基因工程制备干扰素

基因制备干扰素 第 I 页 共 11 页 毕业论文(设计) 目 姓 名 专 业 指导教师 浅谈基因工程生产人干扰素 乔雪姣 学号 微生物技术及应用 鞠守勇 职称 讲师 11111807 中国?武汉 二?一二年十一月 目 录 摘 要 .............................................................................................................. 错误～未定义书 签。 关键词 ............................................................................................................ 错误～未定义 书签。 Abstract ............................................................................................................................................. 3 Key words ....................................................................................................... 错误～未定义书 签。 前言 .................................................................................................................................................. 4 1、干扰素作用及其机理详述 ......................................................................................................... 4 1.1干扰素的种类 .................................................................................................................... 5 1.2干扰素的性质 .................................................................................................................... 5 1.3干扰素的作用 .................................................................................. 错误～未定义书签。 1.3(1 干扰素的作用 ........................................................................... 错误～未定义书签。 1.3.2 干扰素的作用示意图 ................................................................. 错误～未定义书签。 1.4 干扰素的作用机理 ......................................................................... 错误～未定义书签。 2、基因工程 ..................................................................................................................................... 6 2.1 基因工程的概论 ............................................................................................................... 6 2.2 基因扩增基本过程 ........................................................................................................... 6 2.2.1基因的体内扩增 ............................................................................................................ 6 2.2.2基因的体外扩增——PCR技术 ..................................................................................... 6 2.3 基因操作中的载体 ......................................................................... 错误～未定义书签。 2.3.1对载体的认识 .............................................................................. 错误～未定义书签。 2.3.2大肠杆菌载体 ................................................................................................................ 6 2.3.3 pBR322质粒载体的特点 .............................................................................................. 