牙髓干细胞的研究

牙髓干细胞的研究 牙体牙髓牙周病学杂志(ChinJConservDent)2004,14(7)?407? 圈 牙髓干细胞的研究 张春艳综述:孙善珍,李纾审校 (山东大学口腔医学院,山东济南250012) [摘要]牙髓干细胞是存在于牙髓组织中的一种成体干细胞,具有高度增殖,自我更 新的能力和多向分 化的潜能.牙髓干细胞的研究对牙组织工程和牙齿的再生将产生重要的意义.本文 就牙髓干细胞的研究现状作 一 综述,并对其应用前景以及目前存在的问进行讨论. [关键词]牙髓干细胞;成体干细胞;牙组织工程 [中图分类号]R78o.2[文献标识码]A[文章编号]1005—2593(2004)07—0407一o4 [牙体牙髓牙周病学杂志,2004,14(7):407] Thestudyofdentalpulpstemcells ZHANGChun—yan (CollegeofstomatologyofShandongUniversity,Jinan250012,China) [Abstract]Dentalpulpstemcells(DPSCs)areakindofadultstemcellsinthepulp,andpossess stem—cell qualities,includinghighproliferationrate,self—renewalcapability,andmulti— lineagedifferentiation.Furtherstudyof DPSCswilllikelyhaveapositiveimpactondentaltissueengineeringandtoothregeneration. Thisreviewincludesthe prospectsofapplicationandproblemsexistedofDPSCs. [Keywords]dentalpulpstemcells;adultstemcells;dentaltissueengineering [ChineseJournalofConservativeDentistry,2004,14(7):407] 干细胞是人体的起源细胞,具有自我复制,高度 增殖和多向分化的能力.按其来源分为胚胎干细胞 (embryonicstemcells,ESCs)和成体干细胞(adult stemcells,ASCs).成体干细胞是存在于已分化组 织器官中未分化的多能干细胞,其在人体造血和组 织修复等方面起着重要的作用.成体干细胞的一个 突出的特性是"可塑性",又称为"横向分化",即成 体干细胞不仅能进行定向分化,而且可以在特定条 件诱导下实现重新编程(reprogramming)而进行横向 分化….目前已从人体众多组织中分离出成体干细 胞.人牙髓组织中同样存在着成体干细胞——牙髓 dentalPulpStemCells,DPSCs),并具有干细 干细胞( 胞的特性.本文就牙髓干细胞的研究进行综述. 收稿日期:2003—08—14;修回日期:2003—10—16 作者简介:张春艳(1977一),女,汉族,山东青岛人.硕士生(导 师:孙善珍) 1牙髓干细胞的命名 牙齿出生后,若受到轻度刺激可进行牙本质的 再生和修复,此过程是由成牙本质细胞参与形成的. 而成牙本质细胞为终止细胞,一旦分化不能再分裂, 因而推测这种局部修复能力是由能分化为成牙本质 细胞的祖细胞群落维系的,并且这类祖细胞群落就 存在于牙髓中.但目前对于这种祖细胞群落知之甚 少,Couble等对发育早期的牙髓进行体外培养,发 现可分化形成成牙本质细胞,并出现矿化结节,在实 验中加入B一甘油磷酸钠诱导分化后,牙髓细胞出 现极化,形成突起,并分泌基质,而后出现矿化,x线 显微明有钙,磷的沉积,电子衍射证明矿化中 晶体结构的存在,从而证实了牙髓中存在着能分化 为成牙本质细胞的祖系细胞群. Gronthos等利用酶消化的方法,将人类健康 ? 408?牙体牙髓牙周病学杂志(ChinJConservDent)2004,14(7) 的第三磨牙牙髓制成单细胞悬液并培养,得到具有 形成细胞克隆能力和高度增殖能力的细胞,将其命 名为牙髓干细胞(DPSCs).