【精品推荐】冬凌草甲素抑制H22小鼠移植性实体瘤增殖的作用临床医学论文_医药学论文_2905

【精品推荐】冬凌草甲素抑制H22小鼠移植性实体瘤增殖的作用临床医学论文_医药学论文_2905 论文范文 题目:冬凌草甲素抑制H22小鼠移植性实 体瘤增殖的作用临床医学论文_医药学论文 编辑:小小 作者:王培军 韩淑云 陈乃峰 孙权 张东东 韩曦 扈清云 【摘要】 目的探讨不同浓度的冬凌草甲素对小鼠H22肿瘤细胞生长 影响及其抑瘤作用机制。方法将H22肿瘤细胞接种到小鼠皮下～建 立肝癌H22移植瘤模型。用高、中、低三个剂量的冬凌草甲素灌胃 2 w后～检测抑瘤率～并用TUNEL法和免疫组化方法检测H22肿瘤 细胞的凋亡率和对bcl-2、p53、caspase3基因表达的影响。 结果 小鼠H22肿瘤细胞对冬凌草甲素敏感～明显抑制肿瘤细胞的增殖 (P<0.01)～高剂量组肿瘤抑制率达52.33%～与丝裂霉素结果相近 (P>0.05);实验后小鼠体重没有明显下降～小鼠肿瘤抑制率随剂量升 高而增加～高剂量组达(48.31?1.74) %;高剂量组bcl-2和p53基 因表达下调～阳性率分别为(18.32?0.32)%、(27.57?0.51)%～ caspase3阳性率上调为(62.59?0.57)%。结论冬凌草甲素可抑制小 鼠H22肿瘤细胞的增殖～并下调bcl-2和p53基因表达～而激活 caspase3基因表达引起肿瘤细胞的凋亡有关。 【关键词】 冬凌草甲素;细胞凋亡;增殖 【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect on anti-proliferation of H22 transplanted tumor with different concentration of oridonin and its mechanism inmice.MethodsH22 transplanted tumor model was made by injection of H22 tumorcells under skin of the right axillary and high, middle and low dose of oridonin were intragastric administration for 2 weeks. Tumor inhibition rate was measured and the bcl-2, p53 and caspase3 expression were detected by TUNEL and immunohistochemistry.ResultsH22 transplanted tumor cells were apparently sensitive to oridonin, and oridonin could obviously inhibit tumor proliferation (P<0.01).Inhibition rate of high dosage was (48.31?1.74)%, which was nearly same as Mitomycin (P>0.05).The positive expression rate of gene bcl-2, p53 and caspase3 were (18.32?0.32)%,(27.57?0.51)% and (62.59?0.57)%. The weight of the mice was not lower down after treatment.ConclusionsOridonin can inhibit the tumor growth in dose-dependent manner, which is related with upregulation the expression of caspase3 and downregulation the expression of bcl-2 and p53 and then activate theapoptosis of the H22 humor cells. 