齐口裂腹鱼维氏气单胞菌的耐药性分析

齐口裂腹鱼维氏气单胞菌的耐药性分析 第卷第期印. 。??~。报。自然 学版 西南民族大学学 .. :./... 齐口裂腹鱼维氏气单胞菌的耐药性分析 苟小兰,王利,刘港彪 .西南民族大学生命科学与技术学院,动物遗传育种学国家民委.教育部重点实验室,四川成都: .复旦大学生命科学学院,上海 摘要:采用.法检测分离自齐口裂腹鱼的维氏气单胞菌对种抗菌药物的耐药表型,用法扩增维氏气单胞菌 的四环素类、、,氨基糖苷类 .、’.、”、.、磺胺类、、共 种耐药基因.结果显示:氟哌酸、氟苯尼考、磺胺异恶唑等种药物对维氏气单胞菌有较好的抑菌效果.该菌对磺 胺类和部分氨基糖苷类敏感,相关耐药基因也未检出,只有四环素类的基因被检出.药敏试验结果和耐药基因检测 结果基本一致,这能为维氏气单胞菌的防治和耐药机理的研究提供参考. 关键词:维氏气单胞菌:耐药基因;药敏试验:齐口裂腹鱼 .中图分类号: 文献标识码: 文章编号: .. 近年来,由于抗生素的大量使用,病原茵的耐药性逐渐增强,抗生素的药效及动物机体的抗病力日益下降, 动物产品及环境中抗生素残留危害人类健康问也越发严重.目前,每种抗生素在临床的使用上都有其抗性细菌, 多重耐药菌株也普遍存在,甚至出现了“超级细菌”?.抗生素抗性基因 ,的存 在是细菌产生耐药性的根源.的长期残留及其在菌群问的水平转移和传播,对环境和人类健康造成严重的 威胁?.因此,对细菌的耐药性和耐药基因进行监测,在抗性菌的控制、相关疾病的防治、以及新药的研发等方 面具有重要意义. 维氏气单胞茵属一变形茵纲、气单胞茵科、气单胞菌属的革兰氏阴性茵,是人、家畜、水产动物等相关疾 病的致病原.气单胞菌广泛分布在淡水、有机污泥、污水及动物体中,能引发人的伤后感染、肠胃炎甚至脑膜 炎掣.因其在水体中广泛分布,也常引起鱼类的出血性败血症、皮肤溃疡等疾病。.近年来,气单胞茵耐药性 问题日趋严重,因此越来越受到关注.已有学者报道嗜水气单胞茵等对四环素类、‖内酰胺类、喹诺酮类具有耐 药性并对其耐药机理进行了分析?书】.迄今为止,鲜见有关维氏气单胞茵耐药性的研究报道.本实验室已经从齐 口裂腹鱼中分离出维氏气单胞并进行了系统发育分析??.本研究对该维氏气单胞茵菌株进行了耐药表型和耐药 基因的检测,以探讨此菌的耐药状况和耐药规律.这能为维氏气单胞茵所致鱼病的防治及其耐药分子机理的深 入研究提供科学依据. 与方法 .材料 ..菌株 齐口裂腹鱼维氏气单胞菌由本实验室分离鉴定,并以甘油茵形式保存于本实验室。超低温冰箱, 备用. ..主要试剂和仪器 收稿日期:.. 通讯作者:王利.,女,四川成都人,副研究员,从事微生物遗传学研究.:.. 基金项目:?四川省科技计划项;?中央高校优秀学生培养工程项目;?西南民族大学研究生学位点建设项目 . 万方数据 苟小兰等:齐口裂腹鱼维氏气单胞菌的耐药性分析 第期 杭州微 营养琼脂 北京奥博星生物技术有限公司,琼脂培养基 生物试剂有限公司,麦康凯琼旨 北京奥博星生物技术有限责任公司,药敏纸 片中磺胺异恶唑、 痢特灵、氟苯尼考、氟哌酸、链霉素购自杭州微生物试剂有限公司,其它购自英国公司.