肌萎灵冻干粉对运动神经元的保护作用（可编辑）

肌萎灵冻干粉对运动神经元的保护作用（可编辑） 肌萎灵冻干粉对运动神经元的保护作用 疑 难 病 杂 志 2011 年 3 月 第 1 0 卷 第 3 期 C hi n J D i f f i c a n d C o m p l C a s , M a r c h 20 11 , V o l . 1 0 N o . 3 ? 1 9 7 ? 实 验 研 究 肌 萎 灵 冻 干 粉 对 运 动 神 经 元 的 保 护 作 用 张 秋 艳 , 王 玲 玲 , 张 东 蛟 , 王 宏 涛 , 张 会 欣 , 刘 克 剑 , 崔 庆 飞 , 宋 剑 , 赵 韶 华 基 金 项 目 : 十 一 五 重 大 新 药 创 制 专 项 ( N o . 2 0 0 9 Z X 09 10 2 ? 14 0 , N o . 2 0 0 9 X 0 9 31 3 ? 0 03 ) ; 国 际 科 技 合 作 计 划 ( N o . 20 08 D F A 3 0 8 10 ) 作 者 单 位 : 05003 5 石 家 庄 , 河 北 以 岭 医 药 研 究 院 通 讯 作 者 : 张 秋 艳 , E ? m a i l : z hq y 76 @ 16 3 . c o m 【 摘 要 】 目 的 观 察 肌 萎 灵 冻 干 粉 对 大 鼠 脊 髓 损 伤 后 的 神 经 保 护 作 用 , 并 研 究 其 对 谷 氨 酸 诱 导 的 原 代 神 经 细 胞 凋 亡 的 影 响 。 方 法 以 质 量 3 0 g 静 态 压 迫 硬 膜 外 脊 髓 1 0 m i n 建 立 大 鼠 脊 髓 损 伤 模 型 , 于 术 后 第 1 天 、 7 天 、 1 4 天 进 行 各 实 验 组 神 经 功 能 评 价 , 并 观 察 损 伤 处 脊 髓 形 态 学 改 变 ; 建 立 低 浓 度 谷 氨 酸 诱 导 原 代 神 经 细 胞 的 兴 奋 性 毒 性 损 伤 模 型 , M T T 法 检 测 细 胞 活 力 , 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 率 , W e s t e r n 检 测 B c l ? 2 、 B a x 蛋 白 表 达 变 化 。 结 果 ( 1 ) 肌 萎 灵 冻 干 粉 可 明 显 提 高 脊 髓 损 伤 大 鼠 各 时 间 段 的 B B B 评 分 , 改 善 后 肢 运 动 功 能 , 减 轻 脊 髓 神 经 元 水 肿 。 ( 2 ) 肌 萎 灵 冻 干 粉 可 增 强 谷 氨 酸 损 伤 后 的 神 经 细 胞 活 力 , 缓 解 神 经 细 胞 损 伤 。 ( 3 ) 肌 萎 灵 冻 干 粉 能 显 著 减 少 谷 氨 酸 诱 导 的 神 经 细 胞 凋 亡 。 ( 4 ) 肌 萎 灵 冻 干 粉 可 不 同 程 度 的 上 调 B c l ? 2 蛋 白 表 达 , 下 调 B a x 蛋 白 表 达 。 结 论 肌 萎 灵 冻 干 粉 可 促 进 脊 髓 损 伤 大 鼠 后 肢 运 动 功 能 恢 复 , 增 强 神 经 细 胞 活 力 , 抑 制 谷 氨 酸 诱 导 的 神 经 细 胞 凋 亡 , 调 节 凋 亡 相 关 蛋 白 表 达 , 具 有 一 定 的 神 经 保 护 作 用 。 【 关 键 词 】 肌 萎 灵 冻 干 粉 ; 脊 髓 损 伤 ; 细 胞 凋 亡 ; B c l ? 2 ; B a x ; 大 鼠 【 D O I 】 1 0 . 3 9 6 9 / j . i s s n . 1 6 7 1 ? 6 4 5 0 . 2 0 1 1 . 0 3 . 0 1 4 P r o t e c t i v e e f f e c t s o f J i w e i l i n g l y o p h i l i z e d p o w d e r o n t h e m o t o r n e u r o n s Z H A N G Q i u ? y a n , W A N G L i n g ? l i n g , Z H A N G D o n g ? j i a o , e t a l . H e b e i Y i l i n g P h a r m a c e u t i c a l R e s e a r c h I n s t i t u t e , S h i j i a z h u a n g 0 5 0 0 3 5 , C h i n a 【 A b s t r a c t 】 O b j e c t i v e T o o b s e r v e t h e p r o t e c t i v e e f f e c t s o f J i w e i l i