螺内酯体内外抗大鼠肝纤维化的作用

螺内酯体内外抗大鼠肝纤维化的作用 螺内酯体内外抗大鼠肝纤维化的作用 作者: 李旭，孟莹，张振书，张小兰，黄茂梁 【摘要】 目的: 探讨螺内酯对实验性肝纤维化的影响及其作用机制. 方法: 雄性Wistar大鼠24只，随机分为3组，每组8只. 模型组: CCl4 油2.5 mL/kg SC，3次/wk;螺内酯组: CCl4 油注射的同时每日予以螺内酯20 mg/kg灌胃，1次/d;对照组: 橄榄油SC. 于4 wk取材，VG染色检测大鼠肝组织学改变. Western印迹法检测肝组织TGF β1的达. EMSA检测肝组织NF κB的活性. 酶图法测定MMP 2, 9的活性. 另培养大鼠HSC T6，分别予醛固酮(Aldo) 1 μmol/L、螺内酯1 μmol/L(预处理60 min，再予Aldo刺激1 h)和TNFα 100 μg/L处理1 h，设立阴性对照组. EMSA检测NF κB DNA结合活性;Western印迹检测胞质内IκBα的表达. 结果: 体内4 wk，螺内酯组纤维化分级小于模型组(螺内酯组vs模型组，P0.01);模型组TGF β1的表达明显高于螺内酯治疗组(模型组vs螺内酯治疗组，P0.05). 模型组NF κB结合活性显着增强(模型组vs对照组，P0.01)，螺内酯可抑制肝组织NF κB结合活性(螺内酯组vs模型组，P0.05). 模型组MMP2,9活性显着增强(模型组vs对照组，P0.01)，螺内酯可抑制MMP2,9活性(螺内酯组vs模型组，P0.05). 体外Aldo和TNFα干预1 h后， NF κB DNA结合活性增强(Aldo处 )，螺内酯可抑制NF κB DNA结合活性(螺内酯+Aldo处理组vs对照组，P0.01 理组vs Aldo处理组，P0.05). Aldo可减低胞浆内IκBα表达(Aldo处理组vs对照组，P0.05). 螺内酯则抑制胞质蛋白中IκBα表达的减低(螺内酯+Aldo处理组vs Aldo处理组，P0.05). 结论: 螺内酯可抑制实验性肝纤维化形成，其抗肝纤维化作用与抑制肝组织TGF β1的表达以及NF κB和MMP2,9的活性有关. 【关键词】 肾素 血管紧张素 醛固酮系统;螺内酯;核因子 κB;肝硬化 【Abstract】 AIM: To determine the effect of spironolactone on the progression of rat hepatic fibrosis in vivo and in vitro and its mechanisms. METHODS: Twenty four Wistar rats weighing about 250 g were divided into 3 groups, with 8 in each group. In model group, the rats received injection of 40% CCl4 2.5 mL/kg subcutaneously, three times a week. In spironolactone treatment group, the rats received injection of 40% CCl4 as well as ig administration of spironolactone 20 mg/(kg?d). In control group, the rats received injection of olive oil only. After 4 weeks, morphological examination was performed. The expression of TGF β1 protein in liver tissue was examined by Western Blot. Electrophoretic gel mobility shift assay (EMSA) was utilized to detect NF κB DNA binding activity in liver tissues. The activities of matrix metalloproteinase 2,9 (MMP 2,9) were assessed by zymography. In vitro, HSC (hepatic stellate cell) T6 cells were preincubated for 1 h with or without spironolactone 1 μmol/L (an inhibitor of aldosterone) prior to exposure to aldosterone (Aldo) 1 μmol/L for 1 h. DNA binding activity of NF κB was analyzed by EMSA. The expression of IκBα protein was examined by Western Blot. RESULTS: In vivo, spironolactone treatment significantly reduced mean fibrosis score and protein levels of TGF β1 in the 4th week (P0.01, P0.05). Spironolactone reduced DNA binding activity of NF κB and MMP 2,9 activities (P0.01). In vitro, stimulation of HSC by Aldo increased NF κB DNA binding activity (P0.01) and decreased IκBα protein expression (P0.05). On the contrary, spironolactone significantly reduced NF κB DNA binding activity and increased IκBα protein expression (P0.05). CONCLUSION: Spironolactone may partly exert inhibiting effects on CCl4 induced hepatic fibrogenesis by reducing TGF β1 expression, inhibiting DNA binding activity of NF κB and activities of MMP 2,9. Stimulation of HSC by Aldo promotes NF κB binding activity which can be inhibited by spironolactone. 