HPLC法测定赶黄草中没食子酸的含量

HPLC法测定赶黄草中没食子酸的含量 ? 6? 中国中医药咨讯 JournalofChinaTraditionalChineseMedicineInformation 2009年12月第1卷第6期 November2o09Vo1.1No.6 HPLC法测定赶黄草中没食子酸的含量 庄元春何兵池少铃税丕先 (泸州医学院药学院,四川,泸州,646000) 【摘要】目的:建立HPLC测定赶黄草中没食子酸含量的方法.方法:色谱 柱:DikmaKromasilC18柱(250mm×4.6mm, 5m),流动相:甲醇一0.1%磷酸0.1%三乙胺水溶液(1O:9O),检测波长:271nlTl,柱温:30%,流 速:0.8ml/min.结果:没食 子酸在0.07,0.56g范围内具有良好的线性关系(r=0.9999),平均回收率为95.23%,RSD为 1.08%.结论:该方法简便, 准确,可靠,重复性好,可用于赶黄草的质量控制. 【关键词】赶黄草;HPLC;没食子酸 赶黄草又名扯根菜,为虎耳草科扯根菜属植物扯根菜 PenthorumchinesePursh.的干燥全草.《中药大辞典》和《四 川I中药志》均有记载.它具有清热解毒,利尿消炎,活血,平 肝健脾,祛黄疽等功效,主治黄疸,水肿,经闭,血崩,带下,跌 打损伤,多用于各型肝炎,胆囊炎,脂肪肝等病症J.目前赶 黄草主要作为生产治疗各种肝炎制剂(如肝苏颗粒,肝苏胶 肝苏泡腾片等)的原料药材.赶黄草的化学 囊,肝苏口服液, 成分主要为黄酮类,挥发油类,苷类等.其中没食子酸为已知 具有抗乙肝病毒和保肝作用的有效成分j.目前国内文献 作者未见赶黄草中没食子酸的含量测定报道,本实验首次采 用HPLC测定赶黄草中没食子酸含量,以控制其药材的质量. 1仪器与试药 戴安高效液相色谱仪(P680ALPG四元低压梯度泵,PDA 一 100二极管阵列检测器,TCC一100柱温箱,Chromeleon色谱 工作站).CQX25—06超声波清洗器(上海必能信超声有限 公司,功率250W,频率25kHZ).甲醇为色谱纯试剂,其余 试剂均为分析纯,水为重蒸馏水.没食子酸对照品(中国药 品生物制品检定所提供,批号:110831—200302);赶黄草药材 采自四川古蔺罗江村,回龙村,万寿村,经作者鉴定为虎耳草 科植物扯根菜PenthorumchinesePursh.的干燥全草. 2方法与结果 2.1色谱条件色谱柱:DikmaKromasilc】8(250himx4.6 rflm,5”m);流动相:甲醇一0.1%磷酸0.1%三乙胺水溶液 (10:90);检测波长:271llm;流速:0.8ml/min;柱温:30?;进 样量:lOtxl. 2.2溶液的制备 2.2.1对照品溶液取经五氧化二磷减压干燥至恒重的没 食子酸对照品适量,精密称定,加水制成每1ml含28g的 溶液,即得. 2.2.2供试品溶液取本品细粉0.5g,精密加入50ml水,称 定重量,超声处理30rain,放冷,再称定质量,用水补足减失 的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得. 2.3系统适应性试验分别精密吸取对照品溶液和供试品 溶液各10l,注入高效液相色谱仪,色谱图,结果见图 1.从图中可见,没食子酸的保留时问约为8.5min,没食子酸 峰与其前后色谱峰的分离度均大于1.5,拖尾因子为0.96,理 论塔板数以没食子酸峰计为13250. 