购自 .,,仪 ,电泳仪,凝胶成像系统 ., ,恒温培养箱上海齐欣科学仪 ,高压灭菌锅 器科技有限公司. .方法 ..药敏试验 .%无菌 药敏试验采用法,参照药品说明书,并按照进行【.挑取纯培养的单菌落到 生理盐水中,混匀后与比浊管比浊.以白纸为背景,调整浊度到.麦氏单位相当于./.用无菌棉 签蘸取菌液,均匀涂布整个营养培养基表面.待培养基表面稍干后,将药敏纸片贴于培养基表面,置于。下 小时后测量抑菌圈直径,敏感性判定参照制定的《药敏试验执行》??. ..耐药基因的扩增 依据文献设计四环素类、磺胺类、氨基糖苷类药物耐药基因的引物序列表,由上海生工生物技术有 限公司合成.采用法,用耐药基因的特异引物对细菌的耐药基因进行扩增.扩增反应体系: ., .,引物/弓物浓度均为./各;模板:单菌落,共..扩增反应条件: 四环素类:预变性。 ,变性。 ,复性。 ,延伸。 循环数为,最后延伸。 , 并且对扩增出的基因进行了退火温度的比较、。、。.磺胺类和氨基糖苷类:预变性。 ,变性 。 ,复性?,延伸?,循环数为,最后延伸?.扩增产物用%琼脂糖凝胶电泳 ,缓冲液 ,电压/. 表耐药基因引物序列 结果 .药敏试验结果 维氏气单胞菌菌株对阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、洁霉素、链霉素、头胞唑啉、氨苄青霉素具 有耐药性;对头孢拉啶、强力霉素中度敏感;对新霉素、阿奇霉素、磺胺异恶唑、磺胺甲恶唑、恩若沙星、氧氟 沙星、环丙沙星、氟哌酸等高度敏感.该菌株对种药物的药敏试验结果详见表. 万方数据 西南民族大学学报?自然科学版 第卷 注:,耐药;,中度敏感:,高度敏感 .耐药基因检测 扩增后,经电泳检测结果显示:磺胺类氨基糖苷类的相关耐药基因都未检出,四环素类只有基因 出现约的条带,与预期目标片段大小相一致图.在不同的退火温度。、 、。下,基因的 扩增条带有较小的差异,可判定。为维氏气单胞菌四环素类抗生素基因的最适温度. 图 耐药基因的、扩增产物电泳图 ::?为四环素在不司退火温度%、。、%卜扩增结果 讨论 维氏气单胞菌 是常见的人鱼共患病的病原菌.有学者曾报道该菌引起人患严重腹泻、化 脓性关节炎等,同时也是多种鱼类的致病菌?。川.本研究药敏试验结果表明该菌对广谱抗菌素类的氨苄青霉素、 阿莫西林等已产生耐药性,对磺胺类的磺胺复合物、复方新诺明及喹诺酮类的恩诺沙星、氧氟沙星等高度敏感, 万方数据 苟小兰等:齐口裂腹鱼维氏气单胞茵的耐药性分析 第期 对强力霉素和头孢拉啶中度敏感.结合有关学者的研究结果可知,维氏气单胞茵普遍对喹诺酮类药物敏感,对 磺胺类药物具有不同程度的耐药性,而对四环素类、青霉素类药物趋于耐药【.维氏气单胞菌对喹诺酮 类药物具有耐药性.这可能和菌株的分布区域、来源、及菌株本身的进化有关引.这个结果同时也表明在齐口 裂腹鱼养殖过程中出现的维氏气单胞菌感染时选择用药不能仅凭经验,而要根据耐药性监测结果,科学合理的 选药. 耐药基因可存在于染色体中,也可存在于质粒、转座子或整合子中.后者携带的耐药基因易于传播,可通过 转化、转导、接合、转座共种方式进行传递或转移,从而使细菌的多重耐药性不断增吲川.