n g l y o p h i l i z e d p o w d e r ( J W L F ) o n t h e n e u r o n o f s p i ? n a l c o r d i n j u r y ( S C I ) r a t s , a n d t h e i n f l u e n c e o n p r i m a r y n e u r o n a p o p t o s i s i n d u c e d b y g l u t a m a t e i n v i t r o , a l s o e x p l o r e t h e m o ? l e c u l a r m e c h a n i s m o f J W L F o n t h e m o t o r n e u r o n d i s e a s e ( M N D ) . M e t h o d s T h e S C I m o d e l o f r a t s w e r e d e v e l o p e d w i t h s t a t i c c o m p r e s s i v e p r e s s u r e o f 3 0 g o n t h e s p i n a l e p i d u r a l f o r 1 0 m i n , t h e n e u r o n f u n c t i o n w a s e v a l u a t e d a t 1 d , 7 d a n d 1 4 d a f t e r t h e s u r g e r y a n d t h e m o r p h o l o g i c c h a n g e s o f t h e d a m a g e d s p i n a l w e r e d e t e r m i n e d . T h e p r i m a r y c o r t i c a l n e u r o n w a s d a m a g e d b y g l u ? t a m a t e a t l o w c o n c e n t r a t i o n , t h e n m e a s u r e t h e v i a b i l i t y a n d t h e e x p r e s s i o n o f B c l ? 2 , B a x w i t h m e t h o d s o f M T T , f l o w c y t o m e t r y a n d W e s t e r n b l o t . R e s u l t s ( 1 ) J W L F c o u l d o b v i o u s l y i m p r o v e B B B r a t i n g s c o r e o n S C I r a t s a t d i f f e r e n t t i m e a n d r e l e a s e t h e e d e m a o f s p i n a l n e u r o n s . ( 2 ) J W L F c o u l d e n h a n c e n e u r o n a c t i v i t y i n r a t w h i c h s u f f e r e d f r o m g l u t a m a t e a n d a l l e v i a t e n e u r o n a l i n j u r y . ( 3 ) J W L F r e m a r k a b l y i n h i b i t e d t h e n e u r o n a p o p t o s i s i n d u c e d b y g l u t a m a t e . ( 4 ) J W L F c o u l d b a l a n c e t h e e x p r e s s i o n o f B c l ? 2 a n d B a x o f n e u r o n . C o n c l u s i o n J W L F c o u l d p r o m o t e h i n d l i m b m o t o r f u n c t i o n o f S C I r a t s t h r o u g h e n h a n c i n g t h e n e u r o n a c t i v i t y a n d r e s t r a i n i n g t h e n e u r o n a p o p t o s i s . 