【word】 广西壮药鸡骨草多糖的提取及对羟自由基清除作用的研究

【word】 广西壮药鸡骨草多糖的提取及对羟自由基清除作用的研究 广西壮药鸡骨草多糖的提取及对羟自由基 清除作用的研究 ? 36?检验医学教育2011年12月第18卷第4期 (新进展] 广西壮药鸡骨草多糖的提取及对羟自由基清除作用的 研究 谭冰,严焕宁,黄锁义,廖慧娴,张强.’ (1.右江民族医学院药学系,广西百色533000;2.右江民族医学院临床.医学系,广西百色533000) [摘要]目的:探讨广西壮药鸡骨草多糖的提取,含量测定及其对羟自由基的清除作用,以充分利用鸡骨草 植物资源,减少资源浪费.方法:利用热水浸提法,提取鸡骨草多糖,对其进行初步纯化,利用苯酚一硫酸法测 定鸡骨n- gingofhydroxylradicalsBing,YanHuanNing,Huangsuoyi,eta1.D~partme ntofPharmacy,You— jiangMedicalUniversityforNationalities?GuangxiBaise533000. j [-Abstract]0bjective:GuangxisZhuangMedicineAbruscantoniensisHanc efulluseofplantresources,reduce wasteofresources,ofpolysaccharides,determinationandtheroleofhydroxylradicalscavenging.Methods: Referencetotheuseofhotwater,extractionofAbruscantoniensisHance15blysaccharides,purifiedthem,the useofphenol—sulfuricacidmethodtomeasurethecontentoftheAbrusd日 1ntoniensisHancepolysaccha”des, anduseAbruscantoniensisHancep01ysacchadestestedtheroleofhydroxylradicals.Results:Bythismethod thecontentofAbruscantoniensisHancepolysaccharideswas0.617%aridtherateofrecoverywas98.64, RSD一0.346(n一 5).Conclusion:GuangxiSZhuangMedicineAbruscantoniensisHancecontainacertaina— mountofpolysaccharide,andGuangxisZhuangMedicineAbruscantoniensisHancepolysaccharidesonhy, droxylradicalscavengingeffectwithgood. [-keywords]AbruscantoniensisHance;polysaccharide;hydroxylradical;scavenging 多糖(polysaccharides.PS)是天然的生物大分 子物质,它几乎存在于所有的有机体中,是有机体的 能量主要来源,是一切有生命的有机体必不可少的 组成成分,具有抗肿瘤,免疫,治疗心血管疾病,抗补 体,降血压,降血脂等活性.随着人们对多糖认识的 不断加深,多糖的作用越发显得突出.大量的药理 和临床研究明,多糖类化合物是一种免疫调节剂, 它能激活免疫细胞,提高机体的免疫功能,而对正常 细胞几乎没有毒副作用n],近年来对植物多糖的研 究已经成为一个热点,对于多糖抗氧化活性的研究 大多以粗多糖为主.如刘培勋等研究表明银耳碱提 多糖抗氧化活性?2].鸡骨草(Abruscantoniensis Hance),又名广州相思子,细叶鸡草,小叶鸡骨草, 为百科相思子属植物,具有清热解毒,疏肝止痛之功 通讯作者:黄锁义(1964.),男.教授,Email:huangsuoyi@163com 效,是临床常用中药,广泛用于黄疸,胁肋不舒,胃脘 胀痛,急,慢性肝炎[3].