基金项目:四川省教育厅重点课题基金资助项目(No.07za041) 2.4线性关系考察精分别精密吸取”2.2.1”项下对照品溶 液2.5,5,7.5,1O,15,20l,注入液相色谱仪,按上述色谱条 件测定峰面积,以峰面积值A对进样量C(Ixg)进行回归,得 曲线方程:A=58.8878C一0.2877,r=0.9999,结果表 明没食子酸进样量在0.07—0.56g范围内峰面积与进样量 有良好的线性关系. 2.5精密度试验精密吸取”2.2.1”项下对照品溶液10l~l, 重复进样6次,测得没食子酸峰面积RSD为0.34%(n=6), 表明仪器精密度良好. 2.6稳定性试验取本品的供试品溶液,分别于制备后0,4, 8,12,24,48h进样测定,测得没食子酸峰面积RSD为1.37 %,表明供试品溶液在48h内稳定. 2.7重复性试验取同一批样品6份,照”2.2.2”项下方 法,平行制备6份供试品溶液,分别进样测定,测得没食子酸 平均含量为0.2876%,RSD为0.76%. 2.8回收率试验精密称取已知含量(0.2876%)的本品细 粉9份,每份0.25g,分成3组,每组3份,分别精密添加没食 子酸对照品溶液(0.2206mg/m1)2,3,4m1,照”2.2.2”项下方 法制备供试品溶液,按”2.2.1”项下色谱条件测定,并计算回 收率.结果见表1. 表1赶黄草中没食子酸回收率试验结果(n=9) 试验结果表明,本法具有良好的回收率. 2.9样品含量测定分别精密吸取对照品溶液,供试品溶液 2009年12月第l卷第6期 November20O9V01.1No.6 中国中医药咨讯 JoumalofChinaTraditionalChineseMedicineIrfformati0n?7? 柚皮苷对大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用 邢晓辉朱汉裤陈一敏程玉芳徐江平 (南方医科大学药学院药理学系,广东,广州,510515) 【摘要】目的:观察柚皮苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用.方法:大鼠灌胃柚皮 苷14日,采用栓线法制作 大鼠局灶性脑缺血再关注损伤模型,测定缺血2h再灌注24h脑含水量,脑梗死体积和脑组织 中MDA含量,SOD活性.结果:柚 皮苷可显着降低大鼠缺血再关注损伤侧脑组织含水量,显着缩小脑梗死体积,降低脑组织 MDA含量,提高SOD活性.结论:柚 皮苷对脑缺血再关注损伤具有明显的保护作用,其脑保护机制可能与清除自由基有关. 【关键词】柚皮苷;脑缺血;再灌注损伤;自由基 急性脑梗死的神经元损伤机制是多种因素相互交叉,相 互关联的级联反应过程,设计自由基的生成增多,兴奋性氨基 酸的过度释放,钙离子稳态失衡,炎症介质损伤,基因表达的 改变等,其中自由基连锁反应是脑缺血再灌注损伤的核心病 理环节.自由基清除剂作为脑梗死急性期的治疗方法之一, 已引起人们的关注.柚皮苷(naringin,NG)是从芸香科植物 柚中提取出的一种单体,属于黄酮类化合物….NG具有较 强的清楚自由基抗氧化抗炎动脉粥样硬化细胞保护作 用,流行病学研究表明经常食用柚类能起到良好的保护 血管,预防冠心病的作用,其中可能是由于NG的作用j.鉴 于NG具有抗氧化和抗炎活性,我们认为它在缺血神经损伤 中可能具有一定的保护作用,为探讨柚皮苷单体是否具有脑 保护作用及其保护机制,本试验采用大鼠大脑中动脉栓塞模 型(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)研究大鼠局灶性 脑缺血再灌注时NG对脑组织丙二醛(MDA)含量,超氧化物 歧化酶(SOD)活性,梗死体积和脑水肿的影响. 1材料与方法 1.1材料SD大鼠,体重250,300g,古兼用,安徽医科 大学实验动物中心提供(普通级).