【Keywords】 renin angiotensin aldosterone system; spironolactone; liver cirrhosis; NF κB 0引言 肝脏肾素 血管紧张素 醛固酮系统(RAAS)的激活与肝纤维化形成密切相关. 肝星状细胞(HSC)的激活是肝纤维化的中心环节，HSC可表达醛固酮(Aldo)合成酶基因 CYP11B2，Aldo拮抗剂螺内酯可以抑制实验性肝纤维化形成. 此外，canrenone(Aldo拮抗剂螺内酯的活性代谢产物)可抑制人HSC的增殖和移动,1,. 然而，目前螺内酯抗肝纤维化机制尚未明确. 核因子 κB (NF κB)负责调控与肝纤维化有关的基因，参与HSC的激活、转化和细胞外基质的合成，Aldo可增强HSC NF κB DNA结合活性,2,，而螺内酯对HSC NF κB活性的影响尚不明确，我们探讨螺内酯的抗肝纤维化机制及螺内酯对HSC NF κB DNA结合活性的作用机制. 1材料和方法 1.1材料 雄性SPF级Wistar大鼠(南方医科大学实验动物研究所提供); 先生惠赠. 体HSC T6细胞株为表型活化的肝星状细胞，由美国Scott L. Friedman外实验用螺内酯、Aldo(Sigma);TNFα (R,D公司);动物实验用螺内酯(广州白云山制药厂);抗转化生长因子β1(TGF β1)多抗、抗IKBα多抗(Santa Cruz公司);蛋白裂解液(CST公司);ECL化学发光试剂盒(Pharmacia公司). 核蛋白提取试剂盒(Active Motif公司). α P32 dATP(北京亚辉生物医学工程公司);寡核苷酸探针(上海生工合成). 1.2方法 1.2.1体内实验雄性Wistar大鼠24只，随机分为3组. 模型组: 400 mL/L CCl4 油(CCl4与橄榄油混合物) 2.5 mL/kg SC，3次/wk;螺内酯治疗组: 同法用CCl4 油SC，螺内酯20 mg/kg灌胃，1次/d. 对照组: 橄榄油SC. 4 wk宰杀动物，取材. 肝组织标本用中性甲醛固定，石蜡包埋，切片VG染色，观察. 由同一病理专科医师予以纤维化分级. 0级: 无胶原纤维形成;1级: 汇管区和Disse腔少量胶原纤维形成;2级: 胶原纤维显着增生，有形成纤维隔趋势;3级: 假小叶形成. 另在液氮中将肝组织碾碎，加入蛋白裂解液500 μL，PMSF 50 μL匀浆，10 000 r/ min，取上清，Bradford法测定总蛋白浓度. 取总蛋白100 μg以120 g/L, 150 g/L SAD PAGE凝胶电泳分离. 电转移蛋白至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉封闭过夜，加入一抗(TGF β1多抗，1?700)于封闭袋中孵育2 h，4?;二抗(辣根过氧化物‎‎酶标记的羊抗兔抗体，1?2017)孵育1 h. 化学发光法显示结果，压片曝光. 凝胶图象系统(UVP公司)检测蛋白质印迹条带灰度. 取新鲜肝组织100 mg，加入1×Hypotonic buffer(含DTT) 3 mL，匀浆，冰浴15 min;4? 850 r/min，10 min;弃上清，加入1×Hypotonic buffer重悬，冰浴15 min;加入NP 40 25 μL，震荡10 s;4? 14 000 r/min，30 s;收集上清即胞质蛋白，将沉淀重悬于Lysis buffer 100 μL中，震荡10 s;置于摇床中冰浴30 min，150次/min;再次震荡30 s，4? 14 000 r/ min，10 min;取上清即为核蛋白，于-70?保存，测定蛋白质浓度. NF κB寡核苷酸序列: 5′ AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC 3′; 5′ AGTTGCCTGGGAAAGTCCCCTC 3′. NF κB寡核苷酸探针经过聚合、稀释，使其终浓度为10 pmol/L. 加入NF κB寡核苷酸探针1 μL，加10×Klenow缓冲液2 μL，,α 32P, dATP 4 μL，无A dNTP (2.5 mmol/L) 3 μL，三蒸水9 μL， Klenow片断1 μL. 总反应体系20 μL，37?孵育60 min. 经过柱纯化，测定比放射活性. 取5 μg核蛋白上样，采用80 g/L聚丙烯酰胺凝胶， 150 V电泳2 h. 干胶后压片， -70?冰箱中放射自显影，冲洗胶片. 制备75 g/L的分离胶及40 g/L的浓缩胶，在分离胶中加入2 g/L明胶，蛋白样品50 μg中加入等量的2×蛋白质上样缓冲液(不含二硫苏糖醇). 电泳结束后，将凝胶移入25 mL/L Triton X 100溶液中复性1 h，再在孵育液(50 mmol/L Tris Cl pH 7.6, 500 mmol/L NaCl, 5 mmol/L CaCl2, 0.2 g/L NaN3)中37?孵育24 h，让明胶酶充分与底物明胶作用. 考马斯亮蓝染色， 脱色液脱色， 至出现清晰的负染条带为止， 干燥凝胶拍照. 阳性结果判断: 考马斯亮蓝染成的蓝色背景下可见到白色条带.。