植入前诊断中胚胎活检的动物实验研究（可编辑）

植入前诊断中胚胎活检的动物实验研究（可编辑） 植入前诊断中胚胎活检的动物实验研究 维普资讯 ////0>. 中国优生与遗传杂志年第 卷第 期 植入前诊断中胚胎活检的动物实验研究 陈欣洁,孙筱放,廖宝平.张文红.陈元本 广州医学院附属市二人民医院妇产科研究所,广州。 摘 要: 目的 以小鼠胚胎为材料进行植入前胚胎活检的研究。方法 通过输卵管冲洗,获得 ~ 细胞期胚胎 .用 “ 一 ”字机械法、化学法和激光法分别对 、 细胞的胚胎进行活检,观察其囊胚形成及孵出情况并进行比较。结果 “一”字机 械法、化学法、激光法胚胎活检后胚胎的囊胚形成率、囊胚孵出宰与未活检对照组比较无显著性差异 , 。“一”字机 械法与化学法、激光法的囊胚形成率有显著性差异 , 、囊胚孵出率无显著性差异 . 。化学法与激光法的囊 胚形成率、囊胚孵出率均无显著性差异 ,。 回归分析明:细胞数越多越有利于胚胎进一步发育。结论 用 “ 『”字机械法进行单个卵裂球活检,不影响胚胎的进一步发育,是一种较好的胚胎活检方法。 关键词:植入前;活组织检查;胚泡 中图分类号:. 文献标识码: 文章编号:? ? ?.? , ? , ? , ? , ? , & , ?, , :: .:? ? 一 , . . : ? , ., 一 ?, 一, . : ?一 一 . : ; ;.激光打孔:采用 公司 ? 植入前遗传学诊断 ,的激光系统。 是产前诊断的一个非常早期的形式,它对早期胚胎进 .胚胎活检的培养基:一般操作采用无 /行显微操作,经遗传学诊断,只移植正常胚胎。这样在植入 公司出品 及改良的拟人输卵管液, 前便去除了携带有严重遗传病的胚胎。年第一例植入 前遗传学诊断的胚胎出生?。目前,可用于诊断公司出品 。培养采用 . ? 公司出品。 多种遗传病【。由于用人胚胎进行研究存在伦理的限制, 为此,本研究以小鼠胚胎为材料探讨“一”字机械法胚胎活检 二、方法 .早期胚胎的获取:左右雌性昆明小白鼠用孕马血 对早期胚胎进一步发育的影响,并与常用的化学法和激光法 清 和促排卵后,与雄性昆明小白鼠交配。有阴 比较,以其安全性及其在中的应用价值。 道栓者为交配成功,记为 。时杀鼠,冲洗输卵管,获 材料与方法 得 ~ 细胞阶段的早期胚胎。 一 .实验分组: 机械法:共收集 细胞及 细胞早期胚 、材料 胎各 个、个。其中 细胞胚胎用于活检 个,未活 .实验动物:昆明系白小鼠清洁级,购自广州医学院 检为 个: 细胞胚胎活检 个,未活检 个。 化 .显微操纵:胚胎活检在 倒置显微镜下进行,使 学法:共收集 细胞及 细胞早期胚胎各 个、 个。其 用 公司 的显微操作系统。 中 细胞胚胎用于活检 个,未活检为 个; 细胞胚胎 .显微操作针的准备:胚胎活检需要 种针: 活检 个,未活检 个。 激光法:共收集 细胞及 持卵针:, 用于吸住胚胎; . 细胞早期胚胎各 个、个。其中 细胞胚胎用于活检 透明带钻孔针尖头,机械法;,化学法 用于透明个,未活检为 个; 细胞胚胎 活检 个,未活检 带钻孔; 吸取针,斜 用于取出卵裂球。维普资讯 ////.? 中国优生与遗传杂 志年第 卷第 期 个。 活检成功率为 . % / 。化学法的 细胞活检成功 .胚胎活检:胚胎活检前在无的中孵 率为 . % /; 细胞活检成功率为 . %/ 育. ?,使细胞连接松弛,易于活检引。机械法: 。激光法的 细胞活检成功率为 . % /; 细 用 针将胚胎定位,用透明带钻孔针在透明带上作 胞活检成功率为 . % / 。 “ 一 一 ”字形切口 ,然后将孔放在 点钟的位置,用吸取针轻 、机械法、化学法和激光法的 、 细胞期胚胎的囊胚 轻地吸出卵裂球,检查核。 化学法引:用针将胚 形成率、囊胚孵出率比较 胎定位.需活检的卵裂球放在 点钟的位置。透明带钻孔针 机械法和化学法活检的 、 细胞期胚胎囊胚形成率及 靠近透明带,排出酸。