基于微透析与超快速液相色谱技术的唑类抗真菌药物经皮药代动力学研究（可编辑）

基于微透析与超快速液相色谱技术的唑类抗真菌药物经皮药代动力学研究（可编辑） 基于微透析与超快速液相色谱技术的唑类抗真菌药物 经皮药代动力学研究 ?? 军医天茗 博士学位论文 基于微透析与超快速液相色谱技术的唑类抗真菌药物 经皮药代动力学研究 指导老 师: 学科、专 业: 学位类 型: 答辩日 期:独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明 的法律责任。 日期:如』年占月易 学位论文作者签名:习孙宁 学位论文版权使用授权书声明 本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定,有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文 被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分 编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本授权书 导师签名: 学位论文作者签名:穹 /口小、 日期: 日期:、 砂卜年皇月矽日 口年岁月’日目 录 摘要?..??. 缩略词表??.. 绪论?.. .微透析技术的应用进展?. .皮肤微透析技术的研究进展??. .现代技术的发展??. .唑类抗真菌药物的研究进展??. .课题思路??. 第一部分微透析与超快速液相色谱技术?结合的研究系统的建立 与评价.. 第一章超快速液相色谱与高效液相色谱的性能比较.引言。 .实验方法?. .结果与讨论. .结论?. 第二章自制微透析探针的研制.引言? .线性微透析探针的制作方法??. .线性微透析探针的使用及特点?. .柔性微透析探针的制作方法??. .柔性微透析探针的使用及特点?。 第三章微透析与超快速液相色谱技术结合的研究系统的建立与评价? 第一节透析液样品中艾迪康唑定量分析方法的建立与确证.引言?。:.实验方 法?。 .结果与讨论.第二节艾迪康唑微透析体内外回收率的测定及影响因素的考 察 .引言? .实验方法?.. .实验结果?. .讨论?. 第二部分基于.系统的艾迪康唑乳膏在大鼠体内药代动力学和 体外药效学研究??.. 第一章大鼠皮肤透析液和血液透析液中艾迪康唑的药代动力学研究??. .引言. .实验方法?. .实验结果?. .讨论?. 第二章艾迪康唑体内药代动力学与体外药效学研究?. .引言.. .实验方法? .实验结果? .讨论.. 第三部分基于.系统的复方硝酸咪康唑盐酸小檗碱软膏在豚鼠体内 药代动力学及相互作用的研究第一章生物样品中硝酸咪康唑和盐酸小檗碱 定量分析方法的建立与确证?. 第一节豚鼠皮肤透析液和血浆中硝酸咪康唑定量分析方法的建立与确证?. .引言. .实验方法? .结果与讨论 第二节豚鼠皮肤透析液和血浆中盐酸小檗碱定量分析方法的建立与确证?. .弓言。 .实验方法? .结果与讨论.. .本章小结? 第二章硝酸咪康唑和盐酸小檗碱微透析体内外回收率的测定. .引言. .实验方法? .实验结果?. .讨论。 第三章豚鼠皮肤给药复方硝酸咪康唑盐酸小檗碱软膏的药代动力学及相互 作 用的研究??.. .弓言。 .实验方法 .实验结果? .结论.. 结语? 在读期间发表论文? 致谢?‘??。??‘‘~??’。。 .?。 .??‘。.??”一 .”。。 .。 伽??~ 随. 响? .。。。”。。 .??。。 . .??““?,.~“”.??一.?”如 .?“ . 器鳃 ? 住 。。眦“ 咖俩。??竺 .“一 .,..?二:??“。 . .犯粕 ?。? 洫岫??“。 .?一??。” .?基于微透析与超快速液相色谱技术的唑类抗真菌药物经皮药代动力学研 究. . .?. ?... ...??.. .. . .?.?.??. . .??.. . ... ???..?.?..??.......??....??:;: .? . ?... . .?: .??.. . .。..??... .??... ... ?..??..??.基于微透析与超快速液相色谱技术的唑类抗真菌药物经皮药代 动力学研究 摘要 药代动力学旨在通过测定生物样本中的药物或者代谢物的浓度定量描述药 物进入体内后的吸收、分布、代谢和排泄,进而阐明药物的药效或者毒性, 为新 药研究的代谢筛选和临床用药的疗效评价提供重要依据。药代动力学的取样 一般 以收集体液血液、尿液等和采取组织匀浆的方法,所得到的数据比较间接、粗 糙,且对实验动物损伤大。近年来,在体微透析技术在药代动力学领域,尤其是 在药物分布与代谢的研究方面开始发挥重要作用。作为一种活体生物取样技术, 微透析技术有连续取样、动态观察、组织损伤轻、时间和空间分辨性好、透析液 无需预处理等特点。微透析技术获得的样品量极少,必须与具有高选择性、高灵 敏度、能对微体积样品进行定量分析的方法相结合,超快速液相色谱在高效分离 和检测上独具优势,成为分析微透析液的有力联用工具。本文建立了微透析取样 技术与超快速液相色谱分析技术相结合的研究系统,以唑类抗真菌药物艾迪康唑 和复方硝酸眯康唑盐酸小檗碱为研究对象进行经皮药代动力学研究。 第一部分微透析与超快速液相色谱技术结合的研究系统的建立与 . 