7 2.4基因的导入 ........................................................................................................................ 7 2.4.1 基因导入的概念 ........................................................................................................... 8 2.4.2基因导入的 ............................................................................................................ 8 2.5基因的导入后的筛选与鉴定 ............................................................................................ 8 2.5.1筛选与鉴定的原因 ........................................................................................................ 8 2.5.2筛选与鉴定的方法 ........................................................................................................ 8 2.6目的基因的表达与鉴定 .................................................................................................... 8 2.6.1目的基因表达与鉴定的原因 ........................................................................................ 8 2.6.2目的基因的表达系统与鉴定方法 ................................................................................ 8 3.基因工程生产干扰素 ................................................................................................................... 8 3.1干扰素目的基因的分离与扩增 ...................................................................................... 10 3.2目的基因与克隆载体进行体外重组 .............................................. 错误～未定义书签。 3.3重组质粒转入大肠杆菌宿主细胞 ……...………………………………………………9 3.4受体菌的筛选…….............................................................................................................9 3.5构建工程菌….....................................................................................................................9 3.6干扰素的提取与纯化……............................................................................................... 10 4.基因工程生产干扰素总 结….......................................................................................................10 参考文 献……..................................................................................................................................10 致 谢...……………………………………………………………………………………………...11 2 浅谈基因工程生产人干扰素 摘要 非特异免疫是针对病毒感染的第一道防线。其中，干扰素和NK细胞起主要作用。干扰素 (IFN)是病毒或其他干扰素诱生剂刺激所产生的一类分泌性蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤和 免疫调节等多种生物学活性。最早的干扰素是从人的白细胞中提取，不易获取，价格昂贵; 随着人类在科学上的发展和进步，人们开始尝试着利用基因工程技术来获取所需要的干扰 素。 关键词 干扰素 基因工程 PCR 非特异性免疫 大肠杆菌 质粒 DNA限制性 工程菌 白细胞 pBR322 连接酶 Briefly Discussion on gene engineering for production of human interferon Abstract 3 Non specific immunity is the first line of defense against virus infection. Wherein, interferon and NK cell a major role. Interferon ( IFN ) is a virus or other interferon inducer stimuli generated by a class of secreted protein, anti-virus, anti-tumor and immune