【doc】单核细胞及中性粒细胞与内皮细胞粘附的区别

【doc】单核细胞及中性粒细胞与内皮细胞粘附的区别 单核细胞及中性粒细胞与内皮细胞粘附的 区别 己 ISSN1007-3949ChinJArte,rio6eler,Vol7,No3 单核细胞及中性粒细胞与内皮细胞粘附的区别 黎健逊塑三.注钟. (首都压科大学药理学教研室,北京1tx~54) / 主墨饲内皮细胞;单楮细胞;中.陛粒细胞 3}? 竺里;肿瘤坏死因子一n;细胞问粘附分子一l;E一选择素;血 管细胞粘附分子一1. 摘要为探讨单棱细胞度中性粒细胞与肿瘤坏死因子一2谤导的内皮细胞粘附的医刺,采用髓过氧化酶法洲定白细胞与 内皮细胞的粘附和抗粘附分子单克隆抗俸对其粘附的影响,用酶联免疫法测定内皮细胞粘附分子的选.蛄秉表明,肿瘤坏 死因子一n呈浓度依袖?陆地增加内皮细胞与中性杜细胞或单棱细胞的粘附,并可请导内皮细胞上粘附分子的表选增加.肿瘤 坏死因子一n激活内皮细胞后6小时,与中性粒细胞的粘附率最高,而激活后斟小时,与单楮细胞的粘附率曩高.抗细胞问粘 附分子-1及抗E一选择素单克隆抗体可显着抑制中性粒细胞与肿瘤杯:.巳固子一n激活的内皮细胞的粘附,而抗细胞阃粘附 分子一l及抗血管细胞粘附分子一1单克隆抗体蔓l可押制单.棱细胞与肿瘤杯:.巳因子一n激活的内皮细胞的粘附.蛄果提示, 两种类型的白细胞与肿瘤坏死因子一n谤导的内皮细胞的粘附具有不同的特点. 111eDi撇Betweenn-曲IheIiaI—M0n0andldI吣ial—N'lh吼 Y0ngUJian,SI/Ns0一sanand咖 (凸,劬um玷1田,,凸f凸l岍:胁&如啪,&100054,c抽w) Mes?EIl岫hdiaI;cdh;M?-巧;Ne恤ophj;Adhe?B;T咄?瑚iBfh—n;眦e?Id盯^d陆e锄Mde- eale一1;E—Selec~n;v删Id肛Ce?A血Mdeclde一1 AlIs]限AcrA劬Tom由the赶f??bdwe?岫h'山—m0nD呻and衄dD一删血.pbi】a0n, ltc]l~onw鼬m明bytel血gcyIe叫|e10p旺id暗eac,tlIeeelladl棚edby啪cloI1日l蚰dbodi酋l0ICAN一1,E 一 魁kc血andVcAM一1,the—e邛憾he衄咖kd鹧w鼬mI姗埘.d?眦,Req血s肿一n(1111—1000b1几)in. cII璐edtlIeadlofECtO帕衄山口?哪c伸o0m咀l0ll—depe瞰断.Tbe哝坦日ed矾ICAN一1,E一魁n 胁dVCAM一1w鼬c衄?ibuto肿一n?D.d11pI1】a6衄of】a】koqe一曲d0d-al如.1he帕lh叩l一曲dD【bdhe衄 砌砒6hafterT?盯一nmL山ofendo蛐al,whilem嘶oc一d吐b芒adI*w鼬丑t24h.Tbem饵d. to一1andE一caII【lyiITNF—ninduced衄dD一帕ll,ver山d圈s,the虮岫tO VCAM一1I1日d?effee~0n础蛐曲aI一DbiladI叨l0llotherh?ld,the丑I吐击od'啷tOICAM一1VCAM一1bI吐埘theanti. b0由tOE—selee~i.t]ibitedTNF—ninc衄dD一咖c0"?l曲land啪cBI-diI PJ衄te凼csinadhe?tOTNF—nindI】D曲d亡cd1日. 白细胞特别是单核细胞进入动脉血管壁吞噬脂 质后转化为泡沫细胞是动脉粥样硬化的早期病理变 化,而白细胞与内皮细胞的粘附是白细胞进入血管 壁的第一步,所以白细胞与内皮细胞的粘附与动脉 粥样硬化的发生,发展关系密切J.机体在正常状 态下,白细胞与内皮细胞的粘附非常少,缺血再灌注 等炎症反应可引起白细胞及内皮细胞释放肿瘤坏死 因子一a(nlIn口rI.cI?i8factor—a,.IT一a),白细胞介 紊一1等细胞因子J,这些细胞因子反过来又刺激内 皮细胞,增加其与白细胞的粘附.白细胞与内皮细 胞的粘附主要由内皮细胞上的细胞间粘附分子一1 ?卫生部老年医学研究所生化室 ?