神经生长因子对兔视神经挫伤修复的影响

神经生长因子对兔视神经挫伤修复的影响 陕西医学杂志2006年12月第35卷第12期 ? 论着?临床研究? 神经生长因子对兔视神经挫伤修复的影响 1571 江苏省南通大学附属医院眼科(南通226001)程新梁管怀进陆志荣张天一?鄂群? 摘要目的:研究神经生长因子(NGF)对成年兔视神经(oN)挫伤后修复的影响.方 法:通过逐级暴露钝性分离钳夹视神经法建立兔视神经挫伤模型,并向玻璃体腔内注入 NGF-I31~g(右眼,治疗组),或磷酸盐缓冲液(PBS)0.1m1(左眼,对照组).挫伤后2周,4周 时分别用光镜,电镜和TUNEI技术观察视网膜神经节细胞(RGCs),视网膜神经纤维层和 视神经的改变并作视神经纤维计数.结果:兔视神经挫伤可使RGCs数量减少,表现出细胞 坏死,凋亡的特征.视神经病理改变主要是轴突较正常稀疏,部分轴突明显肿胀,空泡变性, 轴突与髓鞘间有腔隙形成,髓鞘结构紊乱,出现板层分离.NGF治疗组与对照组相比,前者 RGCs,视神经纤维的退变较轻,数量较多,神经纤维有再生现象.同时发现治疗组4周比2 周的神经纤维计数明显减少.结论:NGF能够在一定程度上防止轴突的变性坏死,从而阻断 因轴突变性而激发RGCs死亡,并促进视神经纤维的再生. 主题词视神经损伤神经调节蛋白1再生动物,实验兔 EffectofNGFonpromotingrepairofoptic nervecontusioninadultrabbits DepartmentofOphthalmology,AffiliatedHospital,NantongUniversity (Nantong226001)ChengXinliangGuanHuaijinLuZhirongetal ABSTRACTObjective:T0studytheeffectofnervegrowthfactor(NGF)onrepairofopticnerve contusioninadultrabbits.Methods:AftertheadultrabbitopticnervewascontusedNGF-131~g(righteye, treatedgroup),and0.1mlofPBSlmg/ml(1efteye,controlledgroup)wereimmediatelyinjectedintothe vitreousofinjuredeyesrespectively.thenretinalganglioncells(RGCs),nervefiberand,opticnervewere examinedbymicroscope,electronmicroscopeandTUNELmethod2weeksand4weeksaftercrush.A computerimageanalysiswasusedtocounttheopticnerveaxons.Results:Dyingganglionceilsexhibited morphologicfeaturesofapoptosisandnecrosis.Opticnerveshowedaxonswelling,confusedstructureof myelinsheath,detachmentofaxolemma.RGCsandopticnervedegenerationinNGFtrtedgroupwas lighterthanthatincontrolledgroup,axonregenerationwasseenintreatedgroup.TheNGFtreatedgroup hadmoreopticnerveaxonsthaimtrolledgroup.ThenumberofopticnerveaxonsinNGFtreatedgroup in4thweekafterinjurywaslessthanin2thweek.Conclusion:NGFcanpreventaxondegenerationtO certainextent,breakacascadeofRGCsdeathbyaxonalinterruptionandimprovetheregenerationof aXons. KEYWORDSOpticnerveinjuriesNeuregulin一1RegeneratationAnimalslaboratory Rabbits ※江苏省"青蓝工程"跨世纪学术带头人科研基金(基金编 号:980002) ?