猪链球菌2型与猪肠上皮细胞IPEC-J2的粘附性研究

猪链球菌2型与猪肠上皮细胞IPEC-J2的粘附性研究 猪链球菌 2 型与猪肠上皮细胞 IPEC-J2 的粘 附性研究 庾庆华，胡唯伟，朱立麒，杨光远，杨倩 5 (南京农业大学动物医学院，南京，210095) 摘要:猪链球菌 2 型(SS2) 是重要的人畜共患病病原体，本研究通过链球菌 2 型与猪肠上皮 细胞(IPEC-J2)的相互作用，探究猪链球菌 2 型粘附入侵肠上皮细胞的机制。试验结果表 明 SS2 9801 可以粘附并侵袭猪肠上皮细胞(IPEC-J2)，且在侵袭过程中破坏细胞骨架蛋白， 型的入侵和粘附性产生拮抗作用。本试验提示肠 而嗜酸乳杆菌 ATCC 4356 会对猪链球菌 210 黏膜也是 SS2 感染机体的重要途径之一。 关键词:猪链球菌 2 型;肠上皮细胞;嗜酸乳杆菌 ATCC4356 中图分类号:S855.1 Investigation of the Invasion of Streptococcus suis serotype 2 15 to Porcine Jejunum Epithelial Cell line IPEC-J2 Yu Qinghua, Hu Weiwei, Zhu Liqi, Yang Guangyuan, Yang Qian (Veterinary College,Nanjing Agricultural University) Abstract: Streptococcus suis serotype 2 (SS2) is an important zoonotic pathogens, the investigation of studying interaction between SS2 and porcine jejunum epithelial cell line 20 (IPEC-J2) was aimed to explore the mechanism of SS2 adhering and invading to the IPEC-J2. The results showed that SS2 9801 could invade and adhere to IPEC-J2, while damaging the normal construction of microfilament, however the L. acidophilus ATCC 4356 functions as an opponent to resist Streptococcus suis type 2 about its invading and attaching to IPEC-J2. The investigation indicates possibility of that invading intestinal mucosa is also an important function path for SS2 25 to infect the body. Key s: Streptococcus suis serotype 2; Porcine Jejunum Epithelial Cell line; L. acidophilus ATCC 4356 0 引言 30 猪链球菌是重要的人畜共患病病原之一，主要引起脑膜炎、心膜炎、关节炎、败血症和 肺炎等症状，血清型有35种，其中猪链球菌血清2型是最常见的病原型[1]。目前研究发现， 当猪链球菌进入血液循环后，在血管内皮富集，在脑部时，当细菌浓度达到107/mL时，猪链 球菌可通过侵染血管内皮细胞并穿过，并且接着入侵血管周围的神经胶质细胞，破坏血脑屏 障进入脑部引起脑膜炎[2]。针对猪链球菌穿过内皮细胞的机制，本研究选取IPEC-J2作为研 35 究对象，IPEC-J2 细胞系(Porcine Jejunum Epithelial Cell line, IPEC-J2)是分离于新生仔猪 空肠, 经过驯化形成的一种传代细胞系，因为小肠上皮细胞系同属于内皮细胞，并且目前猪 链球菌就如何入侵机体进入血液的机制尚不明确，本研究的研究对象小肠上皮细胞属消化系 统途径，可在阐述猪链球菌如何入侵小肠上皮细胞的同时提供数据为研究猪链球菌从消化道 基金项目:高校博士新教师基金(20100097120007) 作者简介:庾庆华，1981 年 12 月，男，副教授，微生物与上皮细胞的相互作用. yuqinghua1981@163.com -1- 小肠部入侵的假说提供参考。嗜酸乳杆菌ATCC 4356是人类和动物肠道中一种正常的优势有 40 益菌，具有拮抗多种病原菌的作用，如致病大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌和志贺氏菌等[3]。 本实验加入嗜酸乳杆菌ATCC 4356之后与猪链球菌2型共同作用于IPEC-J2细胞，观察是否有 拮抗猪链球菌2型侵袭粘附细胞的作用。 1 材料与 45 1.1 材料 本实验选用的猪链球菌 SS2 由南京农业大学动物医学院微生物组姚火春教授赠送，嗜 酸乳杆菌 ATCC 4356 购自 ATCC。