中国医学科学院基础医学研究所 (in懈lular8d~leeule一1,W_AN一1),E一选 择紊(E一目dtil1)及血管细胞粘附分子一1(vasc—ar celladhe8immdee~le一1,vc^M一1)介导,而抗粘附 分子单克隆抗体是研究细胞一细胞粘附特点的最常 用手段.单核细胞及中性粒细胞是外周血中参与炎 症反应的重要细胞,它们与内皮细胞的粘附有何差 别值得探讨. 1材料与 1.1材料 人脐带(北京医院产科新生儿).人血(北京医 院健康自愿者).M199培养基,胎牛血清,纤维连接 蛋白,胶原酶(II型),胰酶,Hepes(cibc0产品).鼠 抗人ICAN一1单克隆抗体,鼠抗人vc^M一1单克隆 cN43—1153/R中国动脉硬化杂志1999年第7卷第3期 抗体,辣根过氯化酶(imp)标记的兔抗鼠单克隆抗 体(4L京中山生物公司).鼠抗人E—sel血单克膳 抗体(Rdsy~m).十六烷基三甲基澳化铵(瑚B) (北京西中化工厂).邻联茴香胺(Dimlsidin)(nu. h),加ItCt溶解后,用pH6.0的PBS稀释至所需浓 度,再用I~laOH调pH至6.0. 1.2人脐静脉内皮细胞的培养 将约8mL0.1%的胶原酶(用PI]S配制)注入25 eln左右的脐静脉,干室温下消化20—30rain,离心 (800r/rain,8mln).加5mLM199培养液(含100m L内皮细胞生长因子),种入铺有纤维连接蛋白的培 养瓶内,置co2孵育箱培养,传2代后进行实验. 1,3白细胞的分离 在枸椽馥钠抗凝血中加入终浓度为0.6%的 6%右旋糖苷(Dexl~T5CO),在37?木浴中静置30 mln,使红细胞沉淀.将上层白细胞加入3mL淋巴 细胞分离痕中(比重1,077),离心(2000r/rr~,30 rain)后,中层为单核细胞,底层为中性粒细胞,将它 们分别取出,中性粒细胞内加入1mL双蒸木溶血30 B,使混杂的红细胞破膜,再加入2xPBS1mL,混匀, 使中性粒细胞恢复等渗状态,离心(800dmin,10 rain)两种白细胞均用PBS洗3次.离心(800r/rain, 10rain),用M199培养基将白细胞数调至5x1细 胞,L. 1.4白细胞与内皮细胞粘附的测定" 将内皮细胞接种干96孔扳,每孔3xlO'细胞, 24h后换液一次,与不同浓度TNF—a(0,100,300, 500和1000kIl,L)孵育一定时闻,然后加入100人 外周血单梭细胞或中性粒细胞,孵育30rain,用100 止PItS洗孔3次,以洗去耒粘附的白细胞.每孔加 0,5%ItTAB(用pH6.0的PBS配制)5O,37?放 置30rain,加入含0.4mmol/L02的0.63mmol的 Dimisidin2OO止,37?显色7rain,450m测光暧收 度(A).抗粘附分子单克隆抗体干1一口激活内 皮细胞后6h加入,终浓度为10L.37?孵育? rain后再加入白细胞. 1.5酶联免疫法测定内皮细胞表面粘耐分子 接种内皮细胞于96孔板,每孔3xlo'细胞,24 h后换裹一次,与不同浓度TNF—a(0,50,100,2C0, 500和1000ku/L)孵育6h后加1%多秉甲醛100 止,固定30rain,用PI]S洗3次,加入1:100稀释的鼠 抗人ICAN一1(或~CAM一1,Eselec血)单克隆抗体 50flL,37?孵育30rmn,控干,用含0.05%Tweaa20 的PBS冼3次,加入1:500稀释的imp标记的兔抗 ,鼠单克隆抗体5o,37?反应30mln.用含 Twee~20的PBS洗3次,加入100止0.04%邻苯二胺 (pH5.0),37?反应20rain,加终止裹5o(浓硫磺 20mL,水160mL),490I血测光暧收度().空白 对照蛆不加鼠抗人IcAM一1(或~CAM一1,E一3山c一 血)单克膳抗体. 1,6统计学 数据以4-s表示,采用f检验分析蛆闻均截的 差异性. 2结果 2.1肿瘤坏死因子一a诱导的内皮细臆与白细臆的 粘耐 从图1(Fj孵1)可见,未被TNF一口激活的内皮 细胞与中性粒细胞或单核细胞的粘附率很低,450 lira光吸收度分别为0.2684-0.11和0.2964-0.12,而 随着TNF一口浓度的增加,内皮细胞与中性粒细臆或 单核细胞的粘附也增加(P<0.05,P<0.01).TNF 一 口为500ku/L时,粘附的白细胞数约为静息状态的 3倍. 1? 