南通大学基础医学院 视神经(Opticnerve,ON)挫伤是临床上常见 的眼外伤之一,损伤的确切机J及病理过程尚不 清楚,治疗十分棘手,病人往往丧失视功能.随着 1572陕西医学杂志2006年12月第35卷第12期 近十几年神经科学的研究发展,促进视神经损伤 后的存活及再生已成为基础和临床研究共同关注 的课题. 视神经再生,其实质是视网膜神经节细胞 (Retinalganglioncells,RGCs)轴突的再生.本研 究通过建立兔视神经挫伤模型,玻璃体腔内注入 神经生长因子(Nervegrowthfactor,NGF)的方 式,采用组织病理学,分子生物学观察NGF 与RGCs的相互作用及其对残留轴突再生的影 响. 材料和方法 1材料NGF哉TUNEL试剂盒, Converter—POD覆盖液购自Boehringer MannheimBiochemica公司,DAB系瑞典Fluka 产品.白色健康成年家兔28只,南通大学实验动 物中心提供,每只重2.5,3.0kg,雌雄不限,常规 眼前后节检查无异常. 2方法 2.1动物模型制作及NGF应用先选取 16只动物随机分为2周组和4周组,每组8只动 物.另选用12只家兔作正常对照.16只动物选每 只动物的右眼注入NGF,左眼为对照眼.3%戊巴 比妥钠按lml/kg经兔耳缘静脉注射,麻醉动物, 0.5地卡因表面麻醉.置开睑器,庆大霉素结膜 囊冲洗.我们采用自行设计的逐级暴露,钝性分离 法的具体操作步骤是:在无菌条件下,沿角巩缘剪 开12时至6时处的颞侧球结膜,分离筋膜囊,暴 露上,外直肌.用斜视钩钩住二直肌,将眼球向内 下方牵引.用棉签进一步小心分离筋膜囊,暴露眼 球缩肌.用虹膜恢复器向两侧分开外侧和上方眼 球缩肌,避开睫状血管,必要时予棉签向鼻下方轻 压眼球,即可见视神经.在视神经距眼球后方 5mm处用12.5cm眼科蚊钳钳夹视神经(上紧两 齿,维持10s,见图1)后自颞上方角膜缘后2ram 向玻璃体腔中后部视网膜前方在经瞳孔直视下缓 慢注入含有NGF—的混合液0.1ml(将lO#g NGF—冻干粉剂溶于磷酸盐混合液lml中,使每 0.1ml中含有NGF—p1g,治疗组);左眼手术方法 同右眼,术后玻璃体腔内注入不含NGF—p的磷酸 盐混合液0.1ml(对照组).12只动物正常对照眼 以同样方法手术暴露,但不致伤视神经(空白对照 组).待动物清醒后观察瞳孔对光反射,凡瞳孔对 光反射消失,直径大于4mm者用于本实验,上述 实验过程由同一人在无菌条件下完成.术毕庆大 霉素再次冲洗结膜囊,金霉素眼膏涂布双眼.术后 每天0.25氯霉素眼水滴眼6次.实验中家兔36 只72眼均无明显眼球内,眼眶内感染现象. 2.2标本取材方法动物按存活时间不同 分别在2周和4周时予空气栓塞法处死,随即迅 速摘下眼球(摘除的眼球包含长约1O,12mm的 球后视神经).在治疗组,对照组中,各随机选取2 只眼球连同视神经送光学显微镜检查;每组余下 的6只眼球将视神经在出眼球处离断,所有视神 经制作成电子显微镜标本,眼球中的3只制作成 电子显微镜标本,另3只制作成光学显微镜标本. 再随机选取6只正常空白对照眼,4只制作成电 子显微镜标本,2只制作成光学显微镜标本. 2.3标本制作方法?光镜标本制作方 法:眼球固定液固定24,72h后,将眼球沿角膜 顶点与视盘鼻侧缘的连线剖成两半球,再将颞侧 半球进行酒精梯度脱水,包埋,切片,苏木素一伊红 (HE)染色.?电镜标本制作方法:4戊二醛固定 后修理视网膜及视神经出眼球壁处,距球后5mm (损伤处),7mm处,制作成约2×1.5mm大小的 组织块.二甲砷酸钠缓冲液漂浮,19/6锇酸后固定, 酒精梯度脱水.Epon812包埋,LKB—V超薄切片 机作视神经,视网膜组织块超薄切片,片厚5O0, 700A.,醋酸铀和枸橼酸铅双重染色.?细胞凋亡 检测方法:运用TUNEL试剂盒检测凋亡细胞, DAB染色.以地塞米松诱导的裸鼠胸腺皮质部淋 巴细胞凋亡模型作为本组实验的阳性对照,阴性 对照组中不加TdT或在滴加TUNEL反应液后 不加Converter—POD,两者光镜下均无阳性物质 出现.?