评价 一、超快速液相色谱与高效液相色谱性能比较 本章以一类新药胰岛素增敏剂.为分析对象,分别采用岛津超快速液 相色谱和岛津高效液相色谱建立其色谱分析方法,并对二者的仪器性能和试验参 数进行了比较。超快速液相色谱通过以下性能实现样品的快速分析:低容量的管 一自动进样器的 超快速 路和流通池减少了色谱柱的峰展宽; ;快速的数据采集以得到较好的信号追踪。这些性能 进样;柱温最高可达 加上.岬小颗粒的色谱柱可以缩短分析时间.倍,节省了仪器和分析时问, 可用于药物的高通量药代动力学研究。 二、自制微透析探针的研制 本章研制了线性微透析探针和柔性微透析探针,自制微透析探针技术的稳定 性和重现性达到商业用探针水平。因为是自制探针,探针的透析膜膜长可以按照 实验动物的大小和实验特定要求制作不同长度的微透析探针,增加透析膜长度可 以扩大透析交换面积,满足不同药物分析的需要,为抗真菌药物艾迪康唑和复方 硝酸咪康唑盐酸小檗碱药代动力学研究提供了优越的技术支持。第二军医大学博士学位论文 三、微透析与超快速液相色谱技术结合的研究系统的建立与评价 微透析与超快速液相色谱技术结合的研究系统的建立与评价以艾迪康唑为 模型药物,采用超快速液相色谱 ?, 分析艾迪康唑的微透析体内外回收率。液相色谱条件为: ×. 蹦 . ..色谱柱;采用色谱科保护柱 , .;流 ,美国;流动相:乙睛:.%三乙胺:,/磷酸调 速:. /;紫外检测波长: ;柱温: ;进样量: 。每个样 品的分析周期为 。艾迪康唑体外回收率的测定采用透析法、反透析法和零 净通量法,体内同收率采用反透析法。实验结果显示在较高流速 ./透析法 和反透析法两种方法测得回收率均保持高度一致;回收率随着灌流液流速的 增大 而减小;探针的回收率与溶媒中艾迪康唑的浓度无关;利用零净通量法能准 确地 测定溶媒中艾迪康唑的浓度及其回收率。体外回收率实验结果表明:艾迪康 唑在 回收率基本保持稳定,线性微透析探针回收率为.%.%,柔性微透 析探针回收率为.%.%:体内回收率实验结果表明:艾迪康唑在 回 收率基本保持稳定,线性微透析探针回收率为.%.%,柔性微透析探针 回收率为.%.%。本研究表明微透析与超快速液相色谱结合的高通量研 究系统可用于艾迪康唑的药代动力学研究。 第二部分基于.系统的艾迪康唑乳膏在大鼠体内药代动力学和体 外药效学研究 一、大鼠皮肤透析液和血液透析液中艾迪康唑的药代动力学研究 本章首次基于微透析与超快速液相色谱技术结合的研究系统同时研究了艾 迪康唑在大鼠皮肤透析液和血液透析液中的药代动力学。采用微透析技术在 大鼠皮下和血管同时植入探针进行取样,这对于研究各时间点艾迪康唑同时 在皮肤和血液中的真实分布有着重要意义。药代动力学参数表明艾迪康唑在 皮肤 透析液中的及均高于血液透析液,艾迪康唑在二者中的浓度曲线大致 相同,皮肤和血液的比值接近,说明游离艾迪康唑在皮肤组织间液中 浓度远高于血液中浓度,表明药物在靶组织中有较高的分布。微透析技术测 定的 皮肤透析液中药物/?和血液透析液中药物/具有较好的定量关 系,说明大鼠透皮给药艾迪康唑乳膏后血浆中的药物质量浓度与皮肤组织中 药物质量浓度相关。结果表明基于.系统可用于研究非结合型艾迪康唑基于 微透析与超快速液相色谱技术的唑类抗真菌药物经皮药代动力学研究 在大鼠靶器官皮肤以及血液中的药代动力学。 二、艾迪康唑体内药代动力学与体外药效学研究 将药代动力学和药效学结合起来进行同步研究,阐明药物在作用靶部位的浓 度.效应.时间三维关系。本章研究了艾迪康唑的体外抗真菌活性结合体内 药代动力学的/参数和体外抗真菌浓度.药效曲线。艾迪康唑对临床常见致 病真菌有较强的抗菌作用,其范围在.? /之间。以最大值 微透析取样时间内皮肤透析 “/作为此次/参数分析的标准,在 液中药物浓度均高于 /,艾迪康唑乳膏皮肤给药后皮肤透析液中药物浓度 持续时间可以满足抗真菌活性需求?. 。皮肤透析液中. 是叫衡赫斤芟中.的.倍,表明皮肤作为靶导争宣『其药物浓度含量最高,同 时药物在皮肤上有较长的滞留时间,说明药物在皮肤上形成药物贮库,发挥 局部 药效,达到药物局部给药局部作用的目的,可以维持较长时间抗真菌活性作 用。 从体外抗真菌浓度.药效曲线可知皮肤透析液中艾迪康唑浓度对株临床常见 致 范围内抑 病真菌均具有良好的抑制作用,抑菌率可高于%,且在? 菌率高达%,具有较好的抗真菌活性。 第三部分基于.系统的复方硝酸咪康唑盐酸小檗碱软膏在豚鼠体内药 代动力学及相互作用的研究 一、豚鼠生物样品中硝酸咪康唑和盐酸小檗碱定量分析方法的建立与确证 首次建立皮肤透析液和血浆中硝酸咪康唑和盐酸小檗碱的定量分析 方法。皮肤透析液中硝酸咪康唑液相色谱条件:色谱分析采用×. . ..色谱柱;采用色谱 , 科保护柱,美国;流动相:乙睛:.%乙胺:,/磷酸调 /;紫外检测波长: .,使用前经过.岬的微孔滤膜过滤;流速:. 。血浆样 ;柱温: ;进样量: ;每个样品的分析周期为. 品中硝酸咪康唑液相色谱条件:色谱分析采用 ?? ×. . , ..色谱柱;采用色谱科保护柱,美国; 流动相:乙睛:.%三乙胺:,/磷酸调 .,使用前经过. ;柱温: ;进 的微孔滤膜过滤;流速:. /;紫外检测波长: 。皮肤透析液中盐酸小檗碱液相色谱 样量:“;每个样品的分析周期为 × 条件:色谱分析采用 ? . ,第二军医大学博士学位论文 . ..色谱柱;采用色谱科保护柱,美国;流动相:乙睛:.