呼吸道合疱病毒感染患儿鼻咽及气管分泌物中细胞因子浓度升高

呼吸道合疱病毒感染患儿鼻咽及气管分泌物中细胞因子浓度升高 呼吸道合疱病毒感染患儿鼻咽及气管分泌 物中细胞因子浓度升高 一畸案l}荡畜,莲{啪田苫鼻团多 世界医学杂志1999,Vo1.3,No?8原着 呼吸道合胞病毒感染患儿鼻咽及 气管分泌物中细胞因子浓度升高 ElevatedCytokineConcentrationsintheNasopharyngeal andtrachaelSecretionsofChildrenwithRespiratory ,JSyncytialVirusDisease , PH. PaulSheeran,MD,HasanJafri,MDCeciliaCarubelli,MD,JesusSaavedra,M D,ChrisJohnson, BS,Ka蛐Ksisher,Phd,PabloJSanchez,MDandOctavioRamilo.MD PediatriclnfectiomDiseaseJourna1.1999.18『2:115—122 背景:呼吸遭合胞病毒(respiratorysyn~virus,RSv)是婴~hJLT呼暖道感 染最常见的致病因素. 兜症介质在RSV感染发病机制中的作用还不十分清楚.奉研究设 计:(1)了解RSV感染惠儿呼吸道分越 物中可否捡测到RANTS(激活调节,正常T细胞达厦可能分泌),巨噬细胞直性蛋白.1-a(MIP.1.a), 白细胞介素6(IL-6),白细胞介素8(IL-8)和白细胞介素10(IL一10);(2)分越物中的上述细胞因 子?襄度是否与白细胞计数,RSV浓度和疾病的严重程度相关. 方法:于1996,1997年RSV季节,我们前瞻性地研究了28例RSV感染住院患儿,其中14倒行气管 插管,14例未行气管插管.于住院1,3和5天采集气管插管忘儿鼻洗液(NW)厦气管吸取物(TA)标 本,耒行气管插管的惠儿,于住院i,3天取Nw,7例行选择性外科手术的健康儿童作对照.所有标末 作如下分析:(1)白细胞计教和分粪;(2)测量RANTES,NIP-1吨,IL-6,IL.8和1L-10浓度;(3)除对 照组外,行RSV定量培养. 结果:在RSV感染的所有患儿NW和TA中均可检测到RANTES,MIP一1IL-6,[L-8和IL一10.RSV 感染志儿分泌物中上述细胞因子浓度明显高于正常儿.NW中白细胞计数与NW中的RANTES,M1P.I.?, IL-6,IL-8,IL-10显着相关,而TA中白细胞计教与TA中的阻-6,1L.8,IL-IO和MIp.1.q显着相关.NW 中RSV浓度与其中的白细胞计数和细胞因子相关.RSV感染未行气管插管惠儿NW中白细胞计教和 帅s难度高于气管插管惠儿,TA中的RAIqTES,1L-8,IL.10与反映 RSV感染严重程度的临床表现呈 负相关. 结论:RSV惑杂惠儿NW和1_A标本中细胞因子的出现提示:这些细 胞因子参与了RSV感染的呼吸 道兜症.这 趋化细胞因子在募集细胞聚集于炎症 jl 部位上起了主要作用.根据保留的半 胱氨酸残基(c)部位的不同,这些 化学因子可分为四个亚类---.c—X-C 或a化学因子,如IL8是主要的中性 粒细胞(PMNS)趋化因子,c.c或口 化学因子,如RANTES和MIP.1.?(巨 噬细胞炎性蛋白一l一伍)是嗜酸粒细胞. 单核细胞及T细胞的趋化因子.两 l6原着兰垦竺翌查!::!:!!:! 种较小的尚未很好研究的化学因子是 C和C-XXX-C化学因子.