三0. O O Ta.口.1c0r-ti绷0'L) 圈1.TNF_n对内皮蛔奠与中性粒蛔奠或簟棱蛔奠轱耐的 影响 岫1,嗽脚m目幽岫bm nH.odk讪T肌 h6h,?讪m??帅h如I'h?d 曲瞳哪靴珂唧鼬棚由(?''n. 7).:<O.?,*:P(0.01,州伽啊簟啦 F 2.2内皮细胞裹面粘尉分子的裹达 从图2(1m2)可见,静息状态的内皮细胞表 面即有IcA^I一1的表达(A哪为0,266?0.03),随 1M—a剂量增加其表达也增加,但1M—a浓度大 于100lagL时,ICAN一1的表达进一步增加不明显. 静息状态的内皮细胞表面无E一8elec豳的表达(A ' 246ISSN1007-3949ChinJArteric6c|er.Vol7,No3 为0.11?O.01),与无相关抗体对照组相同.TNF一13[ 刺激4h可诱导E一选择索表达,其表达量随TNF— n的浓度增加而增加.未激活的内皮细胞表面几乎 没有VcAM一1的表达(A为0.142?O.017),加入 TNF—al2h,其表达显着增加. IItFnGoncentr自tioncku几) 囝2.~oe/.对内皮细胞粘附分子表达的影响 琦矾2E呦西哪彻d0th删.e?sapr茁 a蕾吲i皿舶0I性I惦.Bdc日呲日dB神1T口f?6 h.m?出m吣c?,n=7):P<0 01,o口?wilh?pc她呷 2.3内皮细胞与自细胞粘附的时效关系 内皮细胞被肿瘤坏死因子一a激活2h后,其与 中性粒细胞的粘附开始增加,6h粘附率最高(A为 O.765?0.13),粘附率比静息状态增加了185.跎%, 24h时有所下降.但仍显着高于未激活的内皮细胞 与中性粒细胞或单核细胞的粘附(P<0.01).TNF — 激活内皮细胞后6h,单核细胞与其粘附率与中 性粒细胞相似,激活后24h,单核细胞的粘附不但没 有下降反而有所增加(P<0.01)(图3,FlIe3). 2.4抗粘附分子单克隆抗体对白细胞与内皮细胞 粘附的影响 抗IcAM—l单克隆抗体及抗E—seleetin单克隆 抗体可显着抑制中性粒细胞与TNF—n激活的内皮 细胞的粘附(P<0.01),抑制率分别为43.79%和 46.41%,而抗VC~/Vl一1单克隆抗体对其粘附则无 影响.相反,抗ICAN一1单克隆抗体及抗v0一l 单克隆抗体则可抑制单棱细胞与TNF—a激活的内 皮细胞的粘附(P<O.O5).抑制率分别为26.73%和 24.18%,而抗E一8eleetin单克隆抗体的作用却不明 显(图4,Figure4). 10 08 三 >08 { 0.4 O2 0 HeutroDh 圈3.中性粒纲胞或单核钢臆与哪.a诱导的内皮耆田臆粘 附的时效美系 岫3.恤一蜘??西m呻口m咖 H啦协T陋?甜啊锄由lbdI丑lo曲.bd0Ibd1日I 恤叽山TTfor蠡?of.印神 玳吐【q舡m岫肫曙/or311._IItu吐m曲眦归聊 t叫d0pdue可f?5?n=7)f:P<0-Ol?陬. ped砒.Dl"叩叩由?口【呷 口Control 1 1 . 墨 {0 O 0. 0 Neutr叩hiIonocyt0 匿4.抗粘附分子单克吐抗体对中性粒纲胞或单核纲赡与 T陋?诱导的内皮纲胞粘附的影响 两re4.珊ed西m咖俄I棚期问础嚣雌血融曲瞄呻 mec鹪哪T锺.?IlIh如西毪dolhE眦岫 舶d0|hdl_l—m岫唧.eH位【1B黼叫讪 /or6hI叫b曲神di托m?眦l叫卸b0{20 . Fu'~llymh呼I山吐mn衄dedddIlh31). 艏l?.茁1啪叼恤byr州叩d辩哼( ?,=71.:P<0.05.**:P<0O1.咖椭艚 ?d吨?口【. 3讨论 肿瘤坏死因子一n可浓度依赖性地增加内皮细 cN43—1153/R中国动脉硬化杂志1999年第7卷第3期 胞与中性粒细胞及单核细胞的粘附,推测其是通过 诱导内皮细胞表面细胞间粘附分子一1,E—seleetin 及血管细胞粘附分子一1的表达而促进上述粘附 的.