大肠杆菌热敏肠毒素B亚基的原核表达及其免疫增强作用的探讨

大肠杆菌热敏肠毒素B亚基的原核表达及其免疫增强作用的探讨 大肠杆菌热敏肠毒素 B 亚基的原核表达 及其免疫增强作用的探讨 12, 王会 何孔旺 (1.山东省枣庄市畜牧兽医局，枣庄 277100;2.江苏省农科院兽医研究所，南京 210014) 摘 要:从大肠杆菌 K88,LT+ ,ST+,菌株中扩增热敏肠毒素B 亚基基因,得到 454bp的片段 ,AT 克 隆后,定向连接到 pET32a(+ )中,并转化入大肠杆菌 BL21(code upsl),通过 IPTG 30?诱导,表达了重 组的 LTB。SDS- PAGE电泳显示 ,其分子量约为34 KD 左右,主要存在于包涵体中,且复性后保留部 分生物学活性。动物实验证明 LTB 与 CpG 共同作用,可显著增强豚鼠对口蹄疫疫苗的免疫反应。 关键词:LTB 基因,原核表达,细菌 CpG,口蹄疫,免疫增强作用 DOI:10,3969/J.ISSN,1671-6027,2011,06.008 大肠杆菌热敏肠毒 素 (Escherichia co li 菌热敏肠毒素(LT)的基因序列，选用 LT 基因 3' 端 抗原性较强的 128 个氨基酸，包括LT B 全基因heat- 1abie enterotoxn，T) 是 ETEC的毒力 因子之 liL (ORF:864:1299，共 436bp)，自行设计一对引物。 一，也是迄今为止已知的最强的黏膜免疫原和黏膜 免疫佐剂，但由于它具有强烈的致腹泻毒性限制了煮沸法制备大肠杆菌P，CR 扩增目的基因，预 它的应用。LT 由一个 A 亚基 (LTA) 和 5 个 B 亚基 计扩增片段长度为 454bp。(LTB)组成。LTA 是其毒素活性中心;而LT B 是其免 P1:5'- CGCGAATTCATGAATAAAGTAAAATG - 3' 疫原性中心，无毒性，并且单独的LT B 亦具有免疫 EcoR I佐剂活性。本实验构建pE T32a/LTB原核表达质粒， P2:5'- AAGGTCGACTTAGTATAAGTACAGTA - 3'表达重组 LTB 蛋白，不仅可用于亚单位疫苗研制， 还可以进行黏膜免疫佐剂的研究。 Sal I PCR 产物双酶切回收后定向克隆至 pMD 18- T 1 与方法 载体，转化 DH5 感受态细胞，碱裂解法提取质α 1.1 菌株与质粒粒 后双酶切鉴定，阳性质粒命名为p MD 18/LTB。 大 肠 杆 菌 K88 (LT+，ST+) 株 ，DH5α，BL211.3.2 重组表达质粒 pET32a/LTB的构 建 从阳性 (code plus)，原核表达质粒 pET32a、细菌 CpG DNA克隆质粒 pMD18/LTB 上切下 LTB 目的基因，与表 均由江苏省农业科学院兽医所保存。达载体 pET32a 连接，转化入 BL21(code plus)。阳 性质粒命名为 pET/LTB。 1.2 主要试剂 1.4 重组蛋白的 Western-b lot 及纯化、鉴定引物由上海捷倍斯(Genebsae)公司合成;HRP 1.4.1 Western-b lot 纯化的 LT 蛋白免疫兔制备的 标记的羊抗兔 IgG，DAB 显色试剂盒(武汉博士德生 多抗为一抗，HRP 标记的羊抗兔 IgG 为二抗，DAB 物工程有限公司);GM1(Sigma);兔源抗 CTB 抗体 显色试剂盒显色。 (Sigma);His.Bind Purification Kit 购 自 Novagen公 1.4.3 LTB 生物学活性的鉴定 利用 GM1- 酶联 司;免疫用 O 型口蹄疫灭活抗原由新疆天康生物制 - 6.5免疫吸附 (ELISA) 方法测定纯化复性后的 LTB 与 品有限公司生产车间提供(乳鼠L D50=10)。 GM1 的结合能力。 1.3 LTB 的原核表达 1.5 免疫增强作用的探讨1.3.1 PCR 及 AT 克隆 按照 GenBank中大肠 杆 1.5.1 动物免疫及样本采集 体重 300g 左右的豚 鼠 (由新疆天康生物制品有限公司提供60) 只，随 作者简介:王会,1980:,,山东枣庄人,硕士,兽 机分成 6 组，10 只 / 组。按常规方法饲养数日后， 医师,主要从事畜禽传染病预防免疫。 分组进行免疫接种，采用后腿肌肉多点注射:第? 试 验 研 究 pET32a/L TB 的诱导表达2.3 重组质粒 组为空白对照组;第?组为抗原组;第?组为白油 佐剂组;第?组为 LTB 组;第?组为 CpG 组;第? SDS- PAGE电泳结果表明诱导前 的重组菌、 组 LTB+ CpG 组。第?、?、?、?组补充生理盐水 pET32a和 空 BL21 均没有 34KD 左右的条带出现， 至 2mL，以保证接种体积的一致。首免后第4 周加 而含有目的基因的菌株在诱导后有明显的特异性强免疫一次。免疫前及免疫后每周随机取 3 只豚鼠 条带出现，其分子量约为 34KD 左右(如图 3)。使用 心脏采血分离血清，进行血清抗体滴度和中和抗体 Smartvew 软件分析表明，重组 LTB 的表达量 i的检测。 占菌体总蛋白的 10%左右。 1.5.2 抗体滴度检测 VP1 结构蛋白抗体酶联免 疫吸附试验检测豚鼠血清中 O 型口蹄疫抗体效价。 2 结果与分析 2.1 目的基因的 PCR 扩增及 T- 载体的克隆 PCR扩增的 ltb 基因片段为 454bp，与预期长度 一致;将其连入 pMD 18- T 载体后酶切鉴定结果为 阳性。(如图 1) 1:诱导前全菌 2:pET32a 诱导 3:BL21 诱导 4，5:诱导后 3h、4h 全菌 6:中分子量标准蛋白 图 3:载体、宿主菌与表达产物的SDS -PAGE 2.4 免疫转印 对表达蛋白进行 Westernb- lotting 鉴定，结果融 合蛋白可于兔抗 LT 抗血清发生反应，说明表达蛋 白具有抗原性(图4 )。 1:pMD18-T 酶切产物 2:pMD18-T/LTB 酶切产物 3:DL-2000 Marker 图 1:pMD 18/LTB 酶切产物 2.2 重组质粒 pET32a/L TB 的构建 1、中分子量标准蛋白 2、诱导前的全菌蛋白 3、4、诱导 双酶切 pET32a/LTB重组表达质粒，琼脂糖凝 3h，4h 后 LTB 融合蛋白 5、诱导前的全菌蛋白的免疫转印 6，7 诱导 3h，4h 后 LTB 融合蛋白的免疫转印 胶电泳上可清晰的看到 454bp大 小的目的条带，表 图 4: 融合蛋白免疫转印鉴定图 明 pET32a/LTB重组表达质粒构建成 功(如图2 )。 2.5 生物学活性检测 LTB 的免疫增强功能是因为其形成的五聚体 具有与神经节昔脂 GM1 的结合能力，而在热变性 条件下，可使五聚体解聚而丧失与 GM1的结合能 力。因此，鉴定融合蛋白LT B/Trx A 是否保留了与 GMl 结合能力是很必要的。GM1- ELISA 分析表明， 复性后的融合蛋白(rLTB)保留了部分与 GM1 结合 活性，而同一浓度的样品在经过加热处理后(rLTB (B))，其与 GMl 结合能力几乎丧失，这是因为热处理 使 CTB/Trx A 五聚体解聚的原因。