已有的研 究表明RANTES由激活的单核细胞, igd,板和成纤维细胞分泌,可能是变 态反应的中介物.由肺泡巨噬细胞, 上皮细胞,成纤维细胞分泌的IL-8主 要是肺的中性粒细胞趋化因子.成 人呼吸窘迫综合征时,IL-8的浓度升 高.体外研究证实,RSV能诱导 C-X-C化学因子(如IL-8)和C?C 化学因子如单核细胞化学趋化蛋白 1,MIP.1和RANTES的台成.;推 测与化学因子家族无关的两个其它细 胞因子如Ila-6[和IL-I~”在RSV诱导 的炎症反应中同样起着重要的作用. IL-6是一早期炎性细胞因子,可激活 多种淋巴细胞亚型导致分泌IL-2.成 人呼吸窘迫综合征患者的支气管肺泡 灌洗液中IL-6浓度升高.体外 试验早已证明RSV可以诱导上皮细 胞和单核细胞分泌儿iB]oIL?10是 由巨噬细胞,T细胞和B细胞分泌的 抗炎症细胞因子,感染RSV的肺泡 巨噬细胞分泌IL?lO提示RSV可能通 过诱导这种细胞因子的产生抑制有效 的免疫反应. 尽管这些卓越的实验研究将RSV 感染与不同的细胞因子产生联系在一 起,然而这些细胞因子是否出现于 RSV感染儿童的呼吸道分泌物中?有 关的信息有限,因此我们检测RSV 感染儿童NW和TA标本中的上述细 胞因子浓度以了解这些细胞因子在 RSV感染发病机制中的作用,本文目 的是:(1)确定RSV感染患儿呼吸 道分泌物中是否能检测到RANTES, MIP-I-a,IL-6.IL-8和IL-10;(2)了 解呼吸道分泌物中的这些细胞因子的 浓度是否与白细胞计数,呼吸道分泌 物中的RsV浓度及临床疾病严重程 度相关. 方法 研究人群和设计 在Dallas,TX儿童医学中心, 1996,1997RSV流行季节,对患儿进 行前瞻性研究,通过酶联免疫法确定 RSV感染(细支气管炎,肺炎和,或 呼吸暂停).进入研究前,由研究人 员对RSV感染的患儿进行病史调查 及物理检查.早产(<37周)慢 性肺部疾病,反应性呼吸道疾病或先 天性心脏病史,通过以下几点分析疾 病的严重程度:(1)住院的总天数; (2)机械通气天数(3)供氧天数 (4)肺损伤积分(Murcay等). 行下腹部选择性外科手术的住院 儿童为对照组.通过病史及体格检查 排除过去3O天中有上下呼吸道疾病 或有反应性呼吸道疾病的儿童.一旦 患儿在手术室插管,就用与RSV感 染患儿同样的方法获取鼻咽和气管吸 取物. 该研究获得Texas大学西南医学 中心机构考查委员会的同意,并获得 所有患儿父母或监护人的同意. 标本的采集 RSV感染患儿分别于住院1,3, 和5天采集气管插管患儿的鼻洗液 (Nw)和气管吸取物(1lA)标本,住 院第一天是指入院24小时以内,对 已经拔管的患儿不再采集标本,于住 院1和3天采集未插管患)LNW标本. 对照组患儿标本只能在手术当日 采集,在前一次呼吸道吸引后至少1 小时采集TA和NW标本,将气管插 管与呼吸机分离,用3ml无制菌剂的 盐水滴入气管插管,然后接气囊,用 手控气囊通气5,8次,用8号或10 号F无菌吸引管插入气管插管内,直 到遇到阻力,然后开始吸引,将采集 的分泌物吸入一无菌粘液瓶里.同样 将3ml无制菌剂的盐水滴入患者鼻 部,将一无菌8号F吸引管送入患者 鼻咽部,开始吸引,将分泌物吸入无 菌的粘液瓶中,用有残余分泌物的吸 引管吸取3ml病毒转运培养基(最小 的Eagle培养基必须量,含蔗糖钾? 谷氨酸盐)回收入粘液瓶中,所有标 本用湿冰送入实验室进行白细胞 (WBC)计数和RSV定量培养,其余 标本离心,上清液贮存于一70”C备细 胞因子分析.