视神经纤维计数方法:按电镜标本制作方 法处理标本.LKB—V型超薄切片机作视神经横断 面(出眼球壁处)的半薄切片,片厚约1m.0.1 甲苯胺蓝染色,室温下干燥.米用CMM一302T病 理远程会诊工作站系统中的由北京航空航天工业 大学图像中心研制的计算机自动图像分析系统作 神经纤维计数,每组计数6张切片,每张切片计数 6个视野,取其平均数. 3统计学处理全部实验数据输入计算机, 以SAS统计软件包处理,数据以?S表示,采用 两组均数比较的t检验和成组配对资料比较的t 陕西医学杂志2006年12月第35卷第12期 检验作统计分析.以P<O.001为有显着性差异. 结果 1光镜观察 1.1正常兔眼兔视网膜RGCs排列较为整 齐和密集,呈圆形或卵圆形,胞核清楚,核仁明显, 胞浆丰富,均质,各层视网膜间界限较为清楚. TUNEL染色未见阳性细胞.视神经纤维排列整 齐,间隔匀称,胶质细胞长轴与神经纤维走向一 致,呈极性排列.神经纤维数量为28962士915.2 根/mm. 1.2视神经挫伤眼?视神经挫伤后2周 视网膜RGCs数量较正常减少,部分胞体肿胀,边 缘不清,出现染色质边聚,核周空晕.TUNEL染 色未见明显阳性细胞,NGF治疗组与对照组相 比,前者RGCs的数量较多,具有坏死,凋亡特征 的节细胞数目较少(见图2,图3).神经纤维排列 较紊乱,胶质细胞失去极性排列的特征.NGF治 疗组与对照组相比,神经纤维结构较紧密,纤维间 空泡变性的程度较轻.神经纤维计数NGF治疗组 为18204士1062.5根/mm,对照组为9732士 810.O根/mm.表明治疗组有较多的神纤维存在 (见图4,图5).?视神经挫伤后4周与视神经挫 伤后2周组相比,RGCs形态相似但数量进一步 减少,TUNEL染色未见阳性细胞.NGF治疗组 与对照组相比,前者RGCs数量较多.与视神经挫 伤后2周组相比,神经纤维结构疏松,空泡变性进 一 步加剧.NGF治疗组与对照组相比,纤维排列 较致密,纤维间空泡变性的程度较轻.神经纤维计 数NGF治疗组为10076士1296.9根/mm,对照 组为3845?659.8根/mm,表明NGF治疗组残 留的神经纤维较多. 1573 2电镜观察 2.1正常兔眼RGCs呈卵圆形,胞浆中 有较多的线粒体,粗面内质网,高尔基复合体和多 聚核糖体,神经纤维层内可见均匀排列的微管,微 丝和线粒体.正常视神经轴浆均匀,轴突内微管, 微丝丰富,可见线粒体,轴突外包裹着细板层致密 的完整髓鞘,轴突与髓鞘间无空隙. 2.2视神经挫伤眼?视神经挫伤后2周 视网膜上部分RGCs变性,表现为线粒体肿胀,内 腔有絮状致密物,另有一些线粒体,粗面内质网崩 解.部分RGCs胞浆固缩,染色质边聚,表现为细 胞凋亡(见图6),神经纤维层内见轴突内容崩解 消失,NGF治疗组可见部分形态正常的轴突.视 神经轴突较正常稀疏,部分轴突明显肿胀,轴浆电 子密度低,微管,微丝数量减少,线粒体肿胀,双层 膜结构不清,部分嵴消失,个别空泡变性,轴突与 髓鞘间有腔隙形成,髓鞘结构紊乱,出现板层分 离.NGF治疗组与对照组相比,前者轴突密度明 显增大,变性较轻.在视神经损伤处远端,NGF治 疗组可见细胞内髓鞘包裹轴突,形成薄髓神经纤 维,即出现再生的视神经纤维.?视神经挫伤后4 周视网膜RGCs形态与2周时相仿,神经纤维层 内见轴突内容崩解消失,部分轴膜肿胀,破裂,部 分轴突内有絮状物.视神经出眼球处轴突髓鞘形 态与2周时相似,部分轴突空泡状变性,退变形似 蜂窝.NGF治疗组与对照组相比,前者退变程度 相对较轻(见图7,图8). 3神经纤维计数视神经纤维计数结果见 附表. 附表兔视神经纤维计数(士s,根/mm) 2周时的空白对照组与NGF治疗组,对照组 相比,神经纤维计数有明显差异(P<O.001),说 明视神经挫伤组神经纤维数量显着减少.NGF治 疗组与对照组相比,神经纤维计数差异有显着性 (P<O.001),说明NGF可有效减轻视神经挫伤 后的神经纤维退变.NGF治疗2周组与4周组相 比,神经纤维计数差异亦有显着性(P<O.001), 说明NGF作用可能随着时间的延长而逐渐减弱. 1574陕西医学杂志2006年12月第35卷第12期 图1暴露并钳夹视神经(十)图4NGF治疗组视神经挫伤后2周,视神经横断面:见 大量神经纤维(十)密集,呈环状.