或轻度扩张,少数细胞可见大囊性扩张。 ..电镜标本图像 图:电镜 图:电镜 图:电镜 图:电镜× 结果 遵义医学院硕士学位论文 图:电镜× 图:电镜× 图 :正常心肌超微结构图肌原纤维排列整齐,肌节结构完整,线、线清晰,细胞核形 态、结构正常,闰盘结构完整,间质血管内皮细胞无破损,肌浆网与横小管无扩张 : 。 . , , . 图:电镜× 图:电镜× 遵义医学院硕士学位论文 结果 图:电镜× 图:电镜× 图:电镜× 图:电镜× 图:冷自体血心脏停搏液组肌原纤维连续完整,偶见点状溶解,肌节排列整齐,细胞 核见轻度异染色质边集,闰盘结构正常,偶见扩张断裂,间质血管偶见细胞碎片,肌 浆网和横小管轻度扩张 : . , , , . 结果 遵义医学院硕士学位论文 图:电镜× 图:电镜 图:电镜× 图:电镜 图:电镜× 图:电镜×遵义医学院硕士学位论文 结果 图:液组肌原纤维连续完整,偶见扭曲,部分肿胀,线、线清晰,细胞核可见 轻度异染色质边集.闰盘结构完整,部分模糊,间质血管内皮细胞偶见破损 : ., ? . , , , . 图:电镜× 图:电镜× 图:电镜× 图:电镜 遵义医学院硕士学位论文 结果 图:电镜× 图:电镜× 图:.液组肌原纤维间明显肿胀、中度溶解,线、线模糊增宽,肌节结构 破坏,可见收缩带,细胞核异染色质明显堆积,闰盘模糊不清、部分断裂,问质 血管 内多见细胞脆片,肌浆网和和横小管中重度扩张。 。:.? ,? , , ,, , . .肌原纤维、细胞核超微结构损伤程度评价 ..肌原纤维超微结构损伤程度 组、组肌原纤维损伤程度低于组。组与组组间差异无统计学意义胗 .,组与组,组与组组间差异具有统计学意义尸.。结果见表、 图 ..细胞核超微结构损伤程度 组、组细胞核损伤程度低于组。组与组组问差异无统计学意义., 组与组,组与组组间差异具有统计学意义.。结果见表、图遵义医学院硕十学 位论文 讨论 讨论 对照组停搏液的选择 心肌保护液的使用是临床上重要的一种心肌保护方法,现常用的有冷晶体心 脏停 搏液、含血心脏停搏液冷血、温血、液等。 .液及其改良液是传统的冷晶体心脏停搏液,其主要成分是高钾,其次是 镁、普鲁卡因、钙等成分,其机制是以含高浓度钾停搏液灌注心肌,使心脏停搏于舒 张期,加以低温灌注,使心脏完全处于停搏状态,心肌电一机械活动静止,能量消耗 降低,缺血耐受性增强。多年的临床经验证明.液有确实的心肌保护作用,且 其制备简单、灌注方便,因此.液目前仍为许多医院采用。基于细胞内液成分 的心脏停搏液首先由在世纪年代提出,称为? ?液 。其机制是依靠低钠、微钙的平衡作用使心脏停搏,其所 含组氨酸/组氨酸盐缓冲系统是液最突出的特点,色氨酸、:酮戊二酸等可作为能 量代谢的底物,且其钾含量低,为/,可反复或持续性原位灌洗无任何不良反 应及危险性。文献报道液对心肌保护有明显的优势幽。这两种停搏液在临床上应 用广泛、具有代表性,因此选用液与.液作为对照组,可以充分说明冷自 体血心脏停搏液保护心肌的效果。 缺血一再灌注可引起心肌组织损伤 心肌组织是对缺血缺氧非常敏感的器官,当心肌血液灌注减少时,将会引起心脏 结构和功能的损害。心肌缺血恢复血流供应后,使代谢功能障碍及结构损伤加重的现 象,称为心肌缺血一再灌注损伤乜? ,。在 此过程中涉及的损伤机制和损伤后的表现是多方面的,本课题研究的重点为 后 心肌结构的改变,其机制可能为以下几个方面: .钙超载 细胞内内流和分隔机制的失调是导致后心肌细胞内超载的主要原 因,另外,缺血缺氧期间形成的大量’再灌注后由于血液的冲洗迅速减少,减轻或消 除了对的拮抗作用,使作用增强。浓度升高使肌原纤维过度收缩,电镜下 表现为收缩带的形成,这种收缩是不可逆性的破坏,可引起心肌纤维的挛缩、断裂, 遵义阪学院硕士学位论文 讨论 使正常的肌节结构遭到破坏。浓度的升高还能增强钙依赖蛋白酶的活性。心 等已证实,钙依赖蛋白酶能够水解心肌纤维组成蛋白及各种膜结构蛋白,从而造成心 肌纤维和各种细胞器膜的溶解。另外肌浆网膜上的一胞衬蛋白可以被激活的蛋白酶水 解,从而使肌浆网膜的脆性增加,使肌浆网破裂。,的大量堆积 .