[指导]中药降氮汤对56肾切除大鼠肾小球结缔组织生长因子表达的影响

[指导]中药降氮汤对56肾切除大鼠肾小球结缔组织生长因子达的影响 中药降氮汤对56肾切除大鼠肾小球结缔组织生长因子表达的影响中药降氮汤对5/6肾切除大鼠肾小球结缔组织生长因子表达的影响 更新日期: 12-23 作者:尹莲芳，胡丽华，窦国祥 [摘要]目的:研究中药降氮汤对5/6肾切除肾小球硬化大鼠肾小球结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响，探讨其防治肾小球硬化的作用机制。方法:采用5/6肾切除肾小球硬化大鼠模型，设立假手术组、模型组、氯沙坦组和中药降氮汤组。检测各组大鼠术后12周末血清尿素氮、肌酐及胆固醇水平。光镜及电镜观察第12周肾组织病理变化，并应用免疫组化法检测肾小球内CTGF的表达水平。结果:中药降氮汤组和氯沙坦组较模型组血清尿素氮、肌酐、胆固醇水平明显下降(P<0.01)，两治疗组间比较无显著性差异(P,0.05)。肾脏病理学检查显示,两治疗组肾小球增生硬化程度明显减轻。免疫组化显示两治疗组肾小球内CTGF表达较模型组明显减少(P<0.01)，两治疗组比较无显著性差异(P,0.05)。结论:中药降氮汤可显著抑制5/6肾切除肾小球硬化大鼠肾小球CTGF的过度表达，其防治肾小球 的过度表达有关。硬化的作用机制与抑制CTGF [关键词]中药降氮汤;肾小球硬化;结缔组织生长因子;SD大鼠 肾小球硬化是几乎所有肾脏疾病进展到终末期肾衰的共同通路，及早阻止或逆转肾小球硬化对防治终末期肾衰有重大意义。在肾小球硬化的发病机制中，细胞因子网络始终是人们的研究热点。通过中和或抑制某些细胞因子以阻止促炎症细胞因子网络已成为今后肾脏病治疗的重要方向,近年大量研究显示中药在这一领域有巨大潜力。结缔组织生长因子(CTGF)作为一种新发现的生长因子在转化生长因子β(TGFβ)的诱导下介导TGFβ发挥促进肾小球硬化的作用，其作用日益受到重视[1]。本研究旨在观察中药降氮汤对5/6肾切除肾小球硬化大鼠肾小球CTGF表达的影响，探讨其防治肾小球硬化的 作用机制。 1 材料与方法 1.1 动物模型建立及分组雄性SD大鼠40只，体重(200?20)g，测24 h尿蛋白<10 mg?kg-1?(24 h)-1，由南京军区总医院实验动物中心提供。随机分为假手术组、模型组、氯沙坦组和中药降氮汤组4组，每组10只。假手术组大鼠在1.5%戊巴比妥钠30 mg?kg-1体重腹腔麻醉后暴露双侧肾脏，不予手术切除。其余3组大鼠在麻醉后行右肾切除术，1周后切除左肾上下极各1/3。术后中药降氮汤组大鼠灌服中药煎剂降氮汤10 g?kg-1?d-1，氯沙坦组大鼠灌服氯沙坦水溶液20 mg?kg-1?d-1，模型组与假手术组均灌服等量饮用水。大鼠集体笼养，标准饲料(由本校医学院实验动物中心提供)，自由饮水，观察12周后处死。 1.2 药物试剂及仪器中药降氮汤由黄芪15 g、党参15 g、茯苓10 g、丹参10 g、六月雪15 g和桂枝10 g等组成，由本院药房提供;氯沙坦为杭州默沙东制药有限公司产品;CTGF羊抗人多克隆抗体为美国RD公司产品，SP试剂盒、胃蛋白酶和AEC显色剂均为福州迈新生物公司产品;Techinc RA-XT U.S.A全自动生化仪由本校附属中大医院提供;电镜为本校基础医学院电镜室H600型透射电镜。 1.3 血清生化指标检测术后12周采血，全自动生化分析仪测定血清尿素氮、肌酐、胆固醇水平。 1.4 肾脏病理学检查肾组织经固定、脱水、包埋，切片厚2 μm，HE染色后光镜观察。取1 mm3的肾皮质组织数块，经戊二醛、锇酸固定，乙醇脱水，环氧树酯包埋后超薄切片电镜观察。 1.5 免疫组化方法及评价4 μm肾组织石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，其步骤为:(1)滴加过氧化物酶阻断液室温下孵育20 min,PBS冲洗;(2)加胃蛋白酶37 ?消化20 min，PBS冲洗;(3)滴加非免疫性动物血清，室温下孵育15 min;(4)滴加一抗(1?100)4 ?过夜，阴性对照不加一抗，加PBS缓冲液;(5)PBS冲洗后，滴加生物素标记的二抗，室温下孵育20 min;(6)PBS冲 洗后滴加链霉菌抗生素蛋白过氧化物酶，室温下孵育15 min，PBS冲洗;(7)AEC显色，苏木素复染后封片。染色结果采用半定量分析方法，根据肾小球内阳性染色的深浅与分布定为4级:0级，阴性;+，极少，高倍镜下阳性;2+，少量，散在，低倍镜下阳性;3+，大量，呈片状分布。由两个观察者对每个样本进行盲法评分，每个样本观察40个肾小球，然后取两者的平均值[2]。 1.6 统计学处理统计学处理采用SPSS7.5统计软件，计量资料用x-?s表示，4组间比较采用方差分析，并用Bonferroni法进行组间的两两比较，等级计数资料的比较采用秩和检验。 2 结 果 2.1 血清生化指标5,6肾切除后12周，模型组大鼠血清尿素氮、肌酐、胆固醇水平较两治疗组显著升高(P<0.01),两治疗组之间无显著性差异(P,0.05),见表1。表1 4组大鼠血清尿素氮、肌酐、胆固醇水平(略) 2.2 光镜观察结果模型组肾小球系膜细胞中、重度增生，细胞外基质增多，球囊粘连，大部分肾小球呈局灶节段性硬化，小部分肾小球呈代偿性肥大;肾小管多灶状萎缩，部分肾小管腔内见蛋白管型，肾间质多灶状或弥漫单个核细胞浸润和间质纤维化。两治疗组肾小球系膜轻度增生和基质增多，肾小管间质病变明显减轻。假手术组肾脏形态结构基本正常。 2.3 电镜观察结果模型组大鼠肾小球基底膜不均匀增厚，肾小球系膜和系膜基质中、重度增生，可见增生系膜细胞胞浆插入基底膜以及足突融合(图1 A)。两治疗组肾小球系膜增生程度明显减轻，基底膜及足突大多正常(图1 B、C)。假手术组肾脏超微结构正常(图1D)。 2.4 免疫组化检测结果模型组肾小球内有大片红色CTGF染色颗粒，主要位于肾小球系膜及系膜基质，肾小管间质纤维化区域亦有表达(图2 A)。两治疗组肾小球内有散在CTGF表达(图2 B、C)，较模型组表达量显著减少(P,0.01)，两治疗组之间表达无显著性差异(P,0.05)。假手术组肾小球内CTGF有微弱表达(图2 D)。免 疫组化半定量分析结果见表2。表2 4组大鼠肾小球内CTGF的表达 结果