另外由于多种抗 生素的大量使用,细菌对药物的选择压力增大,或由于理化因素的综合作用,如高温诱导、辐射刺激、自身代谢 物积累等而诱发细菌产生新的耐药基因.因此,临床用药应做到科学合理,对细菌的耐药性应进行长期的监控, 尽量控制耐药趋势的发展.但是耐药菌株并不能完全消除,因此,对耐药机制的进一步的研究和掌握,将有助于 采取措施有效防止细菌耐药性的产生和传播. 技术因其快捷、微量、重复性好等特点已在分子水平研究工作中得到广泛应用.本研究采用单一 法对耐药基因进行扩增,目标单一,灵敏度较高.耐药基因检测结果显示四环素类只有基因被检出,磺胺类 和氨基糖苷类耐药基因都未检出.该结果和药敏试验结果基本一致.该菌对某些药物耐药,但未能检测到相关 耐药基因,这可能因为其耐药性由其它耐药基因决定或存在其它耐药机制.四环素类抗性由质粒介导,在众多 抗性基因中占主要地位??. 等研究维氏气单胞菌的四环素抗性基因时发现,占主 要地位,次之?川.本研究中只检测出.这些结果的差异是否会导致着细菌耐药性的差异,是否意味着不 同的耐药机制还需要进一步的深入研究.磺胺类耐药基因、“胗、常和一类整合子密切相关,细菌耐药 性可借助整合子而实现水平传播?川.勋,,曾在磺胺类耐药性气单胞菌中检出率达.%.因此,耐药基因可作 为细菌耐药性研究的一个分子标记.目前,关于气单胞茵氨基糖苷类耐药性研究报道相对较少,相关工作还有 待进行. 耐药基因检测结果的差异性,一方面可能和茵株所处环境,即药物的选择压力不同;另一方面可能是菌株 产生耐药性的途径有多种,因此对同一类药物其耐药基因的表达有所差别;再者可能因为抗药基因在茵群间的 随机传播,而使同种菌株获得不同的耐药性.本研究检测了齐裂腹鱼维氏气单胞茵的四环素类、磺胺类、氨基 糖苷类部分耐药基因,从分子水平上为该菌耐药表型作了印证,可为维氏气单胞菌的药物筛选及耐药机理研究 提供参考.下一步,将对致病菌进行多区域的、更大规模的耐药表型、耐药基因、毒力蛋白的综合性研究,从而 有利于抗生素药物的正确选用及相关疾病的防治. 参考文献: 】刘港彪,王利,王吉坤,等.齐裂腹鱼维氏气单胞菌 序列分析】.水生态杂志,,:.. 】何利君,廖利坤,袁金凤,等.团头鲂细菌性败血症的病理学研究西南农业大学学报,,:. 】张安云.细菌对氨基糖苷类药物耐药基因四重检测试剂盒研制【】.雅安:四川农业大学,. 】周万蓉.细菌对磺胺类药物耐药基因三重检测试剂盒研制.雅安:四川农业大学,. 】房海,陈翠珍,张晓君,等.中华绒螯蟹病原维氏气单胞菌的检验】.中国人兽共患病学报,,:. 】徐春燕,苏建强,鄢庆枇,等.抗生素抗性组学研究进展】.海南大学学报,,:.. 】夏青青.动物源细菌对四环素类药物耐药基因三重检测试剂盒研制【】.雅安:四川农业大学,. 龚倩,高淑琴,单晓枫,等.框镜鲤致病性维氏气单胞菌的分离鉴定】中国预防兽医学报,,:.. , . 】 , ,, . :?. . . , , ,】 .. ,,:?. , , 】 .’ .:. .: . 】 ,.,:,,:.. 】 , , .,:. .. 】 , ,万方数据