【 K e y w o r d s 】 J i w e i l i n g l y o p h i l i z e d p o w d e r ; S p i n a l c o r d i n j u r y ; A p o p t o s i s ; B c l ? 2 ; B a x ; R a t s 运 动 神 经 元 病 ( m o t o r n e u r o n d i s e a s e , M N D ) 是 一 组 选 择 性 察 不 同 浓 度 肌 萎 灵 冻 干 粉 对 神 经 元 的 保 护 作 用 , 探 讨 其 治 疗 运 累 及 皮 质 运 动 神 经 元 、 锥 体 束 、 脑 干 运 动 神 经 元 和 脊 髓 前 角 运 动 神 经 元 病 的 分 子 机 制 。 动 神 经 元 为 主 的 一 组 慢 性 进 行 性 变 性 疾 病 , 临 床 上 兼 有 上 、 下 1 材 料 与 方 法 运 动 神 经 元 受 损 的 体 征 , 表 现 为 肌 无 力 、 肌 萎 缩 和 锥 体 束 征 , 甚 1 . 1 实 验 材 料 至 出 现 呼 吸 衰 竭 而 死 亡 。 本 病 病 因 复 杂 , 目 前 尚 缺 乏 有 效 的 治 1 . 1 . 1 药 物 : 肌 萎 灵 冻 干 粉 ( J W L F ) , 由 石 家 庄 以 岭 药 业 股 份 [ 1 , 2 ] 疗 手 段 , 中 医 药 在 改 善 患 者 临 床 症 状 、 提 高 生 存 质 量 方 面 具 有 限 公 司 提 供 ( 批 号 : 2 0 0 8 1 2 0 1 ) , 有 效 部 位 为 总 皂 苷 、 总 黄 酮 , 有 明 显 的 优 势 , 肌 萎 灵 作 为 医 院 制 剂 在 运 动 神 经 元 病 治 疗 中 取 每 支 0 . 8 g , 含 生 药 3 . 5 g , 辅 料 含 量 约 为 9 1 . 4 % , 临 床 用 量 为 每 [ 3 ] 得 较 好 的 临 床 疗 效 。 本 研 究 以 静 态 压 迫 法 建 立 大 鼠 脊 髓 损 日 2 支 。 辅 料 对 照 冻 干 粉 为 白 色 疏 松 块 状 粉 ( 由 石 家 庄 以 岭 药 伤 模 型 , 观 察 新 剂 型 肌 萎 灵 冻 干 粉 对 脊 髓 损 伤 后 的 神 经 保 护 作 业 股 份 有 限 公 司 提 供 , 批 号 : 2 0 0 9 0 3 0 3 ) 。 注 射 用 七 叶 皂 苷 钠 用 , 另 外 采 用 谷 氨 酸 诱 导 原 代 鼠 胚 大 脑 皮 层 神 经 细 胞 凋 亡 , 观 ( 冻 干 粉 ) , 1 0 m g / 支 , 黑 龙 江 省 珍 宝 岛 制 药 有 限 公 司 生 产 ( 批? 1 9 8 ? 疑 难 病 杂 志 201 1 年 3 月 第 10 卷 第 3 期 C hi n J D i f f i c a n d C o m p l C a s , M a r c h 2 01 1 , V o l . 10 N o . 3 号 : 2 0 0 9 0 4 0 1 ) 。 利 鲁 唑 , 由 S i g m a 公 司 生 产 ( 批 号 : 0 5 7 K 3 9 0 0 ) 。 脑 膜 。 无 血 清 培 养 液 洗 2 遍 , 吸 出 液 体 , 将 组 织 剪 成 细 小 碎 块 , 1 . 1 . 2 试 剂 : 谷 氨 酸 , 由 S i g m a 公 司 生 产 ( 批 号 : 1 1 8 K 0 8 8 0 1 ) ; 0 . 1 2 5 % 胰 酶 消 化 2 0 m i n , 吸 出 组 织 块 放 入 含 1 0 % F B S 的 D M E M 高 糖 D M E M 培 养 液 , 由 G i b c o 公 司 生 产 ( 批 号 : 1 2 9 0 0 0 7 ) ; 胎 牛 中 , 终 止 消 化 , 吸 管 吹 打 1 5 次 左 右 , 过 2 0 0 目 筛 网 , 8 0 0 r / m i n 离 血 清 , 由 C e l l g r o 公 司 生 产 ( 批 号 : 5 0 0 2 0 0 3 8 ) ; M T T , 超 纯 级 , 由 心 5 m i n , 弃 上 清 , 沉 淀 的 细 胞 用 含 1 0 % F B S 的 D M E M 吹 打 均 5 A m r e s s c o 公 司 生 产 ; 二 甲 基 亚 砜 ( D M S O ) : A C S g r a d e , 由 A m r e s s ? 匀 。 计 数 5 . 0 × 1 0 个 / m l , 接 种 于 9 6 孔 板 或 6 孔 板 后 继 续 培 c o 公 司 生 产 ; R I P A 裂 解 液 , 由 S o l a r b i o 公 司 生 产 ( 批 号 : 养 , 4 8 h 加 入 0 . 