% 三乙胺:,/磷酸调 .,使用前经过. 的微孔滤膜过滤;流速: . /;紫外检测波长: ;柱温: ;进样量:山;每个样品的 分析周期为. 。血浆中盐酸小檗碱液相色谱条件:色谱分析采用. 刑. ..色谱柱;采用色谱 , 科保护柱,美国;流动相组:乙睛:.%三乙胺:,/磷酸调 /;紫外检测波 .,使用前经过.岬的微孔滤膜过滤;流速:. 、 长: ;柱温: 。建立 ;进样量:?;每个样品的分析周期为 的体内分析方法符合生物样品检测要求,可用于豚鼠复方硝酸咪康唑盐酸小 檗碱 软膏中硝酸咪康唑和盐酸小檗碱的药代动力学研究。 二、硝酸咪康唑和盐酸小檗碱微透析体内外回收率的测定 研究了硝酸咪康唑和盐酸小檗碱的线性微透析探针体内外回收率。体外回收 率实验结果表明:硝酸咪康唑和盐酸小檗碱在 回收率基本保持稳定,硝酸味 康唑线性微透析探针回收率为.%.%,盐酸小檗碱线性微透析探针【旦收 率为.%.%。体内回收率实验结果表明:硝酸咪康唑和盐酸小檗碱在 回收率基本保持稳定,硝酸咪康唑线性微透析探针回收率为.%.%, 盐酸小檗碱线性微透析探针回收率为.%.%。本研究表明探针回收率随 着灌流液流速的增大而减小;且回收率与溶媒中硝酸咪康唑和盐酸小檗碱的浓度 . 无关。实验结果表明微透析技术可用于硝酸咪康唑和盐酸小檗碱的药代动力学研 究,反透析法可作为体内微透析研究中硝酸咪康唑和盐酸小檗碱回收率的测定方 法。 三、豚鼠皮肤给药复方硝酸咪康唑盐酸小檗碱软膏药代动力学及相互作用的研究 本章基于.系统研究了复方硝酸咪康唑盐酸小檗碱软膏复方试验 制剂在动物体内的单剂量药代动力学与合并用药时相互作用。本实验选择只豚 鼠雌雄各半,随机分成三组,采用自身对照、随机交叉实验方法,选择三制剂三 周期的拉丁方设计给药。皮肤给药复方试验制剂选择含硝酸咪康唑 , .%、盐酸小檗碱.%的混合物软膏,对照制剂分别为.%硝酸咪康唑软膏和 .%的盐酸小檗碱软膏。通过在豚鼠体内的临床前药代动力学研究,分别估算以 硝酸咪康唑和盐酸小檗碱表征的复方硝酸 的相对生物利用度和其它药代动力学参数,基于微透析与超快速液相色谱技 术的唑类抗真菌药物经皮药代动力学研究 统计比较分析,考察复方硝酸咪康唑盐酸小檗碱软膏复方试验制剂中硝酸咪康唑 和盐酸小檗碱合并用药的药代动力学相互影响,为临床实验提供参考依据。 单剂量实验结果表明,以硝酸咪康唑表征的复方硝酸咪康唑盐酸小檗碱软膏 复方试验制剂的相对生物利用度符合要求。进一步对戤、进行双单侧 检验,结果显示复方硝酸咪康唑盐酸小檗碱软膏复方试验制剂和硝酸咪康唑软 膏对照制剂双单侧检验合格,即单用硝酸咪康唑及与盐酸小檗碱合用复方硝酸 咪康唑盐酸小檗碱软膏复方试验药物时硝酸咪康唑的主要药代动力学参数无明 显改变,表明复方硝酸咪康唑盐酸小檗碱软膏复方试验制剂合并用药不存在药代 动力学相互影响。以盐酸小檗碱表征的复方硝酸咪康唑盐酸小檗碱软膏复方试验 制剂的相对生物利用度符合要求。进一步对戤、进行双单侧检验, 结果显示复方硝酸咪康唑盐酸小檗碱软膏复方试验制剂和盐酸小檗碱软膏对照 制剂双单侧检验合格,即单用盐酸小檗碱及与硝酸咪康唑合用复方硝酸咪康唑 盐酸小檗碱软膏复方试验制剂时盐酸小檗碱的主要药代动力学参数无明显 改 变,表明复方硝酸咪康唑盐酸小檗碱软膏复方试验制剂合并用药不存在药代 动力 学相互影响。 关键词:超快速液相色谱法,微透析,微透析探针,艾迪康唑,硝酸咪康唑,盐 一 酸小檗碱,药代动力学,药效学, ,, , . ,,,.., , , . , . , , ,. ,, ... , ,. . ?.: . ; 一 ; , :. 一, , . . ; . .? ., . . , . . . ‘ . ? ? .. ×. . , 一.% ..: ; ,. . :,/;. , , ; /: ,。; . , , . . /. . . ..%.% ,.% .%.%.% .,.%.%?. ? . ,. 戤. . ? , ,. /戤 . . . . . /../. ../ , /, “/ . “/ 髓 . . ., 胡?. ,. . ??%~ % ., .? . . : ×.. , .... ..%/; ; ,. :,/; , ,. . ; ; ,: ×. ,. ... 一.%. ; :,/; , .. /; ; ?; ,, . : ×. 刑 .岬, .... ..%; ,. /; :,/; , ,. ?; . , ;: . ,?.% ...×.. :,/; ..第二军医大学博士学位论文; ,. /; , ; ., ,; , . . ..%.% ,.%.%. %.% ,.% . .% . . . . : .%, .%., , , ? × ..% .% . .% .% .,. ,... . 戤、 : , , : , ?..’., . /? 懈、 ? ,,.: ,, ,, , , , .第二军医大学博士学位论文 缩略词表 微透析 经皮微透析 微透析探针 超快速液相色谱.高效液相色谱 ./ 液相色谱串联质谱技术 质控 瓠 达峰浓度 积 达峰时间 /消除半衰期 ? 药时曲线下面积 平均滞留时间 磷酸盐缓冲液 提取效率 经皮给药系统 相对回收率 相对损失率 细胞外液 最低抑菌浓度 药代动力学 药效学 ..基于微透析与超快速液相色谱技术的唑类抗真菌药物经皮药代动力学研 究 绪论 微透析,技术是一种新型生物采样技术,该技术将灌流取 样技术与透析技术结合起来,是药代动力学上又一个新技术的开始。