根据每一位患者主管医 师的意愿,于患者入院当天行气管吸 引物的细菌培养. WBC计数 确定WBC计数并进行分类,推 片在Hematek2000内Acoustain Wright染色,根据厂家说明书由同一 热练的临床血液学实验室技师盲法阆 缕推片.由于细胞的退变,有21%TA 标本和33%NW标本不能进行WBC 分类. RSV浓度测量 RSV定量培养用以前描述过的空 斑测定法”,空斑形成单位(PFU), ml的对数表示. 细胞因子浓度的测定 解冻离心的上清液标本,按厂方 说明书用ELISA试剂盒测量细胞因子 浓度. 统计分析 因大多数变量呈非正态分布,结 世界医学杂志1999,v01.3,No?8原着l7 果用中位数和范围表示,用spe|堋an 等级顺序确定细胞因子浓度与WBC 计数和RSV浓度的相关性.插管和 非插管患者Nw标本中细胞计数和细 胞因子浓度差别用MaTIn—Whimey秩 和检验.插管与未插管患者Nw中 RsV浓度比较用t检验.WBC计数, 细胞因子浓度,RsV浓度的不同时间 比较用单因素方差分析均计学差异 定义为P~.05,所有计算用咖aI 软件包. 结果 患儿特点 对象为28例RsV感染儿童(14 倒未行气管插管,l4例插管)和7例 对照,未插管患儿年龄中位数为1.3 月(0.8~51),2倒早产,2例有慢性肺 部疾病史,未插管患儿住院时间中位 数为5天(1—16).擂管患儿年龄中 位数2.0月(0.5~15),4例早产,l例 有慢性肺部疾患史,l倒有先天性心 脏病史.插管时间中位数6天(1—126). 住院时间中位数l2天(4—126).所 有未插管患儿囡细支气管炎或肺炎入 院.l4例未插管患儿中,12例囡低 氧血症需供给氧气,ll例插管患儿 因细支气管炎或肺炎,3例因呼吸暂 停入院14例插管患儿中,2例(14%) 有急性呼吸窘迫综合征,l2例(86%) 有轻到中度肺部疾患(根据Murray 评分),所有患儿住院期间无一例死 亡.入院第一天,9倒插管患儿气管 插管吸取物细菌培养阳性,5例培养 阴性,4倒可疑细菌阳性,分离到的 细菌包括嗜血流感杆菌(n_2),肺炎 链球菌(n=1),Mo~ella~atarrhafis (1).主管医师认为分离到的三种 细菌是明显的致病菌,给予抗生素注 射.住院期间RSV感染患儿无一例 接受抗病毒制剂或糖皮质激素治疗. 选择性手术的7倒对照儿童,于 腹部外科手术插管时获取NW和TA 标本,年龄中位数6.8月(1.8—16.3), 年龄分布与RSV感染患儿无统计学 差别(P—n1). Nw和TA细胞计数 来自插管和未插管Rsv感染患儿 Nw标本(Il=53)wBc计数中位数 (范围):59xlO(1.3xl一9.1x10)细 胞/ml,所有RSV感染患儿Nw中WBC 分类:中性96(42—10o)%,淋巴3 (0—46)%,单核l(0—2o)%,从插管 患儿获取的TA标本28)wBc计数 中位数:5.3x1(1.2xl一4.3~1)细 胞/ml,其中分类中位数(范围):中性 97(IO—lOo)%,淋巴1(0—72)%,单 核2(0~22)‰对照组NW标本(n;7) WBC计数中位数:9.3×1矿(2.7xl , 2.6×l)细胞枷,TA中wBc计数中 位数1.2xl~(5价l0一28×10)细胞/ m1.RsV感染患儿与对照组儿童Nw 和TA自细胞计数有显着统计学差异 (P<(】001).