【Key words】Oridonin; Apoptosis; Proliferation 冬凌草甲素有抑制肿瘤细胞生长的作用而对正常细胞生长无影 响〔1〕。冬凌草甲素对胃癌、鼻咽癌细胞的生长有明显抑制作用～ 但对人肝癌H22小鼠移植蛋白性实体瘤细胞的毒性作用国内外尚未 报道。本实验通过不同剂量的冬凌草甲素作用于H22小鼠移植瘤细 胞～观察其对小鼠肿瘤的影响以及对肿瘤细胞中bcl-2、p53、 caspase3表达的影响～探讨其促进肿瘤细胞的凋亡作用机制。 1与方法 1.1材料冬凌草甲素购自上海卓康生物科技有限公司～规格20 mg/支(C?98%);丝裂霉素(浙江海正药业股份有限公司,批号: H33020786)。实验瘤源小鼠:H22腹水瘤小鼠(哈尔滨肿瘤研究所提 供);昆明种近交系小鼠～雌雄各半～体重(18?2)g～佳木斯大学实 验动物中心提供～许可证号:黑动字第99101001～普通级。TUNEL 试剂盒、bcl-2、p53和caspase3试剂盒及DAB显色试剂盒(武汉博 士德生物公司)。 1.2实体瘤抑制实验将接种H22瘤种8 d的腹水瘤小鼠以脱颈 法处死～无菌条件下抽取腹水瘤细胞悬液5ml～经离心稀释～用生 理盐水重新悬浮细胞～细胞悬液浓度为1×106/ml。以每只0.2 ml接种于100只昆明种小鼠(雌雄各半～雌雄分笼饲养)右腋下～制成实体瘤动物模型。接种24 h后～分别随机分成5组～每组20只。低、中、高剂量组、阳性对照组和阴性对照组。分别灌胃不同剂量的冬凌草甲素～低、中、高剂量组按照50、100、200 mg?kg-1?d-1剂量灌胃～阳性对照组按照10 mg?kg-1?d-1(药量/小鼠体重)的剂量灌胃丝裂霉素～阴性对照组小鼠灌胃给予生理盐水0.2 ml。连续14 d。 1.3样本采集第15天处死小鼠～取肿瘤组织称重并制片。 1.4TUNEL法检测细胞凋亡细胞凋亡检测按原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。细胞核呈棕黄色为TUNEL反应阳性细胞(即凋亡细胞)。光镜下随机计数10个高倍视野(×400)阳性细胞所占百分数即为细胞凋亡率。 1.5bcl-2、p53、caspase3的免疫组化检测石蜡切片常规脱蜡至水～用3% H2O2灭活内源性酶5~10 min。微波炉枸橼酸盐缓冲液抗原修复后～免疫组织化学染色方法参照SABC试剂盒说明书进行～其中一抗bcl-2、p53和caspase3 用0.1 mol/L PBS(pH 7.4)1?50浓度稀释～以PBS替代一抗作阴性对照。DAB显色后～苏木精轻度复染～脱水～透明～封片～显微镜下观察。细胞膜和细胞质出现棕黄色或褐色为bcl-2、caspase3表达阳性细胞～胞浆和胞核内出现棕黄色或褐色为p53阳性表达细胞。显微镜下选取每个区域不重复的随机10个高倍视野(×400)～计算bcl-2、p53和caspase3阳性细胞数～求平均值。 1.6统计学处理结果用x?s表示～组间均数的比较用方差分析～两两比较用q检验。 2结果 2.1冬凌草甲素对小鼠H22 实体瘤增殖的影响阴性对照组小鼠于第2天开始出现肿块～而给药组则于第6天出现肿块～抑瘤率与对照组比较差异明显且随剂量的增加抑瘤效果增强(P<0.5);移植瘤对丝裂霉素也较敏感～瘤重明显低于生理盐水组(P<0.01)～见表1。 2.2冬凌草甲素对H22小鼠移植瘤细胞凋亡率比较阴性对照组、低剂量组组、中剂量组、高剂量组和丝裂霉素组细胞凋亡率分 别为(6.23?0.13)%、(14.22?1.43)%、(21.54?1.16)%、(48.31?1.74)%和(51.75?1.34)%,各剂量组细胞凋亡率均显著高于正常对照组(P<0.01)～高剂量组与阳性对照组无差别(P>0.05)。 2.3冬凌草甲素对p53 、bcl-2和caspase3表达影响免疫组织化学检测肿瘤细胞凋亡相关蛋白表达变化明显～p53 、bcl-2和caspase3阳性率与对照组比较差别有统计学意义～呈剂量依赖型 。