目前, 比较 有代表性的是瑞典 .等【】适用于动物和人体的微透析探针的专 利,随着新型探针的不断出现,必将给药学工作者带来更广阔的研究天地,】。 .微透析技术的应用进展 .微透析技术基本原理 微透析技术基本原理是利用物质会沿着质量浓度梯度进行扩散和小分子化 合物具有通透性原理设计的。当探针埋入组织后,游离的小分子药物会沿质量浓 度梯度扩散进探针被灌流液带出,而蛋白质结合型药物及其他大分子物质因不能 通过半透膜而被排斥在探针之外,由于结合型药物分子无药理作用,相对于其他 取样技术所测定的组织中游离药物质量浓度与药物的效应之间相关性更强【】图 。..第二军医大学博士学位论文 .微透析技术系统的基本组成 微透析系统一般是由微透析探针、微量灌流泵、微量收集器、灌注液组成图 , 。 微透析探针:是由半透膜构成的中空管,要求半透膜具有牛物兼容性和稳定 性,平均孔隙应该大到足以容许溶质分子通过,又要小到能阻挡蛋白质和其他大 分子通过。常用的透析膜管材料有再生纤维素、聚丙烯腈和聚碳酸酯等材料, 此 类物质具有较好的生物兼容性和稳定性,不会和体内成分发生反应。 微量灌流泵:以持续恒定的低流量向组织灌注缓冲液,速度为.? /。 微量收集器:采用自动化的系统间断定时收集透析液,收集的量南取样时间 和灌注速度控制。样品被收集到山塑料管或玻璃管中,根据研究目的选用敏 感微量分析技术对透析液样品做进一步的检测。 灌注液:必须类似所要提取物质的载体,要求其成分接近细胞外液,以免干 .。缓冲液中不 扰探针周围的生理状况,一般用液或磷酸盐缓冲液 能有气泡或其他微粒,以免改变流量或减少半透膜交换能力。 曲 / /伽屿 .?..微透析探针的种类 . 微透析探针有多种形式,按构造可分为以下类即 分流探针和柔性探针图一【】。基于微透析与超快速液相色谱技术的唑类抗 真茵药物经皮药代动力学研究 .. . . . .. 线性探针 线性探针用于对肌肉、皮肤、肝脏和肿瘤等外周组织中的药物取样。线性探 针像穿针引线一样,可把活性膜部分充分包埋在靶组织。线性探针取样技术能更 准确地反映在体皮肤中的药物浓度,可用于经皮药代动力学研究,这比通过采血 测定简单、直接、准确。 同心圆探针 同心圆探针主要是一个同心套管,透析膜在套管的顶端。灌流液在里面的管 子里流动,通过透析膜,达到采样点。探针外部套管可同定在颅骨上,探针可插 入实验所需的脑部区域,从而来监测神经递质的释放。主要用于脑部取样,也有 报道用于眼部取样【】。 分流探针 ..第二军医大学博士学位论文 分流探针是将一个线性探针装入一段塑料管而制得,可用于流体的不间断取 样,主要用于胆汁取样。 柔性探针 为了弥补探针的刚性问题,一种柔性探针应运而牛。这种探针由覆盖了半透 膜的熔融硅管组成】,主要用于血液取样。 .微透析技术的特点 微透析最大优点是可在基本不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体 、实时 和在线 取样】。它具有以下特点: .空间分辨性,取样即时即测,可真实代表取样位点目标化合物的浓度,同时 在体内不同部位插入探针可研究目标化合物的体内分布。 .提供不含蛋白质等大分子物质的游离态小分子化合物,样品因不含蛋白质、 酶等大分子物质,可不经预处理直接用于测定,对药物研究有重要意义。 .不需处死动物和制备组织匀浆,不破坏机体完整性,可维持实际生理条件, 消除传统药物代谢研究中因组织均匀化破坏细胞隔室造成对代谢研究结果 的 影响,减少实验动物数量,并可获得有关药物代谢中间过程的信息传统方法 对血清、尿或粪便中代谢物浓度测定只能了解代谢的最终产物,不能反映中 间过程。 .研究药代动力学可从同一动物收集大量样本而不损失体液量,避免了传统 研 究方法中因采血后血容量减少所造成对药物分布及消除的影响,其时间分辨 性可使药动学更准确。 .样品体积恒定,样品中各成分浓度基本不变,膜对药物的非特异性吸附较 少。 .不会因在室温取样而酶解,提高样品稳定性,可从容地进行分离和测定。 .损伤小,使取样可在清醒、自由活动的动物体内多个器官以及同一器官多个 位点连续取样,且动物本身自成空白对照,能准确及时掌握到药物代谢的中 间动态信息。 晌微透析回收率的因素 微透析是在非平衡条件下取样,所测得透析液中药物浓度只是探针周围样品 基质中该药物实际浓度的一部分,透析液中待测药物的浓度与其在样品基质中浓 ..基于微透析与超快速液相色谱技术的唑类抗真菌药物经皮药代动力学研究 度之比称为探针的提取效率 ,最探针回收率。要了解待 测部位的实际浓度就必须测定回收率,回收率是影响微透析结果的重要因素。影 响回收率的因素包括灌流液的速度、组织温度、待测物在采样部位的扩散速率、 透析膜的分子截留量、透析膜面积、分子形状、离子状态及其与透析膜的化学交 互作用等。随着对溶液在微透析探头中转移过程的进一步了解,发现取样部位的 生物物理性质、传质阻力、待测物质的分子量、温度等诸多生理物理因素也参与 其中。影响回收率的因素主要有以下几个方面: 透析膜 许多不同的半透膜材料再生纤维素、聚丙烯腈和聚碳酸酯其材质可以影响 ’ 探针在体内外实验中的扩散系数,它们的截留分子大小一般在?,道尔 顿。透析膜的分子截留量很好地控制了透析液中分子的大小,但其对回收率的影 响很小【】。