对照组Nw中WBC分类 中位数(范围):中性75(40—98)%, 淋巴24(2,59),单核1(【)~1)%而 TA中WBC分类中位数(范围):中性 56(0一l00)%,淋巴42(0,l00)%, 单核2(【)~10)%. NW和TA中细胞因子浓度 除了NW中的RANTES,RSV感 染患儿标本中的其他细胞因子均显着 高于对照组儿童(表1). RSV浓度 插管和未插管患儿(57NW 中RSV浓度均数(士SD)为3.72(士1.13) logPFU/ml,TA标本仅来自插管患儿, 气管抽吸物(n一3o)中RsV浓度(士 sD):3o4(士1.13)logPF~ml. 细胞园子浓度,WBC计数和RSV 浓度的相关性 NW标本中wBc计数与其中的 ~NTES,I,1L一8及IL—lO浓度显 着相关.TA中wBc计数与其中的 IL一6,1L严8及IL—IO和MlP—l—a浓度显 着相关(表2).由于NW和TA标本 中中性粒细胞均占优势,因此该部位 测到的细胞因子浓度与WBC计数问 有类似的相关性.中RSV浓度与 Nw中wBc计数,RAN~S,lL.6, 1L一8及1L严10和MIP—l—n浓度显着相 关.TA中RSV浓度与TA中wBc计 数或TA细胞因子浓度均无相关性. 在插管的RSV感染患儿中,NW和TA 样本中的WBC计数,Rsv浓度,IL6 和IL—lO浓度均有显着的相关性(表2). 插管与未插管Rsv感染患儿的 比较 由于插管患儿在1,3,5天采集标 本而未插管儿仅在1和3天取标本, 为了比较,剔除第5天的数据. 未插管患儿NW中RANrEs浓度 的中位数(167.3vs63.7p~ml,P=0003) 和Nw中wBc计数(7.3xlvs3.7x10 细胞,mP<0.025)比插管儿的同样标 本高,另一方面,NW中RSV,IL广6 IL严8,儿一1O和MIP—l—a浓度无显着性 差异【表3). 住院时间比较 为确定RsV浓度,细胞数或细胞 因子浓度是否因住院时间不同而有显 着的差别而进行了比较.图I和2显 l8原着世兰兰查!!:::!:! 表1RSV感染及对照组患者标本中细胞因子浓度的中位数 棒车敏量+PM如whiy秩和幢验 寰2RSV浓度,WBC计数和细胞因子浓度间的相关性 R.sp髓rm柚献系敦十评价的样本古量+tP<005 隆D时lD3 圈摩}: 图2不同时间RSV感染患儿鼻冼液细胞因子 裱度(中位敬) 示了随住院时间延长,Nw中RSV浓 度,WBC计数,RANTES和IL-10浓 度下降(P分别为003,0.001,0.007 和0.003) 与反映疾病严重程度的临床特征 的相关性 我们同样想证宴住院第1天呼吸 道分泌物中的细胞因子浓度,RSV浓 度及WBC计数是否与疾病严重程度 的临床特征相关.TA中RANTES浓 度与插管时间(R=一0.88,P<0.01), 供氧天数(R=一0.86,P如001)和住 院天数(R=,0.g6,P<0.001)呈显着 负相关.TA中的IL.8浓度与插管天 数(R=一0.573,P=0.O4)和需氧天数 (R=一0.658,P=0.03)呈负相关.TA 中的IL.1O浓度与供氧天数fR=,0.6O, P=005)呈负相关此外,所有插管 世界医学杂志1999,Volt3,No?8原着19 襄3气管插管与未插管患者之间Nw中的wBc计数,RsV和细胞因 子裱度的比较 „评竹的样奉数量;+括号中的数值为范围:++P妯m5,Mm_,?h秩和 幢验:l均数?标准差;qP值,t检验 患儿Nw中RsV浓度与供氧天数 (R=0.7,P=nO34】相关,然而所有研究 对象的Nw标本wBc计数,RsV浓 度或细胞因子浓度与疾病严重程度无 显着相关. 讨论 体外研究证实RSV可以诱导不同 类型细胞产生细胞因子,但是根据采 用的实验动物模型不同,结果也不同. 