regulation and other biological activity .The earliest interferon from human white cell extract, is not easy to obtain, expensive; as human in science development and progress, people began to try to use genetic engineering technology to obtain the required interferon. Key words Interferon，gene engineering，PCR，non-specific immunity，Escherichia coli，Plasmid DNA ligase，restriction enzyme，engineering bacteria，white blood cells 前言 干扰素是英国医生Isaacs和Lindemann于1957年在研究流感病毒时首先发现的。人体有 些细胞在特殊诱导剂的刺激下，能合成分泌高活性多功能的干扰素家族，它们作用与相应的 其他靶细胞，并使其获得抗病毒或抗肿瘤等多方面的免疫力。 20世纪70年代，随着干扰 素临床应用研究的不断积累，在世界范围干扰素作为第一个临床用于肿瘤治疗的细胞因子， 现如今主要用于肿瘤支援疗法、慢性肝炎、类风湿性关节炎等多种疾病的治疗。 通过基因工程手段将合成干扰素的基因导入以大肠杆菌为工程菌的细胞 干扰素(IFN) 是病毒或其它因素如干扰素诱生剂，剌激脊椎动物组织细胞(体 外或体内)产生的一种能干扰病毒增殖的特殊蛋白质。当病毒与细胞DNA中干扰素基因 的“抑制物”结合时，消除抑制作用，将导致产生特异mRNA合成干扰素;或干扰素被释放以 后进入另一个细胞，与细胞“作用因子约束物”结合导致产生干扰素。 4 1.1、干扰素的种类 人干扰素要根据其主要合成细胞以及抗原性的不同分为α、β和γ三种类型，其中α-干扰 素又存在多种结构序列不同的亚型，分别为α1、α2和α3等。α-干扰素和β-干扰素分别由白 细胞和成纤维母细胞合成并分泌;γ-干扰素主要有激活的T细胞和NK细胞产生，抗原、细 胞分裂素、白细胞介素-1和-2等均可刺激其合成。 1(2、干扰素的性质 • 干扰素是诱生蛋白，正常细胞一般不自发产生干扰素，只具有合成干扰素的潜能。 正常状态下干扰素的基因处于被抑制的静止状态，在有诱发剂存在的条件下，便能摆脱抑 制、获得表达。利用半数细胞病变抑制法(CPEI50)测到诱导生成的干扰素活性干扰素的分子 量一般在2O,100 kD，一般在56?下30 min不会被灭活，-20?下可长期保存。在pH稳 定性方面，I型干扰素具有耐酸性，在pH 2(O,10(0中很稳定。?型干扰素不耐酸，也 不耐热，即在pH 2时不稳定，在56?下30 min会被破坏。干扰素一般由13O,17O个氨基 酸组成，含17种以上的氨基酸，其中的天冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸含量较高。 1.3、干扰素的作用 1.3.1 干扰素的作用 ?型干扰素在抗病毒和抗肿瘤方面的作用主要表现为(1)诱导宿主细胞产生抗病毒蛋白，干扰病毒复制;(2)增强NK 细胞对病毒感染细胞和肿瘤细胞杀伤;(3)促进MHC-?类分子表达，增强CTL对病毒感染细胞和肿瘤等靶细胞的杀伤。在免疫调节方面与?型干扰素类似。 ?型干扰素主要起免疫调节作用，主要表现在(1)活化巨噬细胞;(2)促进APC(s)表达MHC-?类分子，提高抗原递呈能力;(3)促进MHC-?类分子表达和增强CTL细胞的杀伤活性;(4)增强NK细胞的杀伤活性;(5)促进B细胞分化、增殖;(6)抑制Th2细胞分化及细胞因子合成。在抗病毒和抗肿瘤方面的作用与?型干扰素类似。 1.3.2 干扰素的作用示意图 干扰素不能直接灭活病毒，而是通过诱导细胞合成抗病毒蛋白(AVP)发挥效应。干 5 扰素首先作用于细胞的干扰素受体，经信号转导等一系列生休过程，激活细胞基因表达多种抗病毒蛋白，实现对病毒的抑制作用。抗病毒蛋白主要包括2′-5′A合成酶和蛋白激酶等。前者降解病毒mRNA、后者抑制病毒多肽链的合成，使病毒复制终止。干扰素的作用特点:?间接性:通过诱导细胞产生抗病毒蛋白等效应分子抑制病毒。?广谱性:抗病毒蛋白是一类酶类，作用无特异性。对多数病毒均有一定抑制作用。?种属特异性:一般在同种细胞中活性高，对异种细胞无活性。?发挥作用迅速:干扰素既能中断受染细胞的病毒感染又能限制病毒扩散。在感染的起始阶段，体液免疫和细胞免疫发生作用之前，干扰素发挥重要作用。 2、基因工程 2、1基因工程的概论 基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子生物学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝 图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。 2.2基因扩增基本过程 2.2.1 基因的体内扩增 生物的遗传性状是由基因所编码的遗传信息决定的。基因工程操作首先要获得基因，才能在体外用酶进行“剪切”和“拼接”，然后插入由病毒、质粒或染色体DNA转入微生物或动植物细胞使其复制，由此获得基因克隆。 2.2.2 基因的体外扩增——PCR技术 基因的体外扩增可通过DNA聚合酶链式反应即PCR技术来实现。PCR技术是一种体外快速扩增DNA的方法，是目前基因克隆技术中最简单、有效和灵敏的方法。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR反应需要两条寡核苷酸引物，分别与两条链互补结合，经过变性、退火和延伸三步多次循环获得目的DNA片段。延伸反应由热稳定DNA聚合酶催化，常用的是TaqDNA聚合酶。PCR反应产物呈指数增长，一般经过25~30个循环，目的DNA片段就可达到百万个拷贝。 2.3基因操作中的载体 2.3.1 对载体的认识 载体的认识和应用是基因操作的重要环节之一。所谓载体是指携带外源DNA进入受体细胞的运载工具，它的本质是DNA复制子。载体一般必须具备以下3个基本条件:?