甲苯胺蓝染色x320 图2NGF治疗组视神经挫伤后2周:RGCs数量较正常 减少,部分细胞形态正常,部分胞体肿胀,边缘不清,染色图5对照组视神经挫伤后2 周,视神经横断面:神经纤 质边聚(十).HE×320维(十)排列较为稀疏.甲苯胺蓝染色×320 im,,,,一 ?- _二.:, 图3对照组视神经挫伤后2周:RGCs数量较治疗组减 少,部分胞体肿胀,边缘不清,出现染色质边聚,核周空晕 (十).HE×220 图6NGF治疗组视神经挫伤后2周,RGCs电镜图片: RGCs胞浆固缩,染色质边聚(十),表现为细胞凋亡.电镜 ×16000 陕西医学杂志2006年12月第35卷第12期 图7NGF治疗组视神经挫伤后4周,视神经出眼球处 的电镜图像:部分轴突形态正常(十).轴突与髓鞘间有腔 隙形成.髓鞘结构紊乱,出现板层分离(十).电镜×10000 图8对照组视神经挫伤后4周,视神经出眼球处的电镜 图像:轴突空泡状变性(十),形似蜂窝.电镜×6000 讨论 NGF是最早发现和研究的神经营养因子,大 多数学者认为NGF对RGCs具有一定的保护作 用q].本实验应用的由鼠颌下腺提取,纯化的 NGF由a,p,7三个亚单位以非共价键构成,其中 具有生物活性的为p亚基(NGF—p).我们将 NGF—p直接注入玻璃体腔,可以发现2周,4周时 NGF治疗组RGCs数量减少较对照组缓慢,2周, 4周时的神经纤维计数显着高于对照组,说明视 神经损伤后应用NGF可有效阻止轴突继续变性, 从而减慢RGCs退变速度,提高RGCs存活.NGF 对RGCs及视神经保护作用的机制可能为: 1所有哺乳动物的RGCs及视神经远近端 均有NGF受体mRNA表达_4],这使得NGF可在 神经纤维中顺行或逆行运输,一旦外界因素使轴 1575 浆流中断,RGCs必将失去NGF及其它神经营养 因子的信号调节而发生损害.加入外源性的NGF 通过与其特异性的受体结合,促进了轴突内视神 经损伤后修复和再生所需的结构和功能物质的合 成,在一定程度上防止了轴突的变性坏死,从而阻 断了因轴突变性而激发的RGCs死亡. 2NGF与RGCs上的受体相结合,通过抑 制活性细胞的死亡程序来提高RGCs的存活 率.交感神经元,副交感神经元,感觉神经元 的体外培养实验发现,NGF可阻止细胞表达一些 死亡基因,抑制细胞毒性分子的活性,而这些毒性 基因往往在RGCs被切断轴突后的12h出现,并 在20h合成相应的蛋白质.同时NGF还可稳定 细胞内Ca.离子的浓度,抑制因Ca.离子浓度的 增加而导致的细胞凋亡. 3因NGF保护而存活的RGCs可合成并通 过轴浆转运视神经损伤后修复和再生所需的结构 和功能物质,促进损伤轴突的修复,再生. 本研究再次证实了NGF对RGCs具有保护 作用,但如何促进残留轴突再生并与大脑中枢视 皮质形成突触联系恢复视功能尚待进一步探索. 参考文献 1CarmignotoG,MaffeiL,CandeoP,etalEffectof NGFonthesurvivalofratretinalganglioncells followingopticnervesection.JNeurosci,1989;9(4) l1263 2蒋永祥综述,郭希让审校.神经生长因子细胞保护作 用的应用研究进展.眼科研究,2002;20(1):83 3孙志敏,管怀进,程新梁,等.神经生长因子对成年 兔视神经夹伤后修复的影响.中华眼底病杂志, 2005I21(4):253 4LeviMontalcinR,HamburgerV.Selectivegrowth , stimulatingeffectsofmousesarcomaonsensoryand sympatheticnervussystemofthechickembrys.J ExpZool,1951;116:321 5HaminesHP,FederoffHJ,BrownleeM.Nerve growthfactorpreventsbothneuroretinalprogrammed celldeathandcapillarypathologyinexperimental diabetes.MolMed,1995;1(5):527 6RabacchiSA.BonfantiL,LiuXH,eta1.Apoptotic celldeathinducedbyopticnervelesionintheneonatal rat.TNeurosci.1994;14(9):5292