0 1 m m o l / L 阿 糖 胞 苷 , 作 用 2 4 h 吸 出 , 换 上 新 鲜 9 0 0 9 0 8 3 0 ) ; B c l ? 2 、 B a x 、 ? a c t i n 抗 体 均 为 S a n t a c r u z 公 司 产 品 ( 批 的 D M E M 培 养 基 。 β 号 分 别 为 D 0 6 0 9 、 C 0 9 0 9 、 F 2 0 0 7 ) 。 神 经 元 培 养 7 2 h 后 , 实 验 组 分 别 加 入 用 新 鲜 培 养 基 配 制 的 1 . 1 . 3 仪 器 系 统 : E p i c s ? X L I I 型 流 式 细 胞 仪 ( B e c k m a n C o u l ? 2 . 0 6 g / L 、 1 . 0 3 g / L 、 0 . 5 2 g / L 肌 萎 灵 冻 干 粉 , 利 鲁 唑 组 加 入 1 0 m o l / L 利 鲁 唑 , 辅 料 组 加 入 1 . 8 9 g / L 辅 料 , 空 白 对 照 组 和 模 型 t e r ) , 凝 胶 成 像 分 析 仪 ( B i o r a d ) , 凝 胶 成 像 图 像 分 析 软 件 ( Q u a n ? μ t i t y o n e ) , 5 4 1 7 R 型 低 温 离 心 机 ( E p p e n d o r f ) , X D 7 1 1 酶 标 分 析 仪 对 照 组 加 入 等 量 新 鲜 培 养 基 , 共 同 培 养 2 4 h , 除 空 白 对 照 组 外 , ( 上 海 迅 达 医 疗 仪 器 公 司 ) , 二 氧 化 碳 细 胞 培 养 箱 ( 日 本 三 洋 ) , 各 实 验 组 均 加 入 谷 氨 酸 ( 终 浓 度 为 0 . 5 m m o l / L ) , 作 用 2 4 h 后 座 式 自 动 电 热 压 力 蒸 汽 灭 菌 器 ( 上 海 申 安 医 疗 器 械 厂 ) 。 进 行 指 标 检 测 。 1 . 1 . 4 实 验 动 物 : 清 洁 级 S D 大 鼠 1 4 0 只 , 雌 雄 各 半 , 1 8 0 ~ 1 . 3 观 察 指 标 1 . 3 . 1 神 经 运 动 功 能 评 价 : 于 术 后 第 1 天 、 7 天 、 1 4 天 应 用 2 1 2 2 0 g ; 清 洁 级 S D 雌 性 孕 鼠 1 6 只 , 孕 期 1 0 ~ 1 4 d , 均 购 于 河 北 省 实 验 动 物 中 心 , 许 可 证 号 S C X K ( 冀 ) 2 0 0 8 ? 1 ? 0 0 3 。 饲 养 在 河 北 省 分 的 B a s s o ? B e a t t l e ? B r e s m a h a n ( B B B ) 评 分 法 进 行 神 经 功 能 评 价 , 中 西 医 结 合 医 药 研 究 院 新 药 评 价 中 心 , 光 照 1 2 h / d , 温 度 2 0 ~ 观 察 大 鼠 后 肢 的 行 走 及 肢 体 活 动 情 况 。 2 5 ? , 相 对 湿 度 4 0 % ~ 7 0 % 。 实 验 分 组 : ( 1 ) 脊 髓 损 伤 实 验 : 1 4 0 1 . 3 . 2 损 伤 处 脊 髓 的 形 态 学 变 化 : 脊 髓 损 伤 术 后 1 4 d 神 经 运 只 大 鼠 随 机 分 为 7 组 , 每 组 2 0 只 。 肌 萎 灵 冻 干 粉 设 高 中 低 3 个 动 功 能 评 价 结 束 后 , 取 损 伤 段 脊 髓 约 1 . 5 c m , 置 于 4 % 甲 醛 内 过 剂 量 组 , 其 剂 量 分 别 为 2 . 3 2 、 1 . 1 6 、 0 . 5 8 g 生 药 / k g ; 另 设 假 手 术 夜 进 行 固 定 , 常 规 石 蜡 包 埋 , 做 冠 状 面 连 续 切 片 , H E 染 色 , 观 察 组 、 模 型 组 、 七 叶 皂 苷 钠 组 ( 3 . 3 3 m g / k g ) 和 辅 料 组 ( 0 . 4 8 5 g / 损 伤 处 脊 髓 的 形 态 学 变 化 。 1 . 3 . 3 M T T 法 测 定 神 经 元 细 胞 活 力 : 谷 氨 酸 作 用 2 4 h 后 进 行 k g ) 。 ( 2 ) 离 体 细 胞 实 验 : 肌 萎 灵 冻 干 粉 设 高 中 低 3 个 剂 量 组 , 其 剂 量 分 别 为 2 . 0 6 、 1 . 0 3 、 0 . 5 2 g / L , 另 设 空 白 对 照 组 、 模 型 对 照 细 胞 活 力 检 测 , 在 培 养 板 中 加 入 M T T ( 5 m g / m l ) 2 0 μ l , 3 7 ? 