氧自由基 心肌缺血再灌注时,通过心肌细胞线粒体损害、血管内皮细胞中嘌呤氧化酶 及其它氧化酶增多、中性粒细胞呼吸爆发、儿茶酚胺等途径生成增加。膜磷脂中存在 的不饱和脂肪酸可与过量的发生反应,形成脂质过氧化物,从而改变膜结合酶、 离子通道及受体的脂质微环境和膜成分的活性,增强膜的通透性和流动性,甚至破坏 其完整性。脂质过氧化引起膜结合酶活性中心上的巯基氧化,直接损伤心肌组织。另 外,可使碱基羟化或断裂,从而引起染色体畸变,造成细胞核中异染色质的 堆积。 .白细胞的激活 大量的中性粒细胞释放多种细胞活性因子,如炎性介质、蛋白水解酶,使间质血 管内皮受损、肌原纤维溶解及各种膜性细胞器膜破坏。多个细胞器的损害可造成心肌 功能障碍他?劓。另外心肌缺血后,细胞开始无氧代谢,提供能量减少,同时产生大量 的无氧酵解产物,这些物质可以直接对心肌组织结构造成损伤;引起的血管内皮 细胞损害、细胞凋亡等也是引起心肌损害的原因。 结构是功能的基础,术中心肌结构的改变直接影响到术后恢复。因此通过观察心 肌显微结构及超微结构的改变,可以在一定程度上反应心肌保护的效果,本研究课题 通过灌注三种心脏停搏液,发现复跳后的心肌组织在显微结构和超微结构上均发生了 一定程度的损害,可以推断,无论使用何种心脏停搏液,经过,心肌结构的损伤 是不可避免的。通过实验发现组与组心肌结构的破坏程度较组明显减弱,组与 组肌原纤维超微结构损伤程度评分与细胞核超微结构损伤程度评分较组低,且有明 显统计学差异,可以推断使用不同的停搏液,心肌保护的效果是不同的,使用恰当的 心脏停搏液,可以在一定程度上减轻心肌损害的程度,冷自体血心脏停搏液对心肌保 护的效果明显优于.液,与液无明显差异。 遵义夏学院硕十学位论文 讨论 心肌再灌注损后引起心肌细胞水肿 心肌组织水肿主要表现在两个方面:细胞内水肿和间质水肿。心肌损伤后产生的 多种炎症介质及细胞毒因子可引发血管通透性增加,另外产生的多种代谢产物在心肌 缺血后不能有效地随血液排出,导致心肌组织间渗透压失衡,引起组织间质水肿。而 细胞内水肿则是由于细胞膜上一.酶失活引起心肌经过缺血一再灌注损 伤后,能量代谢障碍,等能量储存物质缺失,引起细胞膜上.酶的功 能障碍。心肌组织水肿可降低室壁的顺应性,进而引起心脏舒缩功能的异常, 易出现 术后低心排及心衰。本实验结果显示组与组间心肌含水量无统计学差异,而组 和组的心肌含水量明显少于组,且有明显的统计学差异,其原因可能与冷自体血 心脏停搏液与液所含成分有关。冷自体血心脏停搏液未经体外循环管道及氧合器 等非生物材料的刺激,产生的炎症介质较少,富含的自体血红蛋白成分可维持有效的 胶体渗透压。含有丰富的游离脂肪酸、葡萄糖等原料,为心肌能量代谢提供物质基础 让嘲,维持一十.酶的活性。液富含各种氨基酸等胶体,所含甘露醇既可 发挥渗透作用,又可作为羟自由基的清除剂,防止氧自由基对血管壁的损伤。含有的 色氨酸和:酮戊二酸作为能量代谢的底物旧,使心脏停搏期间产生。相较于冷自 体血心脏停搏液和液,.液富含高钾,反复灌注可引起冠脉血管内外离 子平衡紊乱,造成晶体渗透压失调,且其主要成分为各种离子,不能维持有效的胶体 渗透压,亦不能提供能量代谢底物,因此更容易造成组织水肿与本实验结果相符。 冷自体血心脏停搏液的特点及对心肌保护的作用机制 冷自体血心脏停搏液自年起已在本单位应用于临床,其制备及应用技术已成 熟,本实验所采用的制备方法与临床相同。本实验通过观察心肌显微结构改变、心肌 超微结构改变、心肌肌原纤维超微结构损伤程度、心肌细胞核超微结构损伤程度及心 肌含水量测定表明,冷自体血心脏停搏液对心肌的保护作用与液相当,且明显优 于.液。经过多年的临床及动物实验已证明液具有良好的心肌保护作用, 因此可以推断,冷自体血心脏停搏液对心肌具有良好的保护作用。其作用特点与保护 机制可以从其成分与配制过程来讨论: .停搏液成分包含自体血。 遵义医学院硕士学伊论文 讨论 冷自体血心脏停搏液与液及.液相比较,其最大的特点是含有自体动 脉血。其优势主要体现在:血红蛋白携带的氧及血浆中的溶解氧可以使心肌组织 停搏于有氧状态。含有丰富的游离脂肪酸、葡萄糖等原料,为心肌能量代谢提供 物质基础。