对DPSCs的研究尚在进 行之中,最近,Miural4从脱落乳牙的牙髓中分离到 具有多向分化能力的干细胞,将其命名为SHED (stemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteeth, SHED).SHED体外培养时表现的性质与DPSCs有 一 定的相似性,因而脱落的乳牙牙髓是否可以成为 牙髓中干细胞的又一来源,尚需进一步的研究证实. 2牙髓干细胞的性质 2.1高度的增殖能力 目前骨髓基质干细胞(bonemarrowstroma cells,BMSCs)研究较为成功,Gronthos借鉴BMSCs 的研究方法,将DPSCs和BMSCs进行了对比研究. 在体外培养的细胞中加入溴脱氧尿嘧啶(Brdu),然 后检测第一代DPSCs和BMSCs的增殖率,发现在体 外培养中DPSCs的增殖率比BMSCs更高,DPSCs平 均约有72%Brdu阳性细胞,而BMSCs约有46% Brdu阳性细胞,并且DPSCs在以后的传代中依然保 持着较高的增殖能力.研究表明BMSCs可从骨髓 抽取液中分离到,贴附于培养板上,通过适当的刺激 开始增殖可形成克隆,所获得的每一个克隆均来源 于一个干细胞.Gronthos将牙髓细胞悬液和骨髓细 胞悬液中克隆形成率作了对比,结果发现成人牙髓 细胞具有较高的克隆形成能力,可以推测牙髓细胞 悬液中的干细胞含有率较高. 2.2自我更新能力 Gronthos从原代DPSCs移植物中分离出基 质样细胞,在体外培养扩增后,再植入10周龄的免 疫缺陷小鼠皮下,结果又形成了牙本质一牙髓样复 合体,对形成的牙本质进行免疫组化检测,发现其 抗牙本质涎磷蛋白(dentinsial叩h0sph叩r0tein, DSPP)阳性,证实DPSCs具有自我更新的能力. 2.3多向分化的潜能 DPSCs在L一维生素c和地塞米松诱导5,6 周后可形成矿化结节,茜素红染色阳性.将DPSCs 复合到羟基磷灰石一磷酸三钙(HA—TCP)支架 上,后移植到免疫缺陷小鼠皮下,6周后,发现形成 其中成牙本质样细胞的突起 牙本质一牙髓样组织, 深入到形成的牙本质基质中,牙髓样纤维组织中还 出现了血管.而且DPSCs移植物表达骨唾蛋白 (bonesialoprotein,BSP),骨钙素(osteocalcin,OC) 以及DSPP.通过检测,还显示DPSCs形成的矿化 基质呈球型钙化,方式类似原代牙本质.这表明 DPSCs体外培养可分化为成牙本质样细胞和成纤 维细胞,复合到支架材料上可形成牙本质一牙髓样 组织. Gronthos2002年在培养基中加入 0.5mmol/L异丁基甲基黄嘌呤,0.5(nlU)mol/L氢 化可的松,60(nlU)mol/L消炎痛,对DPSCs进行 成脂诱导.5周后,出现了油红O染色阳性的脂滴 —— 这是脂肪细胞所具有的特征,并且利用RT— PCR方法检测发现脂肪细胞所具有的两种特异性 转录因子表达上调.脂肪细胞虽不是牙髓组织中 正常的组成成分,但体外诱导DPSCs可分化为脂肪 细胞,从而体现了干细胞的"可塑性". 牙髓组织内神经很丰富,对各种刺激反应敏 感.About检测到体外培养的牙髓细胞表达神经 巢蛋白(nestin).Nosrat研究发现牙髓细胞能产生 多种神经营养因子,与三叉神经元复合培养可刺激 轴突的生长,而皮肤成纤维细胞无此功能. Gronthos等利用RT—PCR技术发现牙髓的起源 细胞——DPscs表达神经巢蛋白和胶质纤维酸蛋 白(glialfibrillaryacidprotein,GFAP),这两种蛋白 是神经前体细胞和神经胶质细胞的标志,表明体外 培养的DPSCs可以向神经样细胞方向分化. RPC—C2A细胞系是从Wistar鼠切牙牙髓中 分离的克隆细胞系,该细胞系可高表达碱性磷酸酶 (ALP)活性.Ueno等应用成骨细胞的MC3T3 一 E1细胞与RPC—C2A细胞进行复合培养,9d后 发现RPC—C2A细胞出现了Vonkossa染色阳性 的矿化结节,而单独的RPC—C2A体外连续培养 28d才能出现矿化.MC3T3一E1细胞的加入,诱 导了RPC—C2A细胞迅速出现矿化.