闭 光 组 、 利 鲁 唑 组 ( 1 0 m o l / L ) 和 辅 料 组 ( 1 . 8 9 g / L ) 。 孵 育 4 h , 去 上 清 , 各 孔 加 入 D M S O 1 0 0 l , 微 型 震 荡 器 震 荡 1 0 μ μ 1 . 2 实 验 方 法 m i n 后 , 5 7 0 n m 测 定 O D 值 。 1 . 2 . 1 大 鼠 脊 髓 损 伤 模 型 的 建 立 与 干 预 : 大 鼠 以 1 0 % 水 合 氯 1 . 3 . 4 神 经 元 细 胞 凋 亡 率 检 测 : 实 验 结 束 后 , 用 0 . 1 2 5 % 胰 蛋 白 酶 消 化 收 集 细 胞 , P B S 清 洗 2 遍 , 去 上 清 液 , 用 5 0 0 l P B S 将 醛 麻 醉 , 进 入 麻 醉 状 态 后 固 定 于 手 术 台 上 , 常 规 碘 伏 消 毒 局 部 μ 皮 肤 。 以 第 1 2 胸 椎 棘 突 处 皮 肤 为 切 口 的 下 缘 , 做 中 线 3 c m 长 细 胞 沉 淀 吹 打 成 单 细 胞 悬 液 , 缓 缓 注 入 7 0 % 乙 醇 固 定 , 4 ? 保 存 的 纵 切 口 , 切 开 皮 肤 、 皮 下 , 沿 中 线 切 开 肌 筋 膜 , 暴 露 出 T 棘 过 夜 。 P B S 清 洗 2 次 , 加 入 1 m l 碘 化 丙 啶 ( P I ) 染 液 , 4 ? 冰 箱 避 9 ~ 1 1 突 , 沿 其 两 侧 锐 性 分 离 肌 肉 至 关 节 突 , 尖 嘴 咬 骨 钳 咬 除 T 及 上 光 染 色 3 0 m i n , 采 用 E p i c s ? X L ? 型 流 式 细 胞 仪 检 测 凋 亡 率 。 1 0 下 各 一 个 节 段 的 椎 板 , 暴 露 脊 髓 范 围 约 3 m m × 1 2 m m , 保 持 硬 1 . 3 . 5 神 经 元 细 胞 凋 亡 蛋 白 检 测 : 实 验 结 束 后 , 加 入 0 . 2 m l 脊 膜 完 整 , 采 用 自 制 静 态 压 迫 装 置 , 以 3 0 g 质 量 压 迫 1 0 m i n 。 R I P A 裂 解 液 冰 上 裂 解 3 0 m i n , 4 ? 、 3 0 0 0 r / m i n 离 心 2 0 m i n , 吸 滴 加 抗 生 素 , 逐 层 缝 合 切 口 。 假 手 术 组 仅 行 椎 板 切 除 手 术 , 未 取 上 清 , B C A 法 测 定 总 蛋 白 浓 度 , 用 样 品 缓 冲 液 稀 释 至 5 μ g / 行 静 态 压 迫 过 程 。 术 后 给 损 伤 组 大 鼠 行 人 工 挤 压 膀 胱 , 帮 助 排 l 。 取 1 0 0 g 的 蛋 白 样 品 进 行 1 2 % 的 S D S ? P A G E 凝 胶 电 泳 , 待 μ μ 尿 , 每 日 2 ~ 3 次 , 直 到 能 自 行 排 尿 为 止 。 目 的 蛋 白 接 近 凝 胶 中 央 部 分 时 停 止 电 泳 , 4 ? 、 1 2 0 V 恒 压 电 转 移 肌 萎 灵 冻 干 粉 0 . 8 g / 支 ( 含 生 药 3 . 5 g ) , 以 此 将 高 中 低 剂 至 P V D F 膜 上 , 5 % 脱 脂 奶 粉 室 温 封 闭 1 h 。 分 别 加 入 b c l ? 2 、 b a x 和 ? a c t i n 一 抗 , 4 ? 孵 育 过 夜 , T B S T 洗 膜 1 0 m i n × 3 次 , 加 入 辣 量 组 的 生 药 量 折 算 成 干 粉 量 , 分 别 为 0 . 5 3 0 、 0 . 2 6 5 、 0 . 1 3 3 g / k g , β 给 药 体 积 为 1 m l / 1 0 0 g 体 质 量 , 计 算 高 中 低 剂 量 药 物 配 制 浓 度 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 二 抗 ( 1 ? 1 0 0 0 0 ) 室 温 孵 育 1 h , T B S T 洗 膜 分 别 为 5 . 3 0 、 2 . 6 5 、 1 . 3 3 g / 1 0 0 m l ; 同 法 计 算 辅 料 配 制 浓 度 为 5 m i n × 3 次 。 E C L 发 光 显 色 , 凝 胶 成 像 系 统 照 相 , 采 用 Q u a n t i t y 4 . 8 5 g / 1 0 0 m l , 七 叶 皂 苷 钠 药 物 浓 度 为 3 3 . 3 m g / 1 0 0 m l 。 