具有复制原点，能在宿主细胞内自主复制，并携带重组DNA分子一同扩增;?具有合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不能影响其复制;?有一定的选择标记，用于筛选重组DNA。另外，载体最好有较高的拷贝数，便于其制备。基因操作中常用的载体包括质粒载体，噬菌体载体和柯斯质粒载体等。 2.3.2大肠杆菌载体 大肠杆菌是迄今为止研究的最为详尽的原核细菌，其K-12MG1655株的4000多kb的染色体DNA已测序完毕，全基因组共含有4405个开放型阅读框架，其中相当一部分基因的生物功能已被鉴定。作为一种成熟的基因克隆表达受体细胞，大肠杆菌广泛用于分子生物学研究的各个领域，如基因分离扩增、DNA序列分析、基因表达产物功能鉴定等。由于大肠杆菌 6 繁殖迅速，培养对象易于控制，利用DNA重组技术构建大肠杆菌工程菌大规模生产真核生物基因尤其是人类基因的表达产物，具有重大的经济价值。目前已实现商品化的30多种基因工程产品中，大部分是由大肠杆菌生产的。 2.3.3 pBR322质粒载体的特点 (1)具有较小的分子量，避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂,pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段 (2)具有两种抗菌素抗性基因(四环素、氨苄青霉素抗性基因)可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子,便于分子克隆的筛选。 (3)含有高效的自主复制成分，质粒的复制和宿主的繁殖不相关，在抑制细菌蛋白质合 成时，细菌染色体DNA 停止复制，但质粒可以继续利用细菌原有的酶系统进行复制。 (4)限制性内切酶单一切口，在质粒复制子以外的部位具有一种或多种限制性内切酶的单一切口，便于外源基因的插入。 2.4基因的导入 2.4.1基因导入的概述 把已知基因转移到真核细胞，并且整合到基因组中得到稳定表达的技术，称为基因导入。它是改变物种遗传性状的最根本途径。要把基因导入细胞，首先要把细胞克隆化。目前已经得到了若干真核细胞克隆化基因，如β-珠蛋白基因，TK基因等。利用显微镜操作把这些基因注入到小鼠受精卵的原核中，再把受精卵植入到生殖管道中， 发育成的个体不仅能表达注入 7 基因决定的性状，而且能把该基因传到第二代。 2.4.2基因导入的方法 基因导入的方法总体有物理方法，化学方法和生物学方法。其中物理方法主要有DNA直接注射法、颗粒轰击技术;化学方法主要有脂质体载体、受体介导法;生物学方法主要通过构建病毒载体来完成，常见的有逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒等。 2.5基因的导入后的筛选与鉴定 2.5.1筛选与鉴定的原因 由于DNA分子的体外重组是分子群体间的反应，因此连接反应完成后的体系中不仅含有正确的重组子，还含有一些不正确的重组子及为重组的DNA，如载体自身环化形成的DNA分子，外源DNA片段彼此相连形成的多聚物等。因此，连接物转化受体细胞后，我们需要采用适当的方法将所需要的目的基因转化重组子从非重组子中和细胞群体中筛选和鉴定出来。重组子的筛选与鉴定是基因克隆的重要步骤。 2.5.2筛选与鉴定的方法 筛选与鉴定的方法，在遗传选检测上有插入失活筛选、蓝白斑筛选;在物理检测上有酶切鉴定、PCR检测;此外还可利用核酸分子杂交检测，免疫学检测，核酸序列分析等方法。 2.6目的基因的表达与鉴定 2.6.1目的基因表达与鉴定的原因 克隆的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，克隆基因表达出所编码的蛋白质可供做结构与功能的研究。有些具有特定生物活性的蛋白质在医学上以至在工业上都是很有应用价值的，可以克隆其基因使之在宿主细胞中大量表达而获得。 2.6.2目的基因的表达系统与鉴定方法 迄今为止，已建立的基因表达系统有多种，包括原核生物表达系统和真核生物表达系统。常用的原核生物表达系统有大肠杆菌表达系统，芽孢杆菌表达系统和链霉菌表达系统等;常用的真核生物表达系统是酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统和昆虫细胞表达系统等。而其中最具代表性的是大肠杆菌表达系统和酵母菌表达系统。 目的蛋白的鉴定方法包括生化反应检测法，免疫学检测法和生物学活性检测法等。常用的有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western杂交、等点聚焦电泳和双向电泳等。 3、基因工程生产干扰素 3.1、干扰素目的基因的分离与扩增 (1)破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA (2)将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶电泳切取相对分子质量为 256bp的部分 (3)mRNA反转录成cDNA cDNA第一链的合成(Reverse Transcription)。 选用GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒使用Oligo(dT)引物(因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。属于亲和层析技术。) 在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl，轻轻混匀、离心; 70?加热10min，立即将微 8 量离心管插入冰浴中至少1min。 然后加入下列试剂的混合物: 10×PCR buffer 2μl 25mm MgCl2 2μl 10mM dNTPmix 1μl 0.1M DTT 2μl 轻轻混匀，离心。42?温育2-5min; 加入Superscript?1μl ，在42?水浴中温育50min; 于70?加热15min以终止反应; 将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37?温育20min，降解残留的RNA。