表1冬凌草甲素对H22小鼠肿瘤抑制率及bcl-(P<0.01)～见表1 2 、p53、caspase3表达影响 3讨论 冬凌草甲素是从冬凌草中提取出来具有广泛抗癌活性的天然有机物。给小鼠静脉推注〔3H〕冬凌草甲素后～以胆囊、肠道、食管叶放放射性含量较高～而在4 h时胆囊放射性又是食管、肠道的20余倍〔2〕。因此～冬凌草甲素有希望在消化道肿瘤中起良好的作用。本实验表明冬凌草甲素对肝癌H22小鼠移植瘤具有抑制作用～高剂量效果最佳。caspases被认为是细胞凋亡的核心执行者即凋亡的共同通路〔3〕。bcl-2家族在细胞凋亡时的作用极其重要～抑凋亡蛋白的过度表达～可增强线粒体膜电位～阻止细胞色素C的释放～从而阻碍正常的细胞凋亡路径～对肿瘤的发展起到推动作用〔4〕。caspase3是caspases家族中的成员～该基因编码一个32 kD的半胱氨酸蛋白酶～是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶。caspase3被证实位于该细胞级联反应的下游～它通过下游效应因子切断细胞间的信号传递～重组细胞骨架～关闭DNA复制和修复～破坏DNA和细胞核结构～诱导凋亡小体来执行凋亡功能〔5〕。本结果说明冬凌草甲素抑制肿瘤生长与下调bcl-2表达而促进caspase3表达有关。野生型p53是一种抑癌基因～是癌基因中研究最为广泛的基因之一。并与多种基因之间存在相互调节的作用～构成p53基因网络～有阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组稳定等功能〔6〕。突变型p53广泛存在于肿瘤组织中～其高表达是肿瘤细胞的显著特点之一〔7〕。下调突变型p53表达可以推断冬凌草甲素在修复DNA过程中发挥了重要的作用～恢复野生型p53的正常功能,启动了肿瘤细胞的凋亡。抗癌药物作用的主要途径是诱导敏感肿瘤细胞发生凋亡〔8〕。本研究结果显示～冬凌草甲素在诱导肿瘤细胞凋亡的过程中明显下调bc1-2的表达～从而使促凋亡因子细胞色素C和凋亡诱导因子(AIF)从线粒体释放～在线粒体介导的凋亡途径中诱导细胞凋亡～或者在阻断Fas间接信号传导途径中诱导细胞凋亡～从而为研究移植瘤细胞凋亡提供数据。 【参考文献】 1张典瑞,任天池.冬凌草甲素的药学研究进展〔J〕.中国药学杂 志,2003;38(11):817. 2张春玲～吴立军.冬凌草甲素通过激活caspase诱导HeLa细 胞凋亡〔J〕.国药理学通报,2003;15(5):521-5. 3Liu JJ～Huang RW～Lin DJ～et al.Oridonin-induced apoptosis in leukemiaK562 cells and its mechanism 〔J〕.Neoplasma～2005;52(3):225-30. 4薛宏伟～潘祥麟～杨尚军.冬凌草甲素诱导GBC-SD细胞凋亡 及对bcl-2～p53～fas/apo-1和c-myc表达的影响〔J〕.山东大学 学报(医学版)～2005;43(4):336-9. 5吴兆华～蔡明磊～吴立军.冬凌草甲素抗肿瘤活性及构效关系 研究进展〔J〕.中国现代中药～2008;10(5):5-7. 6张俊峰～陈规划～陆敏强.冬凌草甲素对人肝癌BEL-7402细 胞的增殖抑制作用研究〔J〕.中华肿瘤防治杂志～2006;13(15): 1131-3. 7Hausmann G.Pro-apoptotic apoptosis protease-activating factor (Apaf-1)has acytoplasmic localization distinct from Bcl-2 or Bcl-xL〔J〕.J Cell Biol～2000;149(3):623-34. 8吴婕～袁守军～杨德宣.冬凌草甲素抑制BGC823细胞的生长 及MMP-2M MP-9的表达〔J〕.解放军药学学报～2007;23(5):344-7. 转贴于