进行钻孔。然后用吸取针轻 囊胚孵出率分别与未活检对照组相比无显著性差异 轻地吸出卵裂球,检查核。 激光法】:用 针将胚 . 。活检 细胞期胚胎囊胚形成率与活检 细胞期胚胎囊 胚形成率相比有非常显著的差异.;未活检或 胎定位,然后用激光在 点钟的位置打一个孔.用吸取针轻 轻地吸出卵裂球,检查核。 细胞期胚胎囊胚形成率与未活检 细胞期胚胎囊胚形成率 .胚胎培养、观察:活检完成后,胚胎应立即放回相应的 相比均有显著性差异 . 。 培养皿中。然后放入培养箱中 %、 ?培养箱中孵育 激光法活检的 细胞期 胚胎囊胚形成率及囊胚孵出率 分别与未活检对照组相比并无显著性差异 .。未 后观察。 活检或活检的 细胞期胚胎的囊胚形成率与相应 细胞期胚 三、统计学方法 原始数据用. 软件处理,进行 胎的囊胚形成率相比均有非常显著的差异 .;活 检验分析;并用 回归分析方法分析细胞数、是否活 检、活检方法机械法、化学法和激光法 个因素对胚胎发育 检的 细胞期胚胎的囊胚孵出率与活检的 细胞期胚胎的囊 胚孵出率相比有显著的差异.;未活检的 细胞期 潜能的影响程度。 胚胎的囊胚孵出率与未活检的 细胞期胚胎的囊胚孵出率 结 果 相比元显著的差异.见表 。 机械法的 细胞活检成功率为 . % /; 细胞 表 机械法、化学法和激光法 、 细胞期胚胎的囊胚形成率、囊胚孵出率比较 注: 细胞或 细胞活检与未活检组比较.无显著性差异; 细胞与 细胞相应组比较. . . ~. 二、机械法、化学法及激光法的 、 细胞期胚胎的囊胚 表 机械法、化学法与激光法的 、 细胞 形成率、囊胚孵出率比较机械法与化学法、激光法的 细 囊胚形成率、/ :: 些墼 胞期胚胎相应的囊胚形成率及囊胚孵出率、 细胞期胚胎相 应的囊胚孵出率之间无显著性差异 .;机械法与化 学法、激光法的 细胞期胚胎相应的囊胚形成率之间有显著 性差异 . 。化学法、激光法的 、 细胞期胚胎相应的 囊胚形成率及囊胚孵出率之间无显著性差异. 见 表 。 三、 回归分析 用回归分析方法分析了 细胞数、是否活检、活检方法 机械法、化学法和激光法 个 注:多组问比较.均无显著性差异;机械法与化学法或激光法的相 因素对胚胎发育潜能的影响程度。结果表明,在 个协变量 应组比较. 。. 中.按 , 检验水准,仅有细胞数对胚胎发育潜能影响显维普资讯 ////. 中国优生与遗传杂志 年第 卷第 期 著, . ;回归系数一 .;协变量细胞数的 . %,囊胚孵出率为 . %; 细胞期 的胚胎囊胚形成率. ,可认为细胞数越多越有利于胚胎进一步发育;而是 为 . %,囊胚孵出率为 . %。分别与未活检对照组相 否活检与活检方法对胚胎发育潜能无显著影响 见表 。 比并无显著性差异 . 。本文还采用 ’。酸化 表 回归分析结果 学法和激光法进行早期胚胎活检。化学法 细胞期胚胎的 囊胚形成率为 . %,囊胚孵出率为 . %; 细胞期胚胎 的囊胚形成率为 . %,囊胚孵出率为 . %。分别与未 活检对照组相比并无显著性差异 . 。激光法 细 胞期胚胎的囊胚形成率为 . %,囊胚孵出率为 . %; 细胞期胚胎的囊胚形成率为 . %,囊胚孵出率为 . %。 分别与未活检对照组相比并无显著性差异 .。机 注:在 个协变量中,按 . 检验水准。仅有细胞数对胚胎发育潜 械法与化学法、激光法的 细胞期胚胎相应的囊胚形成率及 能影响显著, .;回归系数一 .;协变量细胞数的 囊胚孵出率、 细胞期胚胎相应的囊胚孵出率之间无显著性 .,可认为细胞 数越多越有利于胚胎进一步发育;而是否活 差异 . ;机械法与化学法、激光法的 细胞期胚胎 检与活检方法对胚胎发育潜能无显著影响。 相应的囊胚形成率之间有显著性差异 . 。化学法、 讨 论 激光法的 . 细胞期胚胎相应的囊胚形成率及囊胚孵出率 一 之间无显著性差异 . 。结果表明,我们采用的“一” 、胚胎活检 胚胎活检是技术的难点之一。