透析膜面积大小的选择通常根据采样部位而定,膜面积越大回收率 越高。一般脑部透析用面积较小的膜,肝脏、肌肉等组织选用面积较大的。 温度 温度每升高一度扩散系数增加/%。实验证明相同灌流速度,时的 回收率比。时的大。因此探针体外回收率的校正会模拟活体的状态进行。 灌流速度 灌流速度的快慢直接影响到待测物的回收率。在某一特定的时间段内争取获 得足够量取样标本的同时,又要保证对体内组织的干扰最小。实验为了获得较好 的回收率并兼顾足够的样品体积,常用的灌流速度为? 。灌流液与待测 物质的亲和力高,会增大药物在灌流液与细胞外液的分配系数,提高回收率。 .微透析探针的校正方法 微透析探针的校正方法分体内和体外两种。由于体外校正的简便易行,现一 般多采用体外校正的方法。但由于其并不能完全代表探针在体内的回收率,体内 校正的方法正日渐受到研究者们的重视。 体外校正 该方法是将探针放入某种已知浓度的待测物的标准溶液中,稳定一段时间后 以某一速度灌流之后测定透析液的浓度。测定浓度与标液浓度之比即是体外的回 收率。然而因为体外水性溶液与活体组织内介质阻力的不同,该方法并不能很好第二军医大学博士学位论文 地反应体内回收率的情况。但体外微透析探针的校正在鉴定自制探针的稳定性方 面很有用处,而且通过体外校正可大致估计的细胞外液的浓度值大约是实际浓度 的?倍【】。但也有研究表明这些体外回收率校正的方法仍低估了体内实际的 溶液浓度【】。 体内校正 ?零净通量法 该方法是将灌流液流速控制恒定,分别测定不同浓度的灌流液达到稳态后分 析物的浓度。当灌流液中分析物的浓度低于探针外介质的,扩散的方向就是从介 质到探针。反之,即是从探针到介质。零通量点时探针内外浓度相等。绘制灌流 液不同浓度与透析液中分析物浓度的直线回归图,斜率为回收率,轴上的截距 即为探针外样品浓度。每次浓度更换重新采集前,应使透析系统稳定 左右 【。。 ?外推至零流速法 测定不同潸流速度下透析液中待测物的浓度,以浓度对灌流速度非线性回 归,通过外推至零流速获得探针周围样品基质中待测化合物浓度的估计值。此时, 假定样品基质巾待测化合物浓度与探针膜内浓度处于平衡状态,则测得的透析液 中待测化合物浓度应为取样部位样品基质中的浓度。零流速下的回收率理论上是 %,所得浓度即为探针外待测物的浓度【】。 ?反透析法 一种内标物被加入灌流液中,通过测定透析液中内标物的浓度及回收率即是 待测物的回收率。这种内标物要求具有惰性,不与体内物质反应但又尽可能与待 测物相近。其优点在于可真实反映体内回收率的变化,其与零净通量法都是进行 体内探针校正十分准确可靠的方法,零净通量法较之更耗时【】。 ?极慢灌流法 根据外推至零流速法发展来的,在灌流速度约为 测定一般相对回收率可达%。但其缺点也是显而易见 时很多,且在灌流过程中样品挥发程度也很严重。 .皮肤微透析技术的研究进展 评价经皮给药系统最常用的方法是应用扩散基于微透析与超快速液相色谱 技术的唑类抗真菌药物经皮药代动力学研究 以此来预测药物的生物等效性。但透皮吸收机制和药物释放研究发现扩散 池存在一些不足,如不能满足溶液流体动力学、离体皮肤的物理化学结构和生理 条件发生差异等。应用微透析技术评价经皮给药系统,可以对实验动物或人体皮 肤组织进行在体、连续的药物质量浓度测定,使得在体研究外用制剂的经皮吸收 动力学和生物等效性成为可能,为该领域的研究提供了一种新方法。 .皮肤微透析技术 皮肤微透析技术图.】 是借用神经生理学和神 经化学研究神经递质的方法,应用透析膜弥散原理动态地采取真皮组织间液样 本,结合其他现代敏感检测技术和设备,高效液相色谱仪、高效毛细管电泳法以 及高效液相色谱与质谱联用技术等,研究局部皮肤生理代谢或疾病发生发展规律 以及皮肤药代动力学【】。皮肤微透析技术能在微创的前提下解决定性、定量、 定位、微分析、连续取样、动态分析的研究要求,为经皮给药的药效学和药代动 力学研究以及新药的有效安全和质量可控方面提供可靠和全新的手段,】。 与皮肤活检或负压吸疱等局部取样方法相比,具有对皮肤几乎无损伤和能连 续动 态观察等优势。 .. 由于探针脆而易折必须用导管将其导入真皮,用超声波可监测到探针在皮肤 第二军医大学博士学位论文 的位置。根据研究目的调整插入深度,如插入真皮浅层研究浆细胞的释放, 插入 后 皮下研究多脂组织的分解代谢,取出探针可见细小针孔痕迹图, 消失。 ‘ .. .外用制剂经皮药代动学方面的应用 药物在组织的代谢和药理作用以及药物剂量与药效学关系很难用其它传统 取样方法研究,应用微透析技术分析皮肤透析液标本,能很好地加以解释。 等做了一项关于皮肤屏障功能对水杨酸透皮吸收影响的在体药动学 研究。将水杨酸涂于受试者左侧前臂的个部位监测皮肤屏障功能,这个位置 的皮肤屏障状况不同:分别为正常状况,屏障功能被破坏状况,%、%十二烷 造成应激性皮炎状况及丙酮脱脂质状况。结果显示胶带 基硫酸钠敷贴 剥离导致的屏障功能破坏处皮肤对水杨酸的经皮吸收是正常状况倍,%、 %处理后的药物经皮吸收分别为正常状况的和倍,丙酮脱脂质处理 后则为倍。该研究表明皮肤屏障功能对水杨酸透皮吸收有重要影响,影响程 度与屏障功能受损状况相关,同时也表明经皮微透析可用于皮肤局部实时 药动学监测和皮肤屏障功能状况研究。等】研究了尼古丁贴剂 的透皮吸收动力学过程:在给药后? 内开始可以检测到皮下组织内药 ..