上皮细胞分泌IL.6,IL.10,I11,和 化学因子?,RANTES,MIP.1.q和 单核细胞趋化蛋白…,周围血 单核细胞和中性粒细胞产生肿瘤坏死 因子fn,I8,IL_6,”嗜酸粒 细胞分泌RANTESt. 对儿童的研究证明病毒性上呼吸 道感染(URN)时.鼻分泌物中细胞 因子浓度升高.Noah等发现病毒性 URIS患儿鼻冲洗液中1NF,I1.B, IL一6和?,8浓度升高,Madsuda等 对初次感染RSV患儿的鼻咽分泌物 进行了研究,来自所有2l例患儿的 标本中含有IL_6,14例患儿(67%)标 本含.n.Bccker等”对5例患儿 鼻咽分泌物进行了研究.发现RSV所 致的?RANTES平均浓度高于与 RsV无关的U(12~38vs42工l2p mD,Lmdgren和Grogaardc2发现RsV 所致的下呼吸道感染患儿其鼻咽分泌 物中Il—p和IL6浓度均升高. 本研究首次证明了RSV感染患儿 鼻咽冲冼液和气管吸取物标本中有 16,IL?10,IL一8,RANTES和MIP.1一 a.与对照组相比,RsV感染期间除 NW中RANTES.此外,其余细胞因 子浓度均升高.另外,气管插管患儿 和未插管患儿NW中~NTES和 I10,WBC计数和RSV浓度均下降. 我们发现NW中细胞因子浓度, wBc计数,RsV浓度之间显着相关. 我们也发现TA中细胞因子浓度和 wBc计数呈正相关.1?A中Rsv浓度 与wBc计数或细胞因子浓度缺乏相 关性,其原因不清,部分原因可能是 标本数量有限.插管和未插管患儿 NW中WBC计数和RANTES浓度之 间的比较证明未插管患儿鼻咽部位炎 性细胞的渗入大于插管患儿.这种上 呼吸道增强的炎症反应在某种程度上 是否与下呼吸道病变较轻有关是一个 让人感到迷惑的问题,有待进一步研 究. 将所有患者作为一组进行分析时, NW标本中的wBc,Rsv和细胞因子 浓度与疾病严重程度的临床标志无显 着相关性,然而单独分析插管患儿时, 第一天NW中RsV浓度与供氧天数 呈显着相关,ZA中~NTES,18, 1L一10浓度与疾病严重性的临床标志 呈显着负相关,这些结果提示只在有 临床表现严重的患儿中,炎症和病毒 标志与疾病严重程度临床表现之间的 相关性才变得明显.实际上TA中细 胞因子浓度和疾病严重程度的负相关 表明这些细胞因子可能涉及或与那些 能限制RsV感染严重程度的因素有 关,入院时细胞因子浓度与疾病严重 程度的负相关可能是RSV感染诱导 的炎症连锁反应过程中某一阶段的表 现. 在所有研究的细胞因子中,我们 发现ZA中RANv~S浓度和疾病严重 程度的负相关最显着,同时发现未插 管患)LNW中的RAN~S浓度比插管 者高,这些提示RSV感染时这种细胞 因子的突出作用.本结果与卓越的体 外研究一致,这些研究已反复证明 RsV具有诱导感染支气管细胞株-- 正常支气管和小气管内皮细胞,嗜酸 粒细胞分泌~NTES的能力,由于 RANTE$被认为是变态反应炎症的中 介因子,了解RSV感染和反应性呼 原着苎兰苎查!!!::— 吸道疾病间该因子的作用,还需要做 进一步的研究. 鉴于单核细胞在RSV肺部疾病的 发生机制中起着突出的作用,发现 呼吸道分泌物中细胞类型以PMN$为 主是有意义的,不过也非完全出乎意 料.最近的两项研究..检测了RSV 感染儿童上呼吸道(鼻洗液)和下呼 吸道(气管吸取物)分珏物中细胞的 浸润情况,发现PMN$是主要的细胞 类型.下呼吸道与更远端气道和肺泡 浸润的炎症有显着的不同,这可以解 释这些差异. 我们的研究有某些局限性,可能 影响我们的结果包括采集1lA标本的 特殊部位和采集标本的时间.