实验中检测 到诱导后的RPC—C2A细胞ALP活性显着增高, 骨桥素(osteopontin,OPN),骨黏连素(osteonectin, ON)表达降低.并发现诱导后的该细胞其高表达 0c——成骨细胞的标志性蛋白,却未检测到 DSPP——牙本质的标记性蛋白.实验说明MC3T3 一 E1细胞的加入诱导RPC—C2A细胞向成骨细胞 方向分化.人DPSCs是否也具有向成骨细胞分化 的潜能,尚需进一步研究探讨.从脱落乳牙中分离 的SHED与DPSCs性质相似,体外经诱导培养可 分化为神经样细胞,脂肪细胞,成牙本质细胞.但 SHED可诱导骨形成,并且SHED不能形成牙本质 牙体牙髓牙周病学杂志(ChinJConservDent)2004,14(7)?409? 一 牙髓复合体,这与DPSCs有一定的区别]. 3牙髓干细胞的分子标记 目前发现与干细胞有明确联系的分子标记还 不多.因为缺乏干细胞的特异性标记,所以直接筛 选干细胞仍存在着很大的困难.目前,对造血干细 胞的表面标记研究较为清楚,可通过CD34加 CD38或CD34加KDR标记加以纯化,人类或灵 长类ESCs则表达SSEA一3,SSEA一4(Stage—spe- eifieembryonicantigen,SSEA).迄今为止.对 DPSCs的标记物的研究尚不够理想,只能通过相关 的特性对DPSCs进行确认,如高度的增殖能力,体 外的多向分化能力等,其特异性的标记物尚有待于 进一步研究.现有的研究状况如下:Gronthos 等利用体外免疫组化方法检测DPSCs表面分子 标记,并与BMScs比较,结果显示DPSCs和BMSCs 有很多相似之处.BMSCs和DPSCs均表达与内皮 (血管细胞黏附分子1一CD146),平滑肌(o【一平滑 肌肌动蛋白),骨(ALP,I型胶原,ON,OPN,OC)以 及成纤维细胞(?型胶原,FGF2)有关的表面分子 标记.骨基质蛋白,BSP在DPSCs中不表达,而在 BMSCs是低水平表达.此外,用DSPPmRNA特异 性探针t通过No~hernblot显示DSPP小在DPSCs中 表达.DSPP是主要的牙本质特异性蛋白,原位杂 交显示鼠DSPP表达于成牙本质细胞,前期牙本 质,牙本质和牙髓细胞?J.这表明DPSCs处于未 分化状态,不表达DSPP. 为了进一步研究比较DPSCs与BMSCs的性 质,Shia等…应用基因芯片技术(microarray)分析 研究了DPSCs和BMSCs的基因表达情况.DPSCs 和BMSCs在人类的4000多个基因表达水平上是 一 致的,但少数基因如XV?o【1胶原(COLL 181),胰岛素样生长因子一2(IGF一2),酪氨酸激 酶2,NAD(P)H维生素K3氧化还原酶以及细胞周 dependentkinase6, 期依赖性蛋白激酶6(cyclin— CDK6)在DPSCs中表达量较高,而胰岛素样生长 因子结合蛋白7,Io【2型胶原(COLL12)在BM. SCs中表达较高. 4牙髓干细胞的分子调控机制 ASCs生存在一个特殊的微环境中(niche),微 环境中的信号分子调控着干细胞维持在正常的功 能状态.ASCs具有高度的可塑性——跨系统多向 分化的能力,其中微环境在干细胞的分化方向上起 着重要的调节作用.目前对干细胞分裂和分化的 具体调节机制尚不清楚,但普遍认为干细胞未分化 状态的维持是由细胞间通过膜结合蛋白的相互作 用调节的,Norteh信号就参与了该过程.Norteh 信号被认为与多种组织的干细胞分化有关如:神 经,胰腺,表皮等--. 目前对于DPSCs分化,分裂的调节机制尚未 有报道.