单核细胞与内皮细胞的粘附较中性粒细胞与内 皮细胞的粘附略多.中性粒细胞与内皮细胞的粘附 在肿瘤坏死因子一n激活内皮细胞后6h多于24h. 而单核细胞与内皮细胞的粘附在肿瘤坏死因子一a 激活内皮细胞后24h多于6h,这与在急性炎症中主 要是中性粒细胞的着边(珈0n)增强,而在慢性 炎症中则更多地是单核细胞与微血管的相互作用 相符.由于本实验为体外实验,受观察时间限制.只 观察了24h,所以在急,慢性炎症中,这种不同类型 白细胞的功能差别还表现得不够明显. 抗细胞间粘附分子一1单克隆抗体,抗E一吕e. 1ectin单克隆抗体和抗血管细胞粘附分子一l单克隆 抗体可抑制白细胞与肿瘤坏死因子一a激活的内皮 细胞粘附,提示这三种粘附分子介导了肿瘤坏死因 子一n诱导的内皮细胞与白细胞的粘附.有趣的 是,抗E一~_leetin单克隆抗体对单核细胞与内皮细 胞的粘附作用不明显,抗血管细胞粘附分子一1单 克隆抗体对中性粒细胞与内皮细胞的粘附则无影 响.后一种情况是因为血管细胞粘附分子一1的配 体为VIA一4,已知VLA一4只表达于单核细胞及 淋巴细胞,不表达于中性粒细胞.前一种情况也可 能是由于类似的原因,但因E—seleetin的配体尚未 阐明,所以无法确定是否是由于单核细胞上无E — sdeetin的配体所致.另一种可能性是这种抗E— sde~.in单克隆抗体与E—sdeetin结合后,并不影响 其与单核细胞上配体的结台.有报道认为抗E一 leetin单克隆抗体可抑制单核细胞系0937细胞与肿 瘤坏死因子一n激活的内皮细胞粘附.U9"细胞与 单核细胞上的E一~_leetin配体是否有区别尚待阐 明. 参考文献 1o'IlriLTtKI).如.Io,ChairA.?髓阳旺??E一 鹫k曲,ink"l1日r-?1~ooJile一1,mtvaBeullr础a亚岫 me一1illh_卫TmnIr?rBmt岫r岫幻t_lh_ cyte伽吐.凸t.1996,好:572一醴2 2Pi咖嘲A.F,w.E胁a?删皿撕 lId嘶曲cell6vi乜D.,.1994. 36:ttg74一胂 3岛日1IDG,.BPh.aAM,矗.CD】1,cD18础田r6睇 Bd?眦pl岫:肼I?en舶.fII喊_岫目? in?山_啪.脚如,1辨1,1,':蛳一搅 4KBdrR?王(且r盯骂.K~lllF.矗a1.E憎???dlea曲n ?m罄in曲ldi船q出n.1e甲峨删kb,? -.如,1螂.犯:576一姗 5K?R?Km越旧.IS,KqIF.血'轴n?d吐im?凸e. ?ind?h..1螂.龆:5"75 — 586 6FcA.Vc^^I一1,一口4一i曲神?叽I? 恤耐妇咄naH瑚iI'7,?d啊.』^妇a帕, 1996,螺:S啪一S7 7Nd.皿RM.咖d-s.^A.扣一|舡l由di_日d- ldB妇E—e曲.』a爆}.1993,,l:115"7—1酯 (19—06一o7收到,1999—0B—o1酱回) (此文编辑朱雯曩) 首届全国防治动脉硬化性疾病学术研讨会征文 中国动脉硬化杂志编辑部原与南方科技学术交流中心联合举办的《首届全国防治动脉硬化性疾病学术 研讨会》,因故改为由我刊编辑部单独举办.现将有关事项通知如下: 一 ,征文内客:凡有关动脉硬化性疾病(见本期(《中国动脉硬化杂志》报道的疾病和手术名称)一文)的预 防和诊治论文.如实验研究,临床经验,病调报道,病理讨论,饮食营养,流行病学调查等,都J-征文范围; 二,论文一律参照我刊《临床经验》一拦的格式写.一般在30110,4O00字内.不要插图; 三,来稿请盖单位公章,寄全文2份和200字摘要1份,并注胡会议征文; 四,会议暂定1999年l1月在衡阳医学院学术厅召开,具体时间另行通知来稿者; 五,会议时间,将邀请我刊编委作学术讲座.并就论文审稿事项当面答复授稿人; 六,学术研讨会后,我刊将选编出版《中国动脉硬化杂志》临床论文专辑; 七,征文截止日期:1999年9月30日; 八,来稿请寄:湖南省街阳市?衡阳医学院内中国动脉硬化杂志编辑部,邮政编码:421111)1. 中国动脉硬化杂志螭辑部