作为阳性对照， 1:EcoR?和 Sal?双酶切 pET32a/LTB 2:EcoR ? K88 菌的培养上清中含有天然的 LTB 蛋白，与 GM1 和 Sal?双酶切 pET32a 3:DL-2000 Marker 图 2:重组质粒 pET32a/LTB的酶切鉴定 具有高亲和力。而单纯的载体蛋白(Trx A)与 GM1 基本无结合能力(图 5)。 图 7:免疫豚鼠中和抗体水平变化 高水平，与白油组差异极显著(p,0.01)。图 5: 复性后 LTB 融合蛋白生物学活性检测结果 2.6 血清抗体水平动态变化 3 讨 论 由图 6 可见，各免疫组的血清抗体校价均明显 LTB 与霍乱毒素 B 亚基(CTB)在功能、结构和免 高于空白对照组和单独抗原组。前五组首免后第 1 疫原性上都有相似性，它们氨基酸的同源性为 周基本没有产生抗体，第 2 周才开始有微弱反应， 80%。不同的是编码 CT 的基因位于染色体 DNA 上, 其中 CpG组 OD 值最高，可达到 0.367。而 LTB+CpG而编码 LT 的基因是在质粒上，并且调节二者合成 组免后第 1 周抗体 OD 值就已达到 0.395。单独的的启动子也不相同。霍乱肠毒素B 亚单位(CTB)一直 LTB 抗体水平与传统的白油佐剂组相差不大，且前 是较为公认的粘膜免疫佐剂，但近年文献报道重组3 周的抗体水平低于油佐剂组，第四周后则稍高于 CTB 与抗原混合后刺激产生 S- IgA 能力弱或无，但 油佐剂组。CpG 组除第四周外抗体水平均高于油佐 作为皮下免疫佐剂刺激产生血清 S- IgG 作用较强。 剂组，两组差异不显著(p,0.05)。LTB+CpG 组在整 目前已有研究成功将 CTB 用在口蹄疫的免疫上。而 个监测过程中，抗体产生最快，且抗体水平一直明 LTB 则用在人流感病毒上的研究比较多，用于口蹄 显高于其余各组，差异显著(p,0.05)。 疫的免疫尚属少见。 另报道提示，LTB 有复杂的免疫调节功能, 如 LTB 除具有与 LT 相似的黏膜佐剂活性外，还具有 免疫抑制作用，从而用于某些自身免疫病的防治。 其具体功能的发挥可能与 LTB 作用的途径有关。当 LTB 以黏膜途径与外来抗原共免疫时，发挥黏膜佐 剂作用, 而当 LTB 直接与脾细胞作用时, 则发挥免疫 抑制作用。关于这两种相反作用的机制，我们推测可 能是 LTB 对黏膜淋巴细胞和脾淋巴细胞上的 GM1 受体有不同的作用，从而激发了两种不同的信号通路, 图 6:免疫豚鼠血清抗体水平比较 分别导致促进免疫应答和抑制免疫应答的细胞因子 2.5 中和抗体水平动态变化 的分泌。至于其具体的调节通路还有待于进一步深入 研究。但可以肯定的是，由于LT B 兼有黏膜免疫佐剂 按照 Reed- Muenc方法计算血清h 对 BHK- 21 和免疫抑制两种免疫调节功能，这将为新型黏膜疫苗 细胞的半数保护量 PD50。结果以 IgPD50 的绝对值 的研制及移植排斥和细胞毒性T 细胞介导的自身免 为纵坐标，以免疫周数为横坐标作图(图7) 。结果可 疫病的防治提供新的思路，也为LT B 在医学和生物学 见，空白对照组始终未检测到任何抗体A;g 组中和 中的应用提供了一定的实验依据。 抗体水平达到最高时 IgPD50的绝对值 为 1.28，即 (参考文献从略)血清 1:19 稀释后可保护 50%的细胞;单独的 LTB 组 中 和抗体整体水平低于白油组 ;CpG 组 和 LTB+CpG 组初免后中和抗体水平最高，但 CpG 组 在第 4 周抗体水平骤降;LTB+CpG 组则一直保持较