术前12h禁食,自由饮 所提供. 1.2动物模型取120只sD大鼠,辛6各半,随机分为5 组;假手术组,模型组,NG低剂量组(1Omg/kg,NG1),NG中 剂量组(20mg/kg,NG2),NG高剂量组(40mg/kg,NG3).Ig 给药,每天1次,连续13d,术前1h再ig给药1次.每组24 只,每组各取造模成功的大鼠8只分别做脑梗死体积测定,脑 含水量测定,MDA和SOD测定.缺血再灌注模型的建立根 据Longa方法改良形成的本实验室方法J:用水合氯醛按 360mg/kg腹腔注射麻醉,颈正中切口,依次分离右颈总动脉, 右颈内,颈外动脉,结扎颈总动脉和颈外动脉,从颈外动脉和 颈内动脉分叉膨大处下方的颈总动脉上剪一小口,将头部圆 钝并经多聚赖氨酸处理的鱼线插入颈内动脉,插入长度以分 叉处计18,20mm,结扎颈内动脉,固定鱼线,缝合(鱼线预留 少许于体外).缺血2h后,固定大鼠,将鱼线抽拉至颈内颈外 动脉分叉处,实现再灌注.假手术组麻醉和手术过程与模型 组相同,分离右侧颈总动脉及颈内外动脉,结扎颈总和颈外动 脉,但不插线.模型成功判断标准以动物出现不能完全伸展 对策前爪或向外侧划圈或向对侧倾倒作为模型成功判断标 准 水.NG为本实验室提取纯化,纯度98.5%,批号050910,1.3脑梗死体积测定在脑缺血2h再灌 注24h后,断头取 MDA测定试剂盒,SOD测定试剂盒由南京建成生物工程研究脑,剔除嗅脑,低位脑干及小脑, 分离左右半脑,取MCAO侧 夺?争?争?寺?争?寺?夺?牛?争?孛???孛?夺?幸?夺?幸?夺?寺?夺?夺?夺?夺?争?牛?寺?夺?夺? 夺?幸?夺?寺?夺?夺?夺-寺?夺?争???争?夺?夺?夺?夺?夺?夺?夺?夺? 各10l,按”2.2.1”项下色谱条件测定,记录没食子酸的峰面 积,并用外标法计算没食子酸的含量. 3讨论 试验中针对配制供试品溶液的不同提取方法(超声,回 流及索氏提取),不同提取溶剂(甲醇,75%甲醇,50%甲醇, 25%甲醇,水和流动相),不同浓度的酸水解(1%盐酸,5%盐 酸,10%盐酸),不同溶剂体积(10,25,50,75,100mL)及不同 提取时间(15,30,45,60rain)分别考察.结果以50ml水不水 解直接超声提取45min含量最高,杂质峰较少.采用二极管 阵列检测器在190—380nm范围内分别扫描对照品,样品溶 液中没食子酸峰的紫外吸收,对照品和样品中的没食子酸分 别在215.3,215.4nm和271.1,271.3nm有最大吸收,由于 215nm处干扰较大,故检测波长选择271nm.在流动相选择 试验中,考察了甲醇一0.1%磷酸溶液(5:95);甲醇一0. 1%冰醋酸溶液(15:85)L4j;乙腈一0.1%磷酸溶液(1: 99)等的不同比例,pH值,流速及柱温.发现其分离效果 均不理想,经摸索筛选采用本实验所用色谱条件为较好,样品 中没食子酸与其他组分色谱峰得到较好分离.没食子酸含量 测定的方法有很多,以紫外分光光度法和高效液相色谱法为 主.赶黄草的有效成分没食子酸含量研究尚未见报道.本实 验采用了HPLC测定产于四川古蔺地区的赶黄草中没食子酸 含量,通过方法学的考察,精密度高,重现性好,可用于赶黄草 药材的质量控制. 参考文献 [1]全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编(下册)[M].第2版. 北京:人民卫生出版社,2000:480. [2]汪洪武,任启生,冯长根等.赶黄草中黄酮提取方法的研究[J]. 中国药学杂志,2002,37 [3]潘国庆,卢永昌,德吉措姆.HPLC测定藏成药七味诃子散中没 食子酸[J].中草药,2006,37 基金项目:广东省科技计划项目中医药现代化重点专项(粤财教[2008]258号)