猪链球菌 SS2 筛选培养基，为含有 100μ g/mL 的庆大霉 素的 THB 培养基。MARS 用于培养嗜酸乳杆菌 ATCC 4356。 1.2 细菌交叉培养 50 通过在 THB 培养基上接种嗜酸乳杆菌 ATCC 4356，在 MRS 培养基上接种 SS2 9801， 交叉培养，并菌落数，检测细菌的生长状态和对培养基的选择性要求。 1.3 细胞培养 IPEC-J2 细胞于含有 10 % 的胎牛血清和双抗(青霉素、链霉素浓度均为 100 U /mL)的 DMEM 细胞培养液中培养(37 ?、5 % CO2)，IPEC-J2 细胞接种于 24 孔培养板，隔天 55 更换培养基，细胞长成单层后使用。 1.4 细胞粘附和侵袭 对照试验:将 600μ L 猪链球菌(1×107 CFU) 加入 IPEC-J2 细胞中，培养 2h。排斥 试验:将 300uL 猪链球菌(2×107 CFU) 加入 IPEC-J2 细胞中，培养 1h 后;再加入 300uL 嗜酸乳杆菌 ATCC 4356 悬液 (1×108 CFU)，继续在 37?、5% CO2 培养箱培养 1h。置 60 换试验:将 300uL 嗜酸乳杆菌 ATCC 4356 菌悬液 (1×108 CFU) 与 IPEC-J2 细胞一起培 养 1 h 后;再加入 300uL 猪链球菌(2×107 CFU)，继续在 37?、5% CO2 培养箱培养 1h。 每种细菌及试验均设 3 个平行，将 IPEC-J2 细胞用 PBS 缓冲液漂洗 2 次，洗去未黏附的细 菌后向细胞中加入无菌蒸馏水，在 37?、5% CO2 培养箱中培养 30 min 裂解细胞。当细胞 裂解后，黏附细菌的数量通过 10 倍连续稀释后铺平板计数，用含有 100μ g/mL 的庆大霉素 65 的 THB 琼脂培养基，筛选各处理组中黏附猪链球菌的个数。 1.5 细胞免疫荧光试验 将猪链球菌(2×107 CFU) 和嗜酸乳杆菌 ATCC 4356 悬液共同加入 IPEC-J2 细胞中， 培养 1h 后，用 0.01 mol/L PBS 洗涤 3 次，5 min/次，4%多聚甲醛固定 15 min;接着用 0.4% triton-100 孵育 5 min，PBS 漂洗 3 次，5 min/次;5%BSA 室温封闭 1 小时，PBS 漂洗 3 次， 70 5 min/次;避光条件下，加入荧光标记的鬼笔环肽抗体染色(1:100)，37?作用 1 小时;PBS -2- 漂洗 5 次，5min/次，然后取下扒片盖在载玻片上，用荧光显微镜观察。 1.6 动物试验 选取 1 月龄仔猪，麻醉后实施肠结扎手术，在肠段内分别注入乳酸杆菌和荧光标记好的 SS2，或者是单独荧光标记好的 SS2，作用 2 小时候，取肠段液氮固定，制作切片后免疫荧 75 光显微镜观察。 2 结果和分析 2.1 细菌交叉培养 实验结果显示:SS2 9801 和嗜酸乳杆菌 ATCC 4356 在 24 至 72 小时之内无法在对方的 80 固体培养基上生长，如图 2 所示。在后续实验中，当嗜酸乳杆菌 ATCC 4356 与 SS2 共同作 用 IPEC-J2 细胞得到的混合液涂 THB 板计数时，可排除嗜酸乳杆菌 ATCC 4356 在 THB 板 上生长而干扰实验结果的情况。 2.2 细胞粘附和入侵 85 表 1 SS2 与上皮细胞的粘附 Tab. 1 the adhesion of SS2 to epithelium 对照试验 排斥试验 置换试验 入侵细胞内细菌数 (380?23.2)a (76?4.6)A 440?15.6 入侵与粘附在细胞 (2200?36.3)a (800?31.6)A 2600?46.6 膜上细菌总数 注:数据中上标 A 为 P?0.01 差异极显著 a 为 P?0.05 差异不显著 实验结果如表 1 显示，SS2 9801 在 CFU 达到 107 时可以有效入侵 IPEC-J2 细胞。在 IPEC-J2 中先加入嗜酸乳杆菌 ATCC 4356 赋予后，可极显著降低 SS2 9802 粘附的细菌数; 而在 SS2 9802 感染细菌后，再加入嗜酸乳杆菌 ATCC 4356 同样可显著降低 SS2 9802 粘附 90 的细菌数。 2.3 共聚焦显微镜镜检细胞结构变化 如图 1 所示，在荧光显微镜下，单独嗜酸乳杆菌 ATCC 4356 组与空白处理组相比，对 细胞微丝影响并不明显，微丝呈丝状或束状梭形分布，微丝排列均匀;而猪链球菌作用细胞 后，导致微丝在细胞内的重排或解聚，胞质内密集有序的微丝网络被破坏，微丝向细胞连接 95 处移动或解聚为点状斑点。而嗜酸乳杆菌 ATCC 4356 和猪链球菌共同作用细胞时，猪链球 菌引起微丝重排和解聚变化得以改善，明显减轻了猪链球菌引起的细胞微丝向细胞连接处移 动或解聚为点状斑点的现象。 -3- IPEC-J2 细胞对细胞微丝的影响 A 空白对照组，B 乳酸杆菌组，C 链球菌 图 1 乳酸杆菌和猪链球菌黏附100 组，D 乳酸杆菌+链球菌组 Figure 1 The influence of L. acidophilus and SS2 on the Microfilament in IPEC-J2. A Control group, B L. acidophilus group, C SS2 group, D L. acidophilus and SS2 treated simultaneously. 