BCA法蛋白定量[资料]

BCA法蛋白定量[资料] BCA法蛋白定量 1 取干净的96孔板，在每个孔中加入20μL的蛋白标准品或蛋白样品。 2 每个孔中加入100μL BCA工作试剂，轻微震荡混匀30s，用不干胶纸覆盖该 96孔板。 3 37?温育30min。 4 取出96孔板，放冷至室温。 5 上酶标仪上OD562nm的读数。 6 制作标准曲线，根据标准曲线进行蛋白样品浓度的计算。 预处理:电泳前，计算好上样量，上样体积。样品加入1×SDS loading buffer。并于干式恒温加热器100?，煮沸10min。 还原型5×SDS上样缓冲液(0.25mol/L Tris?HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10, SDS，0.5,溴酚蓝，50,甘油)配方如下: 0.5 mol/L Tris?HCl(pH6.8) 2.5mL 二硫叔糖醇(DTT，MW154.5) 0.39g SDS 0.5g 溴酚蓝 0.025 5mL甘油 2. 混匀后，分装于1.5mL离心管中，4?保存。 3.11.3 SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳 开始实验前，先根据待检测抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。装好架子，按照下面配方配制10,的分离胶。在胶上面加入一层无水乙醇，促进胶更好的凝集。待分离胶凝集后，配制4,的浓缩胶，插 入预先准备好的1mm梳子。 10,分离胶和4,浓缩胶配方如下: 10,分离胶(两块胶，10mL) 4,浓缩胶(两块胶，5mL) 超纯水 4.85mL 3.16mL 40,Acr/Bic(37.5:1) 2.5mL 0.5mL 1.5 mol/L Tris?HCl(pH8.8) 2.5mL , 0.5 mol/L Tris?HCl(pH6.8) , 1.26mL 10,SDS 100 l 50 l 10%AP(过硫酸胺) 50 l 25 l TEMED 5 l 5 l 待胶凝集后，上样，电泳。浓缩胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。一般电泳时间在1.5h左右。 (4) 转移 转移就是在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体(膜)上。常见的膜有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用NC膜半干转法。 半干转法特点:即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。 半干转实验条件的选择: 2电流80mA/cm，根据膜面积大小，调整适宜的电流大小。同时按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际进一步调整。 半干转实验操作: A。 滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20min应开始准备工作)。 a) 检查是否有足够的转移缓冲液，没有立即配制。 b) 检查是否有合适大小的滤纸和膜。 c) 将膜泡入甲醇中，约1,2min。再转入转移缓冲液中。 d) 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入转移缓冲液中。 B(转移 a) 在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用三层。 b) 将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些转移缓冲 液到膜上，保持膜的湿润。 c) 将胶剥出，去掉集层胶，小心的移到膜上。 d) 剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。 e) 将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。倒上些转移缓冲液，再铺两张靠胶滤纸。 f) 装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。 g) 转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。 转移后效果的鉴定: A(染胶 用考马斯亮兰染色经脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。 B(染膜 有两类染液选择，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceausred 、Fastgreen FC、 CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的用。但是不可逆的染料，如考马斯亮兰、indiaink、Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于进一步的分析。 (5) 封闭 封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。 常用的封闭液有BSA，脱脂奶粉，casein，gelatin，tween-20等，我们一般用BSA。 在转移结束前配好5%的BSA (TBST溶解)。转移结束后将膜放入脱脂奶粉中封闭(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用。 封闭 4?C 2h或 室温1h。 (6) 孵育一抗 A. 先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。 B. 配好5%的BSA (TBST溶解)，按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀 释， 最好采用梯度稀释。 C. 将稀释好的抗体和膜一起孵育。一般采用室温1h，可根据抗体量和膜上 抗原量适当延长或缩短时间。 注意:为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为标准分子量与一抗同时孵育。 (7) 洗涤 用 TBST洗膜三次，把多余的BSA尽快的洗掉。每次5min。 洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。 (8) 孵育二抗 孵育室温1 h。本实验采用偶联近红外激发光基团抗体，孵育时避光。稀释 比例为1:15000。 (9) 洗涤 用 TBS洗三次，每次5min。整个过程应当避光。洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤。 (10) 膜扫描 将洗好的膜放到近红外扫描系统上扫描，偶联有800的激发基团发绿光，偶联有700的激发基团发红光。