-20?保存备用. (4)PCR扩增目的基因 双链cDNA在94?预变性5min，94?变性30s，迅速冷却到50?，引物退火并结合到靶序列上复性2min，然后快速升温至70,75?，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸 (5)从PCR中分离目的基因 • PCR扩增产物电泳 • 将PCR扩增产物适当浓缩(开盖)后，全部上样与2.5%的琼脂糖(TEA)缓冲液， 电压60V，电泳时间2h。通过凝胶成像系统观察分析谱带的形状，切取512pb处的 目标片段，双蒸水洗涤三次，离心得目的基因。 • 测序:Sanger双脱氧链终止法 (6)人工加尾形成 “粘性末端” 3.2、目的基因与克隆载体进行体外重组 (1) 将 cDNA 重组到载体上 合成的 cDNA 与载体 DNA 进行连接一般有 3 种方法: ? 借助于末端转移酶的 3’ -OH 端合成均聚物的能力，双链 cDNA 和线性化载体 DNA 的 3’ -OH 端分别加上均聚核苷酸链; ? 双链 cDNA 和线性化载体 DNA 分别用 Klenow 片段进行末端补平，然后用 T4 DNA 连接酶进行齐头连接，形成重组体; ? 通过粘性末端连接 (2) 提取载体(质粒、病毒等)，双酶切，再把干扰素基因的PCR产物用相应的酶酶切，用连接酶连接。 3.3、重组质粒转入大肠杆菌宿主细胞 将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒pBR322中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。当不同重组的 DNA 含有不同的 cDNA 基因时，整个转化子含有来自 mRNA 群体的各种 cDNA 基因，这样的转化子群体构成该 mRNA 全部遗传信息的 cDNA 基因文库。 3.3、受体菌的筛选 步骤一:将细菌涂布到含氨苄青霉素的培养基上培养，就可得到质粒PBR322或重组质粒的细菌单菌落。 步骤二:步骤一获得的每一个细菌单菌落标记为a、b、c、d等，在每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有四环素的培养基上，不能生长的是绝大部分含有重组质粒的细菌及少量可能发生突变的非重组质粒的细菌单菌落。原因:因为PBR322含有抗四环素基因，重组质粒中目的基因插在抗四环素基因中，使其结构破坏，失去抗四环素作用。 3.4、构建工程菌 (1)对上一步获得含目的基因的大肠杆菌在含有氯霉素的培养基中扩大培养 (2)破碎大肠杆菌细胞，提取重组质粒 9 (3)纯化质粒DNA (4)对重组质粒的检测与目的基因提取 对获得的质粒进行双酶切，获得目的基因与PBR322质粒片段，通过琼脂糖凝胶电泳， 由于目的基因与PBR322质粒片段相对分子量不同，在电泳过程中产生不同的条带，通 过与已知基因长度的对比，我们可以选出相应的目的基因，接着利用Qiagen纯化柱回 收纯化DNA。具体:用3倍体积的特殊高盐溶液于55?融化带有目的基因的DNA片段的 琼脂糖凝胶块，将DNA释放到水溶液中。然后将其通过Qiagen纯化柱，经过结合—洗 涤—洗脱步骤，直接得到纯化的DNA样品。 (5)目的基因与表达载体的组合与导入 表达载体:PBV220,，将PBV220和目的基因用双酶切法处理，退火后连接，构建重组质 粒，利用CaCl2法导入到宿主大肠杆菌中，构建工程菌，在培养基中培养，利用干扰素 性质鉴定目的工程菌，分离工程菌，扩大培养，提取出质粒，分析质粒稳定性。 (6)工程菌构建流程 多次筛选阳性克隆菌;取出质粒纯化进行测序;选出正确序列的质粒培养;质粒回收试 剂盒回收;转化大肠杆菌在MD平板培养，平板中挑单菌落培养基中培养;SDS—PAGE 电泳后转膜 Westen鉴定;ELISA检测表达量;最后若菌体能进行稳定高效表达，MD板 上的菌种作为工程菌，工程菌的构建基本完成。 3.4、干扰素的提取与纯化 通过破菌,包涵体提取,离子交换层析,凝胶过滤等纯化方法制备干扰素纯品。 4、基因工程生产干扰素总结 基因工程技术使得干扰素的大规模产业化成为可能，各型重组人干扰素产品的价格下降 为千分之一以下，使得人类对干扰素的需求得到了一定程度上的满足，提高了人类的生活水 品。但是干扰素的使用也存在着一定的副作用，最常见的是发热及流感样综合征，患者体重 减轻、脱发、情绪激动，骨髓抑制致血细胞、血小板减少，轻度贫血，偶可发生神经系统损 伤，影响 《基因工程概论》华东理工大学生出版社 2001 [2]张正歌，孙宗修.转座子标签法克隆水稻基因前景.中国水稻科学，2001,15(1):46~50 [3]Novagen，Inc.pET system manual.10thed.2002 [4]Sambrook J,RussellD W.分子克隆实验指南.第3版.黄培堂等译.北京:科学出版社，2002 [5]迪芬巴赫CW，德维克勒QS.PCR技术试验指南.北京:科学出版社，1998 [6]韩志勇，沈革志.基于PCR的染色体步行技术.高技术通讯，2000,11:102~105,110 [7]黄留玉.PCR最新技术原理、方法及应用.北京:化学工业出版社，2004 [8]何秋藻等.细胞与分子免疫学.上海:上海科技文献出版社，1997 [9]龚非力.基础免疫学.武汉:湖北科技技术出版社.1998 [10] 王廷华，董坚，PetrikX L.基因克隆理论与技术.北京:科学出版社，2005 [11] 李莘，王毓平.生物化学.北京:科学出版社，2004 [12]高勤学.基因操作技术.北京:中国环境科学出版社，2007 [13] 张阳德.生物信息学.北京:科学出版社，2005 10 致谢 这次的论文能过顺利的完成，首先我想要感谢的是教我们基因操作技术课程的鞠守勇老师。因为他的教授，使我对基因工程有了更进一步的了解，知道了利用工程菌生产药物的整个流程，以及在过程中所使用的方法和注意的事项。因为对流程有了初步的了解，所以在写基因工程生产干扰素时只需要在框架中装内容，而内容则来自于有关基因工程的书籍和丰富的网络资源，所以我也很感谢学校为我们提供的资源和网络给我们带来的便利。通过此次的论文，我学到了很多的知识，也有了一定的启发，我会思考它们并加以利用。 11