2.4 SS2 对肠上皮细胞的侵袭 图 2 显示，SS2 9801 可以侵袭并且粘附仔猪上皮细胞，而加入乳酸杆菌后，可减少 SS2 105 的粘附数量。 图 2 乳酸杆菌和猪链球菌黏附粘附仔猪上皮的情况 A SS2 9801 group，B 乳酸杆菌+链球菌组 Figure 1 The results of L. acidophilus and SS2 adhesion to the piglet epithelium. A SS2 infection,B L. acidophilus and SS2 treated simultaneously. 110 3 讨论 猪链球菌 2 型可引起猪脑膜炎、心内膜炎、关节炎、肺炎和败血症等，也可感染人并 致死，是猪链球菌病的主要病原菌，给养猪业造成了极大的经济损失。目前防治猪链球菌感 染的方法主要包括疫苗免疫、化学药物和抗生素治疗三个方面[4]。疫苗免疫由于猪链球菌血 115 清型多、抗原决定簇复杂，疫苗免疫效果不理想;化学药物的大量应用和残留，造成环境污 -4- 染并危害人、畜健康;而抗生素的使用则破坏了肠道正常菌群结构，影响肠道菌群与宿主的 正常关系，更为严重的是抗生素的广泛应用引起了细菌抗药性问题，威胁人类健康。而存在 于消化道中的乳酸杆菌作为优势菌群[5-6]有效保护肠黏膜是其发挥保护作用的关键。乳酸杆 [7-9]，可缓解病原 菌粘附于上皮细胞后，定植形成稳定的菌落，对宿主发挥生物屏障等作用120 菌对细胞连接的破坏，保护细胞旁路的完整性，但其详细机制尚有待进一步阐明[10]。 本研究证实 SS2 可以粘附并侵袭猪小肠上皮细胞 IPEC-J2，并且在侵袭的过程中破坏微 丝结构。通过仔猪结扎试验进一步证实 SS2 经肠道黏膜侵袭机体的可能性。而乳酸杆菌能 够很好的拮抗 SS2 对肠上皮细胞的侵袭，为防治 SS2 的感染提供理论基础。 125 致谢 感谢高校博士新教师基金(20100097120007)的支持。 [参考文献] (References) [1] Vanier, G., et al., Disruption of srtA gene in Streptococcus suis results in decreased interactions with 130 endothelial cells and extracellular matrix proteins. Vet Microbiol, 2008. 127(3-4): p. 417-24. [2] Kang, E.H., et al., EstA protein, a novel virulence factor of Streptococcus pneumoniae, induces nitric oxide and pro-inflammatory cytokine production in RAW 264.7 macrophages through NF-kappaB/MAPK. Microb Pathog, 2009. 47(4): p. 196-201. [3] Madsen, L.W., et al., Streptococcus suis serotype 2 infection in pigs: new diagnostic and pathogenetic aspects. 135 J Comp Pathol, 2002. 126(1): p. 57-65. [4] Lun, S. and P.J. Willson, Expression of green fluorescent protein and its application in pathogenesis studies of serotype 2 Streptococcus suis. J Microbiol Methods, 2004. 56(3): p. 401-12. [5] 刘志学, 庾庆华, 杨倩, 猪扁桃体的超微结构观察. 畜牧兽医学报, 2009. 40 (7): p. 1074-1080. [6] Rescigno, M., et al., Dendritic cells express tight junction proteins and penetrate gut epithelial monolayers to 140 sample bacteria. Nat Immunol, 2001. 2(4): p. 361-7. [7] Cossart, P. and P.J. Sansonetti, Bacterial invasion: the paradigms of enteroinvasive pathogens. Science, 2004. 304(5668): p. 242-8. [8] Balkovetz, D.F. and J. 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