细胞爬片免疫组化细胞爬片免疫组化
固定液配方(细胞免疫组化,用的是4%多聚甲醛固定的):我们用的4%多聚甲醛是先配制成12.5%的,然后再用0.1m PB稀释的。
0.1m PB配方(PH值7.4)1000ml
磷酸氢二钠 48.693g
磷酸二氢钠 5.023g
三蒸水 1000ml
12.5%多聚甲醛(PH值7.4)1000ml 多聚甲醛 125g
三蒸水 1000ml 磁力搅拌器加热搅拌,温度控制在60?以下,如仍不溶,加NaOH
(三蒸水先放800ml,10小时左右,再补加200ml)
4%多聚甲醛(PH值7.4)10...
细胞爬片免疫组化
固定液配方(细胞免疫组化,用的是4%多聚甲醛固定的):我们用的4%多聚甲醛是先配制成12.5%的,然后再用0.1m PB稀释的。
0.1m PB配方(PH值7.4)1000ml
磷酸氢二钠 48.693g
磷酸二氢钠 5.023g
三蒸水 1000ml
12.5%多聚甲醛(PH值7.4)1000ml 多聚甲醛 125g
三蒸水 1000ml 磁力搅拌器加热搅拌,温度控制在60?以下,如仍不溶,加NaOH
(三蒸水先放800ml,10小时左右,再补加200ml)
4%多聚甲醛(PH值7.4)1000ml
12.5%多聚甲醛 320ml
0.1m PB 680ml
步骤:
41 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中,按2*10/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片,5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。 2 PBS清洗标本 3次 各 1 min。
3 冰丙酮固定 15 min。
4 空气干燥 5min。
5 PBS清洗标本 3次 各 2 min。
6 0.5%Triton X-100( DPBS配 ) 孵育 1次 20 min。 7 PBS清洗标本 3次 各 2 min。
8 3%H2O2孵育 15 min。
9 DPBS清洗标本 3次 各 2 min。
10 封闭血清孵育(5%正常二抗血清DPBS液) 20min。 11 一抗孵育(PBS配,滴度1:200,湿盒)4OC 过夜或37OC 60 min。阴性对照最好用一抗来源血清,否则用PBS液
12 PBS清洗标本 3次 各 5 min。
13 二抗工作液孵育(湿盒) 37OC 30 min。
14 PBS清洗标本 3次 各 5 min。
O 15 C液(湿盒) 37C30 min。
16PBS清洗标本 3次 各 5 min。
17DAB显色(避光,镜下观察至棕色 ) 约3~10min。 18蒸馏水洗 2次 1 min。
19苏木素复染 0.5~1min。
20自来水洗 30min。
21树胶封片。
注意事项:
1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础,要获得良好细胞爬片须注意以下:
(1) 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上,这样细胞爬片才较牢固,冲洗时不易
脱片;
4(2) 接种的细胞密度适中,以2*10/ml为宜,若细胞密度太高,5天后细胞连接成片冲洗时易脱片;
O2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4C冰箱,冰丙酮固定时会使细胞收缩,可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。
3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿,(不可用吸管太用力吹,易脱片) 4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜
5、Triton X-100(屈立通)表面活性剂,脱去细胞膜中最主要的成分脂质,对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用,对于抗原表达在胞浆者时间要控制好,使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。
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