原产广西,广东等南部省区, 以广西的栽培面积最大,是两广的道地药材,其植株 含相思子碱,皂苷,黄酮苷,胆碱,甾醇类,氨基酸,糖 类化合物等化学成分E.近年来医药工作者加强了 对鸡骨草的研究,尤其是在有效成分的提取,分离, 药理研究等方面进行了深入的研究,并取得了可喜 的成果.但是鸡骨革多糖提取和抗氧化方面的研究 还未见报道,本文将对广西鸡骨草活性多糖进行提 取,分离纯化以及其对羟自由基的清除作用等方面 展开研究,为天然药物的开发和应用提供参考依据. 1材料与试剂 1.1原料与试剂95乙醇AR;无水乙醇AR;乙 醚AR;盐酸AR;硫酸AR;苯酚AR;氯仿AR;正丁 醇AR;活性炭AR.30双氧水AR;硫酸亚铁 检验医学教育2011年,:12月第18卷第4期?37? AR;邻菲罗啉AR;三(羟甲基)甲胺甲烷AR;双蒸 馏水;葡萄糖标准品(J&KCHEMICALLTD);鸡 骨草干品(采自广西贵港),粉碎成粉末. 1.2主要仪器设备Fw1O0型高速万能粉碎机 (天津泰斯特仪器有限公司);电子天平(上海民桥精 密科学仪器有限公司);DHG一9070A型电热恒温旋 风干燥箱(上海精密设备有限公司);电热式恒温水 浴锅(江苏金坛宏凯仪器厂);循环水真空抽气泵(上 海嘉鹏科技有限公司);RE一52AA型旋转蒸发器(上 海安亭实验仪器有限公司);78WH一1恒温磁力搅拌 器(杭州蓝天化验仪器厂);台式离心机(上海安亭科 学仪器厂);722N型紫外分光光度计(上海精密科 学仪器有限公司). 2实验方法 2.1鸡骨草多糖的提取称取粉碎的鸡骨草粉末 12g,放置烧杯中,加入约150ml蒸馏水,将其置于 电热恒温水浴锅中,温度控制在8O?左右,3小时 后,用循环水式多用真空泵进行抽滤,将滤液放人另 外的500ml大烧杯中,用同样的方法重复提取三 次,合并三次滤液,用旋转蒸发器浓缩至10~20ml, 冷却至室温后,加入60ml乙醇在背光处静置24小 时,抽滤,滤饼依次用乙醇和乙醚洗两次,得到灰色 粉末状固体0.1650g. 2.2鸡骨草多糖粗品的提纯Sevag法脱蛋白?5]: 表1紫外可见分光光度计测葡萄糖对照液吸光度 将上一步骤得到的多糖粗品置于烧杯中,加入一定 量蒸馏水(约50~C)溶解,得多糖水溶液,加入相当 多糖水溶液1/4体积的氯仿,再加人相当于氯仿的 1/4体积的正丁醇,将混合物剧烈震荡2O,30分钟 后,然后静置分离,通过分液漏斗除去含有变性蛋白 的溶剂层,保留水层,如此重复3次,脱去蛋白质. 将脱蛋白质的多糖溶液用恒温磁力搅拌器浓缩成膏 状后,用电热恒温旋风干燥箱烘干,即得样品多糖记 为W1,称量W1—0.0740g. 2.3鸡骨草多糖含量测定 2.3.1标准溶液的测定:?精密量取5.00ml苯 酚,置于100ml容量瓶中,加蒸馏水定容,得5.0% 的苯酚溶液;?精确称量0.010g葡萄糖,置于100 m1容量瓶中,加蒸馏水定容,得0.1IIlg/ml的葡萄 糖溶液. 2.3.2标准曲线的测定:精确量取葡萄糖对照标准 溶液依次为5.00,10.00,20.00,30.00,35.O0 ml,置50ml容量瓶中,加蒸馏水定容,分别稀释成 10,20,40,60,70/ag/ml的5个不同浓度的对照品 系列溶液.分别准确量取1.00ml样品液5份,分 别置于10ml具塞比色管中,加1.50ml苯酚溶液, 再加7.50ml浓硫酸溶液,混合均匀后放置2O分 钟,用722N型可见光光度计,在486nm测其吸光 度,以对照品浓度为横坐标,吸光度为纵坐标做标准 曲线,建立回归方程,结果见表1和图1. 线性回归作图如下: 图1葡萄糖标准曲线 ? 38?检验医学教育2011年12月第18卷第4期 根据以上数据以及作图求得葡萄糖标准曲线回 归方程:A一0.0649C一0.0031,R一0.9993. 2.3.3鸡骨草多糖提取率测定(苯酚一硫酸法): 精确称取鸡骨草粗多糖0.0100g置于1Oml试管 中,加入lmol/LH.SO2ml,沸水浴水解2小时,冷 却至室温,移至100ml容量瓶,蒸馏水定容至刻度. 