基于微透析与超快速液相色谱技术的唑类抗真菌药物经皮药代动力学研究 物,达峰时间在? ,峰浓度平均为 /,但是结果显示个体差 异较大。结果显示尼古丁在皮肤内的动力学行为与皮肤屏障功能无显著相关,但 是与探针埋置位置有关。另一项研究研究了烟酸甲酯在离体皮肤、重建表皮及在 体表皮的透皮吸收情况,结果显示在皮肤药动学研究方面,微透析技术可以作为 体内、外相关性研究的新的有效工具【,】。结合药代动力学模型可用于研 究不同剂型、角质层栅栏作用以及促渗透剂和电离导入对皮肤吸收的影响。 .系统给药后药物在皮肤局部的分布及药效学评价 由于许多感染发生在软组织内,皮肤及皮下组织不仅是外用制剂的主要作用 位点,同时也是很多抗菌药物的作用靶点。因而测定其中抗菌药物的分布情况对 药物研究非常有意义。等【】用在体微透析技术研究了健康者和患者静 脉给予 莫西沙星后药物在皮下组织的分布局部组织和血浆中的药动学。 结果表明健康者和患者的皮下组织药物分布差异无统计学意义且药物浓度 均可 以达到临床所需的抑菌浓度。在另一项研究中,.等【】研究了口 服 氧氟沙星后药物在皮肤内的分布情况,药物的蛋白结合率大约为%, 皮肤局部药物的分布为总给药量的. .%。等研究了静脉给 予 磷霉素后药物在软组织中的分布情况分别在肌肉和皮下组织中埋 或 置探针,药动学参数表明药物在皮下组织中的瓤,嘲及药一时曲线下 面积均高于肌肉组织,由于磷霉素的蛋白结合率较低,组织中药物的与血 浆中药物的之比较高,为%一%,表明药物在靶组织中有较高的分布。 此外在此项研究中还联合应用体外药效学模型评价相应于组织中药物浓度 时的 内无细菌生长。进行这方面的研 药效。体外培养的结果显示单次给药后 究有助于确定药物的分布情况,指导、设计给药方案,以求达到疗效最佳,毒 副 作用最小。 .经皮吸收药物的生物利用度和生物等效性方面的研究 通常认为外用制剂的透皮吸收与皮肤屏障功能有关。目前皮肤局部药动学研 究未成系统,出于安全用药的考虑,外用制剂需要进行生物等效性研究。用血浆 药物浓度评价外用药物的经皮吸收生物利用度/生物等效性意义不大,但是用以 评价经皮吸收药物的常规方法还未建立。目前常用的评价药物透皮吸收的方法还第二军医大学博士学位论文 是经典的两室扩散方法,所用材料为离体动物/人皮肤或人工膜。虽然体外 系统在前期预测药物生物利用度/等效性方面不失为一种有效的方法,但是该方 法还是有明显的不足之处】。应用经皮微透析技术检测皮肤组织中药物的质量 浓度,在研究经皮吸收药物的生物利用度和生物等效性方面具有很大的潜力。 在一项比较微乳和传统乳霜对亲脂性药物吸收差异试验中,个自 愿者分别外用含利多卡因微乳和%利多卡因/孚霜,经皮微透析监测真皮组 织间液中利多卡因浓度和延滞时间,结果表明微乳促渗透作用使利多卡因组织浓 度提高了.倍,缩短迟滞时间近/,利用反向透析方法校正回收率,相对回 收率可达到%~%。表明微乳载体可以用于增加亲脂性药物的经皮吸收,是 一种较为理想的外用药物剂型。微透析技术与相应的药动学模型相结合则可以为 外用制剂的生物等效性研究提供一种敏感的方法。药动学参数在个体间的变化比 个体内变化大的多,说明皮肤屏障功能应该是影响外用制剂透皮吸收的主要因素 之一。 .皮肤微透析技术和其他用于评价经皮给药系统方法的比较 ..与体外扩散池评价的比较 目前常用的评价药物透皮吸收的方法还是经典的两窜扩散方法,所 用材料为离体动物/人皮肤或人工膜。虽然体外系统在前期预测药物生物利用度/ 等效性方面不失为一种有效的方法,但是该方法还是有明显的不足之处。一项对 .局部给药后透皮吸收率的研究中发现,利用扩散池和微透析技术分 别测定透过小鼠皮肤的.的浓度,结果具有很好的一致性。但同时应用微透 析技术分别测定小鼠离体和活体的透皮吸收情况,发现体外的测定结果是活体测 定结果的近倍。这个结果提示我们应用体外透皮实验得到的药物质量浓度并 不是体内实际的药物水平的可靠指标【】。报道应用扩散池和 微透析技术分别测定利多卡因和盐酸匹罗卡因的不同经皮给药剂型中透皮吸收 率,发现两种评价方法具有较好的相关性。体外/体内透皮吸收率的线性关系分 别是利多卡因.,盐酸匹罗卡因.,但不同模型药物之间的体外/ 体内透皮吸收率无相关性。结果表明扩散池具有较好的相关性,但这种评 价方法不适用于比较不同药物之间的透皮吸收率,也不能预测体内实际的药物透 皮吸收水平。基于微透析与超快速液相色谱技术的唑类抗真菌药物经皮药代动力学研究 ..与体内血浆药物质量浓度评价的比较 皮肤微透析技术可以用于评价经皮给药系统的生物等效性,但用以评价经皮 吸收药物的体内实验方法还未完善。通过小鼠实验对曲尼司特种 不同的局部给药剂型比较应用微透析技术和间接的血浆药物质量浓度评价透皮 给药制剂的药物透皮给药情况。微透析技术测定的皮肤组织中药物/和 血浆中药物戤具有极好的定量关系,但另一个模型药物水杨酸应用上述 两种评价方法却没有相关性。这说明透皮给药制剂中血浆中的药物质量浓度并不 总是与皮肤组织中药物质量浓度相关,也不能代表皮肤中药物的实际质量浓度。 .现代分析技术的发展 解决微透析技术中微透析样品的分析方法问题是成功应用该项技术的前提。 在开发分析方法时必须考虑微透析取样的特点。由于使用低流速,微透析样品量 一般只有几十微升,另外收集样品时透析过程也不可避免地会稀释样品。样 品量 少、浓度低的特点对建立分析方法提出了极大挑战。