上 述 o n e 软 件 分 析 , 扫 描 灰 度 值 , 以 目 的 蛋 白 与 内 参 β ? a c t i n 的 比 值 药 物 均 用 生 理 盐 水 溶 解 至 相 应 浓 度 , 采 用 尾 静 脉 注 射 法 给 药 , 表 示 。 1 . 4 统 计 学 方 法 采 用 S P S S 1 3 . 0 统 计 软 件 包 。 所 有 数 据 用 假 手 术 组 、 模 型 组 大 鼠 尾 静 脉 注 射 生 理 盐 水 。 于 手 术 造 模 前 2 周 开 始 预 防 性 给 药 , 造 模 后 继 续 给 药 治 疗 2 周 。 均 数 ? 标 准 差 ( x ? ? s ) 表 示 , 数 据 首 先 进 行 正 态 性 检 验 , 符 合 正 态 分 布 的 数 据 , 多 组 间 比 较 用 单 因 素 方 差 分 析 ( O n e ? W a y A N O ? 1 . 2 . 2 谷 氨 酸 诱 导 的 原 代 神 经 元 细 胞 凋 亡 : 将 肌 萎 灵 冻 干 粉 溶 于 无 血 清 的 D M E M 中 , 配 制 成 4 1 . 2 g / L 的 母 液 , 0 . 2 2 μ m 的 V A ) , 若 方 差 齐 , 两 两 比 较 采 用 最 小 显 著 差 法 ( L S D ) , 若 方 差 不 针 头 滤 器 过 滤 除 菌 , 置 - 2 0 ? 冰 箱 保 存 。 实 验 时 用 无 血 清 齐 则 采 用 D u n n e t t ' s T 3 检 验 ; 如 不 符 合 正 态 分 布 , 则 用 非 参 数 检 D M E M 稀 释 成 相 应 浓 度 的 工 作 液 。 神 经 元 细 胞 原 代 培 养 : 碘 验 进 行 统 计 分 析 。 P < 0 . 0 5 为 差 异 有 统 计 学 意 义 。 酒 、 酒 精 依 次 消 毒 孕 鼠 腹 部 , 取 胎 鼠 大 脑 皮 层 放 于 P B S 中 , 剥 净 2 结 果疑 难 病 杂 志 2011 年 3 月 第 1 0 卷 第 3 期 C hi n J D i f f i c a n d C o m p l C a s , M a r c h 20 11 , V o l . 1 0 N o . 3 ? 1 9 9 ? 2 . 1 神 经 运 动 功 能 评 价 模 型 组 大 鼠 B B B 评 分 在 脊 髓 静 压 损 未 见 统 计 学 意 义 ( P > 0 . 0 5 ) ; 辅 料 组 B c l ? 2 和 B a x 蛋 白 表 达 与 伤 术 后 1 d 、 7 d 、 1 4 d 均 显 著 低 于 假 手 术 组 ( P < 0 . 0 1 ) ; 在 每 个 模 型 对 照 组 比 较 无 明 显 差 异 ( P > 0 . 0 5 ) 。 见 表 3 、 图 2 。 时 间 段 内 各 给 药 组 B B B 评 分 较 模 型 组 均 有 不 同 程 度 的 提 高 表 3 肌 萎 灵 冻 干 粉 对 B c l ? 2 、 B a x 蛋 白 表 达 的 影 响 ( x ? ? s ) 组 别 B c l ? 2 B a x ( P < 0 . 0 5 , P < 0 . 0 1 ) , 但 肌 萎 灵 各 剂 量 组 与 七 叶 皂 苷 钠 组 比 空 白 对 照 组 1 . 0 0 1 . 0 0 较 差 异 未 见 统 计 学 意 义 ( P > 0 . 0 5 ) , 辅 料 组 与 模 型 组 无 明 显 差 ? # 模 型 对 照 组 0 . 5 3 ? 0 . 2 3 3 . 4 1 ? 0 . 2 9 异 ( > 0 . 0 5 ) 。 每 个 实 验 组 在 不 同 时 间 段 横 向 比 较 结 果 显 示 , ? P 利 鲁 唑 组 0 . 7 7 ? 0 . 1 7 1 . 4 4 ? 0 . 6 9 ? 肌 萎 灵 高 剂 量 组 0 . 7 4 ? 0 . 1 9 1 . 6 3 ? 0 . 5 8 随 着 时 间 的 延 长 , B B B 评 分 逐 渐 升 高 , 肢 体 运 动 功 能 明 显 改 善 ? 肌 萎 灵 中 剂 量 组 0 . 8 6 ? 0 . 2 3 1 . 7 5 ? 0 . 6 7 ( P < 0 . 0 5 , P < 0 . 0 1 ) 。 见 表 1 。 肌 萎 灵 低 剂 量 组 0 . 6 3 ? 0 . 2 4 2 . 3 0 ? 1 . 1 3 表 1 各 组 不 同 时 间 B B B 评 分 结 果 比 较 ( x ? ? s , 分 ) 辅 料 组 0 . 4 7 ? 0 . 3 0 2 . 3 0 ? 1 . 6 0 ? # ? 组 别 n 1 d 7 d 1 4 d 注 : 与 空 白 对 照 组 比 较 , P < 0 . 0 5 , P < 0 . 