表2紫外可见分光光度计平行测定鸡骨蕈多糖溶液的吸光度 按照绘制标准曲线的方法,分别精密量取1.0ml样 品液5份,分别置于10ml具塞比色管中,加1.5ml 5.0%苯酚溶液,再加7.5ml浓硫酸溶液,混合均匀 后放置2O分钟,用可见分光光度计在486nm处测 其吸光度值,由回归方程计算鸡骨草中多糖的含量, 其测定结果如表2. 项目数据 根据标准葡萄糖线性回归方程,可以计算出鸡骨 草粗多糖相当于葡萄糖的浓度,如上表所示.平均浓 度c一1.006bLg/ml.那么,可以按下式计算鸡骨 草粗多糖与葡萄糖之间的换算因子F:F—w/(C× D),式中w,为称取粗多糖的质量(g)(实验中W一 0.0100×10ug),D为粗多糖稀释倍数(实验中D一 1000),求得F为9.94. 2.3.3.1粗多糖提取率的计算方法嘲粗多糖提取率 (%)一Ec~DXF×K/W0×lO]×lOO,式中:C为粗 多糖浸提液通过苯酚——硫酸法测定A值再从回归 方程求得的粗多糖相当于葡萄糖的含量(g);D为稀 释倍数(实验中D-1000);F为换算因子(F一9.94);K 为鸡骨草制备的样品多糖w与称量的0.010g鸡骨 草多糖的比值(K一7.4);W.为鸡骨草干粉重量.代 人数据计算得:粗多糖提取率()=0.6179/5. 2.3.4回收率的测定:按”2.3.2”方法,分别量取 1ml1O,20,4O,60,70g/m15个不同浓度的对照 品溶液,置于10ml具塞比色管中,加1.50m15.0 苯酚溶液,再加7.50ml浓硫酸溶液,混合均匀后放 置20分钟,再分别加入”2.3.3”中的粗多糖溶液0.1 ml,用可见分光光度计在486nm处测其吸光度值, 结果回收率为98.64,RSD一0.346(n一5). 2.4羟基自由基的清除 2.4.1鸡骨草样品多糖溶液的配制:精确称取 表3鸡骨草多糖清除?OH的清除率 0.064g鸡骨草样品多糖,放置烧杯中,用少量5o?热 水完全溶解后,转移至50mL容量瓶,用蒸馏水定 容,即得浓度为C一1.28mg/ml的多糖样品溶液. 2.4.2清除羟自由基的测定:Fenton反应是生物体 内存在的?OH体外模式反应.参照Fenton反应的 方法建立反应体系模型[,利用H.0与Fe.+混合 产生?OH(反应式HO+Fe+Fe抖+?OH+ 0H).Fe.与邻菲罗啉(phen)在pH一2,9的范围 内可形成稳定的橙红色络合物,在510nm处有最大 吸收.当加入鸡骨草多糖溶液时,鸡骨草多糖能清除 溶液中游离的?OH,因而可以通过测量吸光度间接 计算出样品鸡骨草多糖对?OH的清除率. ^ 清除率()一AA×100%/-ko一 A.:不加H.O,而加入样品时的吸光度 A:加入HO.,但不加样品时的吸光度 A:加入H.O.和样品时的吸光度 采用Fenton反应产生羟自由基,在10ml具比色 管中依次加入0.2ml邻菲罗啉(5mmol/L),lml Tris—HC1缓冲溶液(50mmol/L,pH6.0)0.2ml硫酸 亚铁(7.5mmol/L),0.2ml过氧化氢(1%)和不同体 积的鸡骨草多糖溶液,无水乙醇定容到10ml,然后于 37?超级恒温水浴中反应6O分钟,在510nm处测量 吸光值,平行3次. 根据表3可绘制鸡骨草多糖溶液对清除?OH的清除率变化曲线图. 检验医学教育2011年12月第18卷第4期?39? 圈2鸡草多糖浓度与清除率的变化关系 从图2中可看出,鸡骨草多糖溶液对由Fenton 体系产生的?OH有一定的清除作用,随着鸡骨草 多糖浓度的增加,对?OH自由基的清除能力也增 强.说明鸡骨草多糖与?OH自由基清除有一定的 量效率关系,即鸡骨草多糖浓度增加时,其清除率也 增大. 3结论与展望 广西壮药鸡骨草中含有一定量的多糖,其多糖 提取率为0.617%,回收率98.64%,RSD=0.346 (n一5).广西壮药鸡骨草多糖对?OH具有较好的 清除作用,而且在一定范围内呈现良好的量效率 关系. 广西壮药鸡骨草多糖所具有的抗氧化活性使其 有望作为天然抗氧化剂而得到很好的开发应用,本 研究将为进一步促进广西壮药鸡骨草植物资源的开 发利用提供科学依据. 参考文献: [1]黄飞.梁智群.对山楂叶中多糖活性成分的分离提取研究[J]. 广西轻工业,2006(6):45—46. 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