要求使用的分析方法具有灵 敏度高、样品量需求少、分析速度快的特点,而超快速液相色谱在高效分离和检 测上独具优势,已经成为分析微透析液的有力联用工具。 新的色谱领域,超快速液相色谱与传统的高效液相色谱技术相比提 供了更高的效率,因而具有更强的分离能力。目前商品化的超快速液相色谱包括 ?、 和 。利用创新技术进行 刑. 整体设计,大幅度地改善了液相色谱的分离度、样品通量和灵敏度。基于小颗粒 技术的超快速液相色谱,与人们熟知的技术具有相同的分离原理。不同的 是:超快速液相色谱不仅比传统具有更高的分离能力,超快速液相色谱可 以在很宽的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作,并获得优异的结果图 一【】。第二军医大学博士学位论文 .乏. . 《 . . . .. . . , 也 《 止 斗 . 、, ? 《 心 纵. ./、一., . . 基于微透析与超快速液相色谱技术的唑类抗真茵药物经皮药代动力学研 究..:,: ,: 微透析与现代分析技术联用正在被广泛地应用于药物代谢和神经生化分析 等研究中。随着快速、灵敏及微量分析检测技术的进一步发展,微透析取样 技术 在药物代谢研究的应用将取代传统的取样方式,不仅减少了实验动物数、实 验工 作量及工作时间,而且得到的信息更接近真实情况,为新药研究提供准确信息。 微透析液一般主要由在离子强度高的水溶性样品中的少量亲水性成分组成, 这种样品特点也使液相色谱成为与微透析系统结合的首选分析方法。反相或离子 交换液相色谱是最适合于水溶性微透析样品直接进样的液相色谱分离方式,选择 何种色谱分离方式决定于待测化合物的物理化学性质,所用柱的类型、长度、颗 粒大小和内径由预定的取样间隔时间和实验要求的灵敏度确定。在典型分 析中,需要一 样品,这就意味着,若使用 /的灌流速度,则分辨 时间为~ 如果使用更低的微透析液流速来增加回收率,分辨效果会 进一步降低。采用短而更细粒径填料的微柱在分析微透析样品中能达到提高分辨 率及快速分析的目的。微柱液相色谱采用高精度、无脉冲的低流速输液泵;以及 样品池较小的检测器,大大降低了柱外扩散效应,减少色谱系统的死体积,提高第二军医大学博士学位论文 了灵敏度;此外,微柱渗透性好,可通过选用小粒度填料或增加柱长来提高柱效。 如等】用微柱.测定大鼠血液和皮肤微透析液中的氟康唑; 等【】用毛细管柱.同时测定大鼠脑脊液中具有神经活性的胺 和氨基酸。另外,由于微透析样品不含蛋白质和酶等生物大分子,可不经过样品 前处理直接进行分析。等微透析技术与微柱液相色谱相连, 以作为检测手段,测定人鼠脑内.羟色胺。 .唑类抗真菌药物的研究进展 近年来,随着广谱抗菌素、抗肿瘤药和免疫抑制剂的大量应用,放射治疗和 器官移植的广泛进行,导管和插管的普遍开展,以及免疫缺陷患者尤其是艾滋病 患者的急速增加,致使真菌感染大幅度上升】。因此,近年来抗真菌感染已成 为抗感染的主要矛盾,抗真菌药研究已成为世界药物研究的一大热点。唑类抗真 菌药物为真菌羊毛甾醇.去甲基化酶抑制剂,是临床上应用最为广泛的抗真菌 药物,先后研发成功了酮康唑、氟康唑、伊曲康唑等一系列临床主要药物。但是 因该类药物可与人体内的蛋白血红素辅基铁原子配位结合,导致普遍存在 一定的肝肾毒性,而且对唑类耐药的菌株又不断增多,因此迫切需要研发出广谱、 高效、低毒的新一代抗真菌药物】。 第二军医大学药学院张万年教授课题组基于唑类化合物的构效关系,设计并 合成了创新药物候选化合物艾迪康唑,进行了体内药效学和毒理学评价,按一类 新药立项开发。艾迪康唑目前已经完成临床前研究工作,正在中请临床批文。药 效学研究显示,艾迪康唑对深部真菌和浅部真菌均具有很强的活性,鉴于国内浅 部真菌发病率极高,市场潜力大,故首先开发其外用剂型。艾迪康唑与目前临床 上常用的外用抗真菌药咪康唑、特比萘芬和酮康唑相比,具有四大优点:抗真菌 作用强、抗真菌谱广、毒性低、稳定性好。第二军医大学药学院姜远英教授证明 了盐酸小檗碱具有强效协同硝酸咪康唑抗耐药真菌的作用。盐酸小檗碱协同硝酸 咪康唑抗耐药白念珠菌的作用可能主要与其使细胞内产生过量的活性氧、使细胞 周期阻滞、影响麦角甾醇生物合成通路等有关。该研究为抗耐药白念珠菌和寻找 新的抗耐药白念珠菌药物提供了新思路,有必要进一步研究硝酸咪康唑和盐酸小 檗碱合并用药的药代动力学,为复方硝酸咪康唑盐酸小檗碱外用制剂的药效学研 究奠定基础。目前国内外还未见艾迪康唑、硝酸咪康唑与盐酸小檗碱的皮肤 微透基于微透析与超快速液相色谱技术的唑类抗真菌药物经皮药代动力学研究 析技术应用报道。 .艾迪康唑药代动力学研究 闻俊,研究证实大鼠单次口服给药,和 /后消除半衰 期分别为.,.,. ;三个剂量组的分别为.,.和. ?/, / 与给药剂量基本呈正相关。犬单次口服给药,和 后消除半衰期分别为.,.,. ;三个剂量组的分别为.,. . 和 ?/,与给药剂量基本呈正相关。豚鼠单次局部给药,和 ;三 /只后体内血药浓度消除缓慢,消除半衰期分为.,.,. 个剂量组的分别为.,.和.嵋?/,与给药剂量基本呈 正相关。口服给药的药物动力学参数提示对艾迪康唑进行一定的剂型优化和 设计 或者局部的结构改造可以提高其药物作用时间和生物利用度。大鼠单次口服 给药艾迪康唑 ,肝、脾、 /后,能很快分布于大多数器官,给药后. 心、脑、胃和肠的组织浓度达到最 肺和肾的组织浓度达到了最高,给药后. 