0 1 ; 与 模 型 对 照 组 比 较 , P < ? ? ? 假 手 术 组 2 0 1 2 . 8 2 ? 2 . 7 7 1 5 . 0 9 ? 2 . 5 1 2 0 . 3 9 ? 0 . 4 7 0 . 0 5 ? ? ? # ? ? 模 型 对 照 组 2 0 1 . 2 3 ? 1 . 3 3 2 . 8 6 ? 2 . 9 1 5 . 0 0 ? 3 . 2 6 ? # ? # ? ? 七 叶 皂 苷 钠 组 2 0 2 . 4 6 ? 1 . 9 8 6 . 6 1 ? 4 . 3 1 1 0 . 6 9 ? 4 . 6 6 ? # ? ? 肌 萎 灵 高 剂 量 组 2 0 2 . 1 0 ? 1 . 4 1 5 . 5 0 ? 2 . 4 5 1 0 . 2 3 ? 2 . 8 8 # ? # ? ? 肌 萎 灵 中 剂 量 组 2 0 1 . 9 9 ? 2 . 0 4 5 . 7 9 ? 4 . 0 6 9 . 0 4 ? 4 . 3 0 ? # ? ? 肌 萎 灵 低 剂 量 组 2 0 2 . 0 8 ? 1 . 7 6 5 . 6 6 ? 5 . 5 3 8 . 9 1 ? 5 . 0 6 ? ? 辅 料 组 2 0 1 . 4 1 ? 1 . 2 7 2 . 9 8 ? 2 . 3 4 5 . 4 3 ? 2 . 7 2 ? # ? ? 注 : 与 1 d 比 较 , P < 0 . 0 5 , P < 0 . 0 1 ; 与 7 d 比 较 , P < 0 . 0 5 ; P < 0 . 0 1 ; 与 ? ? ? 假 手 术 组 比 较 , P < 0 . 0 1 , 与 模 型 对 照 组 比 较 , P < 0 . 0 5 , P < 0 . 0 1 2 . 2 损 伤 处 脊 髓 形 态 学 变 化 假 手 术 组 脊 髓 外 观 形 态 正 常 , H E 染 色 切 片 镜 下 脊 髓 结 构 正 常 。 模 型 组 受 压 脊 髓 颜 色 变 暗 , H E 染 色 切 片 镜 下 可 见 明 显 水 肿 , 神 经 元 胞 体 皱 缩 、 消 瘦 , 可 见 图 2 W e s t e r n 检 测 B c l ? 2 、 B a x 蛋 白 表 达 的 结 果 红 染 的 神 经 元 。 各 给 药 组 脊 髓 水 肿 程 度 较 轻 , 神 经 元 形 态 明 显 注 : 1 . 空 白 对 照 组 ; 2 . 模 型 对 照 组 ; 3 . 利 鲁 唑 组 ; 4 . 肌 萎 灵 高 剂 量 组 ; 5 . 肌 萎 灵 改 善 。 图 1 见 封 3 。 中 剂 量 组 ; 6 . 肌 萎 灵 低 剂 量 组 ; 7 . 辅 料 组 2 . 3 对 神 经 元 细 胞 活 力 的 影 响 与 空 白 对 照 组 相 比 , 模 型 对 3 讨 论 [ 4 ] 照 组 神 经 元 细 胞 活 力 明 显 下 降 ( P < 0 . 0 1 ) , 各 给 药 组 均 可 增 强 M N D 是 一 种 渐 进 的 致 命 性 神 经 变 性 疾 病 , 包 括 肌 萎 缩 侧 神 经 元 细 胞 的 活 力 ( P < 0 . 0 1 ) , 对 谷 氨 酸 造 成 的 兴 奋 性 毒 性 损 索 硬 化 ( A L S ) 、 脊 髓 性 肌 萎 缩 ( S M A ) 、 原 发 性 侧 索 硬 化 ( P L S ) 及 伤 具 有 显 著 的 保 护 作 用 , 但 肌 萎 灵 各 剂 量 组 与 利 鲁 唑 组 比 较 差 进 行 性 延 髓 麻 痹 ( P B P ) 等 多 种 综 合 征 , 该 病 有 2 种 发 病 形 式 , 肢 异 未 见 统 计 学 意 义 ( P > 0 . 0 5 ) , 辅 料 组 与 模 型 组 无 明 显 差 异 体 发 病 或 延 髓 发 病 , 均 表 现 为 上 、 下 运 动 神 经 元 受 损 , 导 致 渐 进 ( P > 0 . 0 5 ) 。 见 表 2 。 性 和 不 可 逆 的 肌 肉 消 瘦 和 无 力 。 尽 管 该 病 的 发 病 机 理 尚 未 完 表 2 肌 萎 灵 冻 干 粉 对 神 经 元 细 胞 活 力 及 凋 亡 率 的 影 响 ( x ? ? s ) [ 5 ] 全 弄 清 , 但 谷 氨 酸 毒 性 是 神 经 元 损 伤 的 一 种 可 能 原 因 , 谷 氨 组 别 O D 值 凋 亡 率 ( % ) 酸 是 哺 乳 类 动 物 神 经 系 统 内 含 量 最 高 的 氨 基 酸 类 神 经 递 质 , 也 空 白 对 照 组 0 . 2 2 0 ? 0 . 0 5 9 2 . 5 0 ? 0 . 9 1 ? ? 是 最 主 要 的 兴 奋 性 神 经 递 质 。 