尽管试 图从远靖支气管中获取气管吸取物, 但由于采用盲抽,获得的抽吸物可能 是气管分泌的.但对深浅不同的气管 抽吸物进行了比较结果相似,对插 管和未插管患儿吸引频率的不同造成 了获得NW分泌物多少的差别,为使 该变化减至最小,标本采集应在前一 次气道吸引1小时后进行.除NW中 RANTES和WBC外,插管患儿鼻洗 液也可受到鼻胃管的影响,但插管与 未插管患儿之间NW中RSV或细胞 因子浓度除前述NWRANTES和WBC 计数外并无显着性差异,说明采样中 这些潜在的变化未影响我们的结果- 至今,研究呼吸道因子的大多数 调查者成功使用的方法与我们所用的 相似.尽管在少数情况下 同时确定呼吸道分泌物和血中 一 个”正常”蛋白如尿素,白蛋白可 作为标本稀释效果的校正,这类处理 方法在炎症存在时是否有效目前还不 清楚m.实际上这些办法并未改变校 参考文献 1WellaT.PeitschMThecheWtOkiDeinformationsonr~( ,dentificatinnandchfira~tenza~onolnov~]曲em0K】nesusing theW啊l1iW曲aadexpressedsequencetagdatabasej JocBltm8.MontraversGibertC.etalHighleve1of intede~kln.8inthebloodandalveolarspacesofpatientswJth paettm~uiaad~ltre~iratorydistres~syndromeIn如c- tionandlnu~uraty1993;61:4553-9 7.埔QKo~t]erG.He|dleyS.ToIIeyE,StentzF.Fostleth wareA.1nflammatorycytokinesintheBALofpatientswith AR嘴Ch蜉t啪5:108:l3014. 8Scht.-tteH.LohmeyerJ,R0Bs蚰uS,eLalBronchaalveolar mad|tem_ccytokineprofiksinpatientswithARDSsevere p~umonmdndeard/ogenicpulmonaryedem8EurRespirJ ISCJe9=ls5B-67. 9.MiUerECo~enA,MatthayMlncreasedinterteukin-8 conc哺trItionBinthepulmonaryedemanuidofpatientswith lcuteteSl~raterydistreassyndromeIromsepBISurltCare Medl996;24:1448—H 正前的结果.我们研究中使用的标 准采样方法最近已在一个多中~,RSV 感染临床实验中得到验证. 小结,我们的结论是RSV感染时 呼吸道分泌物中的IL一6,IL-10,IL-8, RANTES和MIP.1.n浓度升高,并随着 时间的推移下降,就总体而言,这些 细胞因子浓度与呼吸道分泌物中WBC 计数和RSV浓度相关,TA标本中的 RANTES,IL.8,IL.10浓度与疾病严 重程度的临床标志呈负相关.综上研 究结果提示这些细胞因子介导由RSV 感染诱发的呼吸道炎症.对RSV感 染还需作进一步研究,以便弄清感染 部位细胞募集机制及上呼吸道RSV 感染的局限化机制,这些研究对发展 新的针对RSV感染的免疫调节治疗 十分重要. 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