后,组织中原型药物已经检测不到, 高,此后各组织的药物分布开始下降,至 药物原型在体内没有蓄积。豚鼠局部给药艾迪康唑乳剂 /只后,各主要器官 分布结果显示, 左右组织含量最高, 后组织中检测不到原型药物,药物 原型在体内没有蓄积。皮肤滞留量含量显示,药物在皮肤上形成药物贮库, 缓慢 释放药物,这一分布结果与药代动力学参数大体相符。大鼠单次口服给药艾 迪康唑 胆汁累积排泄量为.%, 粪便累积排泄量为 /后, .%,尿液中的原型药物.%,提示艾迪康唑经胆汁和尿粪排泄的量非常 有限,推测大部分药物可能在体内发生生物转化,生成代谢产物。 .硝酸咪康唑药代动力学研究 文献资料显示硝酸咪康唑的药代动力学,口服 后血药峰浓度为 /, ,终末半衰期/为~ 分布半衰期陀?约为. ,消除半衰期/约为. 。在体内分布广泛,可渗入炎症的关节、眼球的玻璃体及腹腔中,但在脑脊液、 痰液、房水中浓度均甚低,对血脑屏障的穿透性亦差。本品主要经肝脏代谢 灭活 为无活性的代谢物。口服量的~%自尿排出,主要为无活性的代谢物,其中 不到%为原形物,口服量的%以原形自粪便排出。目前尚缺乏本品对皮肤局第 二军医大学博士学位论文 部用药的药代动力学研究资料。硝酸咪康唑的剂型多为复方外用药制剂,过去用 扩散池或测定血药浓度研究药物透皮吸收,而药物在皮肤组织中代谢以及 滞留在皮肤组织中的状况一直无法进行研究。用微透析取样技术则能有效地克服 上述缺陷,研究药物在皮肤中的分布、代谢和药物的透皮吸收状况。 .盐酸小檗碱药代动力学研究 文献资料显示盐酸小檗碱的药代动力学,比格犬静脉注射 /盐酸小檗 . ,为. ,在体内分布较 碱,药时曲线符合二室模型,尼为. 广。盐酸小檗碱在小鼠体内吸收快、分布广泛。.盐酸小檗碱静脉注射给药 后 到 小鼠各组织中放射性分布顺序:肺肝脾肾心肠胃芝脑。 后各组织中仍有放射性分布,肺、肝中浓度最高【】。利用同位素标记的方法对 大鼠口服盐酸小檗碱后进行研究,结果表明给药 和 尿中总放射性为给 药剂量的.%和.%。而粪便中总放射性 后为%,说明盐酸小檗碱在胃 肠道吸收不好【】。. 采用微透析技术同时测定了大鼠静脉给药 盐酸小檗碱 /后大鼠血浆,肝脏和胆汁中小檗碱的含量。在大鼠血浆, 肝脏和胆汁中盐酸小檗碱的回收率分别是%、%和%,大鼠血浆、肝脏和 胆汁中盐酸小檗碱的分布显示小檗碱在肝脏代谢并经过肝胆排泄。 .基于微透析技术的药代动力学与药效学研究 与传统取样方法相比,微透析技术在药物药代动力学, .药效学,结合研究/.中具有以下显著特点: 、可连续跟踪体内多种化合物浓度随时问的动态变化,其良好的时间分辨性, 可使药代动力学资料更准确;、取样无需匀浆过程,可真实代表取样位点目标 化合物的浓度。同时可以对同一动物进行多个部位取样,研究目标化合物的体内 分布;、能够直接对细胞外液中的物质进行分析,与血液取样技术相比,药物 在细胞外液中的浓度与其药理或毒理作用的相关性更大;、可在清醒、自由活 动的动物个体上取样,在接近正常生理条件下得到实验结果,更有科学性和实际 意义:、能够避免传统血液取样后由于体液容量减少而引起的药物、行 为的改变,能够实现对组织长时间持续取样而不造成体液损失.】。 现阶段一些药物的研究还主要依赖于体外模拟实验如抗微生物药物。对基于微透析与超快速液相色谱技术的唑类抗真菌药物经皮药代动力学研究 于这些药物的/.研究,一般采用非同步研究的方法,将体内实验和 体外实验相结合。在对微生物药物进行研究时,先对动物进行取样,通 过对所得透析液进行检测,得到组织或细胞外液巾药物浓度.时间关系。随后将 来自患者体内的微生物在体外环境中进行培养,根据所得到的药物浓度时间曲 线模拟体内环境中的给药条件,进行体外抑菌实验,通过检测微生物死亡数目随 时间的变化,得到药物效应.时间关系,将和数据经过.模型拟合, 得到浓度.效应.时间曲线】。抗感染药的.结合研究能够描述药物对微生 物产生效应的时间动力学过程及时间作用类型。随着技术的发展,它能够实 现对真菌周围组织间液中游离态药物浓度的持续监测,具有良好的时间分辨性, 有利于将体内与体外实验动态结合起来,不仅可以提供信息,而且 可以同时进行研究,对于全面反映药物、机体及微生物三者之间的关系,评 价药物疗效,制定最佳的给药方案具有重要的理论和实际意义。等】 利用技术研究了环丙沙星的体内行为,并将其与体外模拟实验相结 合,预测药物的浓度.效应关系。对名受试者注射环丙沙星各 ,采用 技术监测其体内游离态环丙沙星浓度随时间的动态变化。随后将来自于患者 体内的铜绿假单胞菌在体外培养,根据体内浓度时间曲线模拟体外给药。结果表 明通过/.能够有效地将环丙沙星的药物浓度与其所产生的效应相联系, 预测药物的体内行为,为确定合理的给药剂量提供科学依据。等】 也对环丙沙星进行了相关研究,通过/?评价了其软组织穿透能力对血 液微循环的影响。对名健康受试者静脉注射环丙沙星 ,采取肢体保温 与不保温对照研究方法,利用技术测定受试者及皮下脂肪,并用激 光多普勒血流仪对微循环血流量进行测定。结果表明对肢体采取保温措施有利于 增强环丙沙星对软组织的穿透能力,促进血液微循环的改善,同时环丙沙星对软 组织穿透力与其在靶部位的抗微生物效应之间呈正相关。, .课题设计思路 目前抗真菌新药研发进入了一个快速发展的新阶段,本课题研究对象艾迪康 唑是设计并合成的新药,复方硝酸咪康唑