正 常 情 况 下 , 谷 氨 酸 作 为 兴 奋 性 模 型 对 照 组 0 . 0 9 7 ? 0 . 0 2 2 1 4 . 0 8 ? 2 . 7 2 # # 利 鲁 唑 组 0 . 2 5 9 ? 0 . 0 6 5 3 . 4 9 ? 1 . 0 4 神 经 递 质 参 与 神 经 系 统 的 信 息 传 递 , 病 理 情 况 下 细 胞 外 谷 氨 酸 # # 肌 萎 灵 高 剂 量 组 0 . 2 2 3 ? 0 . 0 6 2 3 . 5 5 ? 0 . 6 8 浓 度 的 异 常 增 高 , 过 度 刺 激 其 受 体 , 对 中 枢 神 经 系 统 有 明 显 的 # # 肌 萎 灵 中 剂 量 组 0 . 1 6 2 ? 0 . 0 1 7 5 . 0 2 ? 0 . 4 9 # # 毒 性 作 用 。 在 A L S 等 疾 病 中 , 谷 氨 酸 诱 导 神 经 通 路 异 常 激 活 而 肌 萎 灵 低 剂 量 组 0 . 1 5 2 ? 0 . 0 2 6 6 . 1 8 ? 0 . 1 3 辅 料 组 0 . 0 8 3 ? 0 . 0 1 7 1 6 . 5 6 ? 9 . 6 9 产 生 兴 奋 性 毒 性 , 是 造 成 神 经 元 损 伤 的 重 要 因 素 。 利 鲁 唑 ( 力 ? # 注 : 与 空 白 对 照 组 比 较 , P < 0 . 0 1 ; 与 模 型 对 照 组 比 较 , P < 0 . 0 1 如 太 ) 是 首 个 被 美 国 F D A 和 欧 盟 批 准 用 于 治 疗 A L S 的 药 物 , 也 2 . 4 对 神 经 元 细 胞 凋 亡 率 的 影 响 谷 氨 酸 损 伤 后 神 经 元 细 胞 是 目 前 惟 一 被 证 实 能 够 延 缓 A L S 病 程 的 药 物 , 该 药 能 透 过 血 脑 出 现 明 显 的 凋 亡 , 凋 亡 率 显 著 上 升 ( P < 0 . 0 1 ) , 利 鲁 唑 组 与 肌 屏 障 , 主 要 通 过 抑 制 脑 内 神 经 递 质 ( 谷 氨 酸 和 天 冬 氨 酸 ) 的 释 萎 灵 冻 干 粉 各 组 均 可 明 显 减 少 神 经 元 细 胞 的 凋 亡 ( P < 0 . 0 1 ) , 放 、 抑 制 兴 奋 性 氨 基 酸 的 活 性 及 稳 定 电 压 依 赖 性 钠 通 道 的 失 活 利 鲁 唑 组 与 肌 萎 灵 各 组 比 较 , 凋 亡 率 仅 见 降 低 趋 势 , 但 未 见 统 状 态 , 从 而 减 少 兴 奋 性 递 质 的 毒 性 , 产 生 神 经 保 护 作 用 。 国 外 2 计 学 差 异 ( > 0 . 0 5 ) 。 辅 料 组 凋 亡 率 与 模 型 组 相 比 无 明 显 差 P [ 6 , 7 ] 项 多 中 心 临 床 试 验 表 明 : 利 鲁 唑 可 延 长 患 者 从 轻 或 中 度 受 异 ( P > 0 . 0 5 ) 。 见 表 2 。 损 状 态 进 展 到 重 度 或 终 末 期 的 时 间 , 1 2 个 月 及 1 8 个 月 时 的 存 2 . 5 对 B c l ? 2 、 B a x 蛋 白 表 达 的 影 响 谷 氨 酸 诱 导 的 原 代 神 经 活 率 明 显 高 于 安 慰 剂 组 , 但 并 不 能 改 善 患 者 的 运 动 功 能 。 新 近 元 损 伤 可 以 显 著 抑 制 B c l ? 2 蛋 白 表 达 ( < 0 . 0 5 ) , 上 调 B a x 蛋 P [ 8 ] Z o c c o l e l l a 等 研 究 发 现 : 利 鲁 唑 只 对 延 髓 起 病 的 A L S 或 者 老 白 的 表 达 ( P < 0 . 0 1 ) ; 利 鲁 唑 组 和 肌 萎 灵 冻 干 粉 高 、 中 剂 量 组 龄 A L S 患 者 显 示 有 疗 效 , 且 疗 效 短 暂 , 长 期 随 访 2 年 时 疗 效 消 能 够 显 著 抑 制 B a x 蛋 白 的 表 达 ( P < 0 . 0 5 ) , 对 B c l ? 2 蛋 白 表 达 失 , 对 四 肢 起 病 的 A L S 则 疗 效 甚 微 。 由 此 可 见 利 鲁 唑 作 为 一 种 有 明 显 的 上 调 趋 势 , 但 差 异 无 统 计 学 意 义 ( P > 0 . 0 5 ) ; 利 鲁 唑 谷 氨 酸 释 放 抑 制 剂 , 虽 能 通 过 多 种 途 径 对 抗 谷 氨 酸 的 兴 奋 毒 组 与 肌 萎 灵 各 组 比 较 , B c l ? 2 和 B a x 蛋 白 表 达 仅 见 降 低 趋 势 , 但 性 , 减 慢 疾 病 的 发 展 , 提 高 延 髓 首 发 型 患 者 的 存 活 率 , 但 并 不 能