它 字机械法对 、 细胞胚胎进行活检并不影响早期胚胎的进 是运用显微操作技术从早期胚胎中取出遗传物质,然后将所 一 步发育,是一种较好的胚胎活检方法,与目前常用的化学 取的极体或单个卵裂球固定在玻片上或放入 管 法、激光法相比, 细胞期胚胎的囊胚形成率显著增加.其余 中,用于种植前遗传学诊断。一种安全、有效的胚胎活检方 指标均无显著性差异。 法对于的成功十分重要。胚胎活检首先不可损伤胚 本研究还采用 回归分析方法分析了细胞数、是 胎,否则即使单细胞遗传学检测技术再完善并获得了相应的 否活检、活检方法 机械法、化学法和激光法 个因素对胚胎 结果,而胚胎由于活检致死,无从进行。此外,所取出的 发育潜能的影响程度。结果表明,在这 个协变量中,按 . 单个卵裂球及细胞核必须完整。否则无法检测。 检验水准,仅有细胞数对胚胎发育潜能影响显著 】 . 二、主要的胚胎活检方法 包括化学法、机械法、激光 ;而是否活检与活检 方法对胚胎发育潜能无显著影响。 法。化学法是目前最常用的胚胎活检方法【,它主要是用 由此可见,机械法有很大的临床应用价值。其中,机械法活 酸或降解透明带 上糖蛋白基质以在透明带 检后 细胞期的胚胎囊胚形成率可达 . %,可见,技术熟 上钻孑 。优点是操作比较简便,容易掌握。缺点是开口大小 练的机械法可以保证高囊胚形成率。胚胎活检技术熟练完 难控制,卵裂球易脱出;喷酸可造成卵裂球溶解或损伤,从而 全可以保证胚胎活检不损伤胚胎.为在临床应用的成 影响胚胎的发育潜能。激光法具有精确、简便及非接触性等 功提供了保障。是进一步推广的前提。 优点,已应用于极体和卵裂球期的胚胎活检,引。但是目 三、胚胎活检的时机 理论上来说,胚胎活检可以在 前仍有许多学者担心激光打孔可能有潜在的热效应,影响卵 细胞至囊胚期的任何阶段进行,甚至可以在更早阶段对极体 子或胚胎的发育。机械法不存在使用化学物质对胚胎的潜 活检进行活栓。为了选择一个对胚胎损伤最小、取出卵裂球 在毒性,也没有激光所带来的潜在的热效应。用机械法进行 最多的时机.人们进行了许多研究。有实验表明,人类胚胎 胚胎活检有几种不同的方法。一是用一根斜口针直接进行 经活检取出/ 、 / , / 个卵裂球并不影响在体外继续发 透明带穿刺,这种方法已应用于第一及第二极体的活检。。。 育至囊胚阶段的能力【】。但是,也有研究认为,从? 细胞 另一种方法是在透明带上作一“ ”字形切口,可用于极体及 胚胎取出 个卵裂球与仅取出一个卵裂球相比,着床能力降 卵裂球活检。有人用“ ”字机械法与化学法进行比较, 低】。人类胚胎活检的最好时机是 细胞期,大多数人类胚 发现其囊胚形成率低于化学法】。我们所采用的机械法胚 胎完成前 次卵裂所需时间约为 个小时。此时,胚胎所 胎活检是用一根尖的无开口的细针在透明带上磨一条裂 有的卵裂球仍是全能的,且卵裂球尚未粘连。但是因为卵裂 缝【. 】,裂缝的大小取决于细针穿过透明带时第一点与第二 球活检导致内细胞团细胞的减少,而胎儿是由内细胞团衍生 点之间的距离。这种方法简单、快速熟练时只需 打一个 而来,因此要慎重考虑着床后的负面影响。本文的结果表 孔 、活检效率高;对胚胎损伤小;且操作者可以根据自己的 明,机械法、化学法中未活检 细胞期的胚胎囊胚形成率与 需要在透明带的不同部位进行切割从而得到不同口径的透 未活检 细胞期的胚胎囊胚形成率相比有显著性差异 明带开口;此外由于透明带上是一条裂缝,活检后很容易主 .:活检 细胞期的胚胎囊胚形成率与活检 细胞期的 动关闭.这对于胚胎的生长发育十分有利。本文采用此机械 胚胎囊胚形成率相比有非常显著的差异 .。激光 法分别对雌性昆明小白鼠 、 细胞的胚胎进行活检,为了适 法中未活检 细胞期的胚胎囊胚形成率与未活检 细胞期 应“一”字切口,还对显微操作针进行了改良,采用斜口以便 的胚胎囊胚形成率、活检 细胞期的胚胎囊胚形成率与活检 于吸取卵裂球。结果可见, 细胞期的胚胎囊胚形成率为