但对小鼠切牙上皮干细胞的调控机制已 有研究.Haradaal13]等对鼠切牙根尖末端培养中, 发现Norteh信号和FGF10信号共同调节着上皮干 细胞的分化和增殖,从而维持着小鼠切牙终生不断 的萌出.FGF信号是一种间充质信号,可刺激颈环 上皮干细胞及其子代细胞的分裂.Tummers研究 发现BMP4信号同FGF10一起参与了上皮干细胞 的调节,并发现小鼠磨牙发育后期由于缺乏Norteh 和FGF10的信号对上皮干细胞的调节,而停止了 生长. 牙齿的发生是在上皮和间充质的相互诱导作 用下完成的,重组实验证实:间充质决定着牙齿的 形状,调节牙上皮的持续生长.因而,调节上皮干 细胞的信号分子可能也会作用于DPSCs,这问题还 需进一步研究探讨. 5牙髓干细胞的应用和展望 牙齿的损坏或缺失,严重影响着人们的健康. 目前所进行的各种治疗方法均存在着不同的缺陷, 修复效果与天然健康的牙齿相距甚远.牙髓干细 胞的研究,将为探讨牙体的修复,自体牙的再造和 克隆,开辟广阔的前景.可以设想DPSCs将来可 成功用于以下两个方面:?DPSCs可作为组织工程 中的种子细胞.将DPSCs体外培养扩增并与合适 的支架材料复合,再植到去牙髓的根管内,诱导牙 本质牙髓复合体产生,可以将死髓牙变成有活力牙 髓的牙齿.?由于DPSCs具有多向分化的潜能, 可能仍具有牙乳头的性质,因而可与牙胚上皮组 合,在一定的环境中,模拟牙胚发育过程中上皮与 间充质相互诱导发生的过程,可能诱导形成牙胚. 假如这种设想能够实现,那么将对口腔医学的发展 产生划时代的意义. Nakashima14]等用电穿孔法将生长一分化因 子11(growth—differentiationfactor11,GDF11)基因 导入DPSCs,诱导其分化为成牙本质细胞,以便提 ? 4l0?牙体牙髓牙周病学杂志(ChinJConservDent)2004,14(7) 高牙髓愈合,形成牙本质的能力,结果诱导DPSCs 分化,并表达牙本质涎蛋白(Dentinsialoproteion, DSP)——牙本质特异性蛋白.该研究为牙体牙髓 疾病提供了一种基因治疗的途径. 总之,随着科研新技术的不断应用,各个组织 中干细胞的研究将13趋完善.DPSCs的发展也面 临许多问题:?寻找DPSCs特异性标志;?研究 DPSCs在牙髓中定位;?探讨调控DPSCs分裂,分 化的机制;?进一步研究DPSCs的体外定向分化 和增殖的条件.随着这些问题的深入研究和解决, 我们有理由相信牙髓干细胞将具有极其广阔的应 用前景,它在研究与应用方面上的成功,将在口腔 医学史上产生深刻的影响. 参考文献: SuraniMA.Reproguammingofgenomefunctionthroughepige— netieinheritance[J].Nature,2001,414(6859):122 CoubleMV,FargesJC,BleicherF,eta1.Odontoblastdifferentia— tionofhumandentalpulpcellsinexplantcultures[J].Calcif Tissue,n厂,2000,66(2):129 GronthosS,MankaniM.BrahimJ,a1.Postnatalhumandental pulpstemcells(DPSCs)invitroandinvivo[J].ProcNatlAcad ScUSA,2000,97(25):I3625 MiuraM,GronthosS,ZhaoM.eta1.SHED:stemcellsfromhu— manexfoliateddeciduousteeth[J].ProcNatcAcadSciUSA, 2003,100(10):5807 GronthosS,BrahimJ,LiW,eta1.Stemcellpropertiesofhuman dentalpulpstem(:ells[J].JDentRes,2002,81(8):531 [6]Kasugais,AdachiM,OguraH.Establishmentandchracterization ofaelonalcellline(Rpc—c2a)fromdentalpulpoftheratinci— sor[J].ArchOralBiol,1988,33(12):887 [7]UenoA,KitaseY,MoriyamaK,eta1.Mc3T3一El—conditioned mediuminducedmineralizationbyelonalratdentalpulpcells [J].PatholBiol,2002,50(3):194 [8]ZieglerBL,ValtieriM,PoradaGA,eta1.KDRrecepter:akey markerdefininghematopoietiestemcells[J].Science,1999,285 (5433):1553 [9]ThomsonJA,Itskovitz—EldorJ,ShapiroSS,eta1.Embryonic stemcelllinesderivedfromhumanblastncysts[J].Science, 1998,282(5391):1l45 [10]OhmaN,TakagiY,TakanoY.Distributionofnon—collagenous dentinmatrixproteinsandproteoglyeans,andtheirrelationto calciumaccumulationinbisphosphonate—affectedratincisors [J]EurJOralSci,2000,108(3):222 [11]ShiaS,RobeyaPG,GronthosaS.Comparisonofhumandental pulpandbonemarrowstromalstemcellsbycDNAmieroarraya— nalysis[J].Bone,2001,29(6):532 [12]CarlessoN,AsterJC,SklarJ,eta1.Notchl—induceddelayof humanhematopoieticprogenitorcelldifferentiationisassociated withalteredcellkinetics[J].Blood,1999,93(3):838 [13]HaradaaH,KettunenaP,JungaHS,eta1.1ocationofputative stemcellsindentalepitheliumandTheirAssociationwithnotch andFGFSignaling[J].JCellBiol,1999,147(1):105 [14]NakashimaM,MizunumaK,MurakamiT,eta1.Inductionof dentalpulpstemcelldifferentiationbyeletroporation—mediated genedeliveryofgrowth/differentiationfactorII(GDFII)[J]. GeneTherapy,2002,9(12):814 关于"牙本质一牙髓复合体" 一 词的译名 史俊南.金岩 (第四军医大学口腔医学院,陕西西安710032) 由于牙本质和牙髓在胚胎学,组织学和功能上 有极为密切的关系,所以近几十年来常将二者称为 复合体.在英美一些教科书或专着上有:dentino— pulpcomplex,dentin—pulpcomplex,pulp—dentin complex,pulpodentincomplex等名词,因而在我国 书刊上也就出现"牙本质一牙髓复合体","牙髓一 牙本质复合体",甚至还有"牙髓牙本质器官" 等等. 鉴于与其他专业名词一致,例如"enamo—den— tinjunction","dentiono—enamaljunction"译为"釉 牙本质界",而不译为"牙本质釉质界",我们推荐 将dentin—palpcomplex译为"牙本质一牙髓复合 体",不用"牙髓一牙本质复合体". l_鬣E瞻EE群靛联联露匿群鞋甄E嚣蕻釜=鼙E联群群联鹾群酵瞰群黔萄蓝匿-衄酵联E鞋薛i窜鼠匿醚匿睡睦昔誓麒i盔群《瞄劈薛群联群E ]]]]] ?2345