富含各种蛋白成分,可维持冠脉血管内外有效地胶体渗透压。有研究 证明啪,持续冷血灌注不仅能向心肌细胞供血、供能,尚具有蛋白质缓冲等作用。 所含血液均为自体血,可避免异体血液输注引起的过敏反应及排斥反应;未经体 外循环管道及氧合器等非生物材料的刺激,无中性粒细胞的激活、白细胞的浸润及氧 自由基和细胞因子的释放 引。自体红细胞能产生多种氧自由基消除剂,像超氧 化物歧化酶等,在一定程度上能减轻氧自由基等物质对心肌损害?。冷自体血心 脏停搏液中的蛋白胶体成分、缓冲系统、电解质及代谢底物均与停跳前心肌组织所需 一致,有利于复跳后心肌细胞内外离子分布以及酸碱平衡等内环境的迅速恢复。 .制备的过程存在缺血预适应。 冷自体血心脏停搏液的另一独特之处在于其配置过程,液与.液在实 验开始前既已准备完善,其制备过程不涉及动物模型的建立,而冷自体血心脏停搏液 的制备则是组模型建立的一个重要环节,组家兔在暴露主动脉后,抽血时有 的心肌缺血期,在心脏停跳前有短暂的心肌缺血过程,既缺血预适应 ,。年等盼对急性心肌梗死患者实行冠脉手术前施, 率先在临床上证实了的心肌保护作用。目前的研究证明是迄今发现最强的内源 性保护作用瓦,其机制尚不明确。有研究发现,可开放线粒体膜上的通道,这 些通道有敏感性,从而减轻心肌损伤睇’矧。徐竞、刘良明等。州通过实验发现可 通过恢复血管反应性和钙敏感性起到对重要脏器的保护作用。另外参与该保护机制的 可能还有、等蛋白的表达。 .低温灌注。 因本实验中三组停搏液在灌注之前均置于冰屑中先行降温,采用低温灌注,因此 相较于液与.液,冷自体血心脏停搏液在本课题实验中的优势主要体现在 含有自体动脉血和缺血预处理的过程,但其低温的特点在心肌保护中亦具有重要作 用,在此一并加以讨论。心肌的能量消耗主要包括细胞代谢、室壁运动、室壁张力的 维持等组成,前者占%左右,后两者约占%,后两者可因术中心脏停搏而避免,因 遵义医学院硕十学位论文 讨论 此研究的重点就放在如何降低术中细胞代谢水平,低温是目前临床上应用较多的基础 措施,且低温停跳液应用于临床亦有余年。低温对心肌的保护作用有下面几个方面: 一是低温可降低心肌代谢:通过降低温度依赖性酶促反应来减少心肌能量代 谢。另一 方面低温时细胞膜可保持较好的凝胶状态,有利于细胞内外离子交换,保持内环境的 平稳。另外,低温灌注可减少神经系统后遗症的发生啪,’。 结论 遵义医学院硕十学位论文 量皇曼皇舅舅詈皇曼曼曼皇曼曼曼曼皇曼皇量皇曼鼍曼曼曼鼍曼曼曼鼍量曼量曼皇曼皇曼毫舅皇曼皇曼鲁 ..皇曼舅曼鼍曼皇曼曼曼兰皇曼篡 结论 .经缺血一再灌注后,心肌结构会出现一定程度的损伤,心脏停搏液的应用只能 减轻损伤的程度,而不能完全避免。 .冷自体血心脏停搏液能明显减轻离体兔心肌的水肿程度,对心肌显微结构、超 微结构有较好的保护作用,其保护效果优于.液,与液相似。 .冷自体血心脏停搏液对心肌的保护作用机制可能为含有自体动脉血成分、缺血 预处理及低温等。 遵义医学院硕士学似论史 参考文献 参考文献, , .【】】. ?. ,,: 张青,孟保英,彭乐,王涛,马超,陶静.自体冷血停跳液对未成熟心肌保护机 制的研究.临床心血管病杂志,,:. 沈定荣、王涛、张青等.自体冷血心脏停搏液对未成熟心肌?、及细胞 线粒体的影响.中国医药指南,,:. 沈定荣、王涛、张青等.自体冷血心脏停搏液对未成熟心肌细胞及三磷酸腺 苷酶的影响.医学信息,,:?. 孟保英、王涛、沈定荣等.自体冷血心脏停搏液婴儿体外循环心脏直视手术 例.中国当代医药,,:?. 孙绪德,柴伟,高昌俊等.高氧液对家兔心肌缺血/再灌注细胞凋亡的影响.中 国临床康复,,:. . 【】 , , , . 【.,:?, 【】 . :,, :【】.,:. .: , , , 】 . ,,:. , 】 , . 【】. ,,:.李辉、石涵、朱天民等.红豆杉多糖对犬心肌缺血再灌注损伤模 型心肌组织损 伤及超微结构的影响.中华中医药杂志,,:. 瞿勇强,李桢,李树华,赵永和.缺血心肌早期超微结构观察.昆明医学院 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