NogoA在脑缺血再灌注白质损伤中的表达及其意义

NogoA在脑缺血再灌注白质损伤中的达及其意义 DOC,方便您的复制修改删减 NogoA在脑缺血再灌注白质损伤中的 表达及其意义 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 作者,高晓玉 王得新 张拥波 【摘要】 目的 检测脑缺血再灌注后不同时间点轴突生长抑制因子NogoA在损伤白质区的基因表达,探讨NogoA与缺血再灌注白质损伤的可能关系。方法 制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)模型,实时定量聚合酶链反应方法(Relative Quantification PCR,RQ PCR)检测各时间点NogoA在损伤白质区域的基因表达。结果 在损伤白质区域,NogoA基因表达在缺血再灌注1 d时表达量开始减少(与假手术组相比,P0.05),7 d时降至最低,14,21 d表达量开始上调,21 d时仍低于假手术组水平(与假手术组相比,P0.001)。结论 缺血再灌注损伤后白质区域的NogoA基因表达呈现动态变化规律,针对NogoA进行干预有望为缺血再灌注损伤后的脑保护治疗找到新的靶点。 【关键词】 脑缺血; NogoA;白质损伤 【Abstract】 Objective To study the expression of NogoA DOC格式论文,方便您的复制修改删减 in cerebral white matter after focal cerebral ischemiareperfusion(I/R) in rats, and explore the relationship between Nogo A and cerebral white matter lesions after ischemia. Methods SpragueDawley male rats were subjected to 2 h of middle cerebral artery occlusion (MCAO). Relative quantification PCR(RQ PCR) was performed to examine the expressions of NogoA gene at different reperfusion time. Results The expression level of NogoA gene in the white matter was decreased in 1 d group(P0.05 vs sham group),and was the weakest in 7 d group. It was increased in 14,21 d group, and in 21 d the expression level was still lower than that of sham group(P0.001). Conclusions Nogo A expreesion has dynamic changes in the white matter after focal cerebral I/R. NogoA could be as one of the targets for neuroprotective therapy after cerebral ischemia. 【Key words】 Cerebral ischemia; NogoA; White matter lesion 2000年,Chen等人克隆出大鼠和人类抑制受损轴突再生的基因 NogoA基因〔1,3〕。这一基因广泛存在于中枢神经系统神经 元和少突胶质细胞中,NogoA蛋白与NogoA基因分布一致〔4〕。 中枢神经损伤后NogoA蛋白与p75NTRNgR受体复合物结合, 发挥抑制神经再生的作用〔5〕。给大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠注射 抗NogoA的单克隆抗体中和其作用,可以使轴突分支及树状棘的 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 密度增加,即使给正常大鼠注射,也能产生短暂的轴突过度生长的现象〔6〕。这说明NogoA在一定程度上可以限制轴突再生。NogoA的发现,为中枢神经系统的损伤修复带来了新的希望。而目前有关NogoA与缺血再灌注白质损伤的关系并不清楚。本实验利用大鼠MCAO模型,观察再灌注损伤后NogoA基因在损伤白质区域表达的时空变化规律,以探讨NogoA与缺血性脑白质损伤的可能关系。 1 材料与方法 1.1 动物 成年健康雄性Sprague Dawley大鼠48只,SPF级,体重250,280 g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物自由进食进水。 1.2 大脑中动脉阻塞(MCAO)模型的制备 动物房12 h光暗交替,55%相对湿度,温度22?。动物适应环境1 w后开始实验。应用线栓法建立右侧MCAO模型〔7,8〕。随机分为缺血120 min再灌流6、12 h、1、3、7、14、21 d组,每组6只,用于实时定量聚合酶链反应(RQPCR)的检测。另取6只作为假手术组,假手术组除插线长度为15 mm外,余步骤同实验组。参照Zea Longa 5分制评分〔8〕,待大鼠麻醉清醒后进行评分,剔除评分为0分或4分的大鼠。每组大鼠在规定的时间点取材,假手术组于手术后1 d取材。以10%水合氯醛(0.6 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠,立刻断头,冰上取右脑,切去距离额极、枕极各2 mm的脑组织,剩余部分分离出白质区域后液氮速冻后-80?冻存,用于RQPCR检测。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 1.3 RQPCR检测NogoA基因 用Prime 5.0软件引物,由大连宝生物公司合成。NogoA,F,CTGCTGCATCTGAGCCTGTGATA;R,AGGCAGCAGTTTCAAGCAGGA,扩增产物为126 bp。GAPDH为大连宝生物公司试剂,扩增产物为133 bp。引物设计后通过BLAST分析(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)避免扩增的序列存在非特异性,用oligo demo软件测试序列无引物二聚体形成。实验步骤如下,RNAprep动物组织总RNA提取试剂盒(Tiangen Biotech CO,LTD)提取总RNA,琼脂糖凝胶电泳,鉴定提取RNA质量,采用ProtoScriptTM第一链cDNA合成试剂盒( 购自New England BioLabs)将总RNA逆转录为cDNA,然后将PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳后于紫外透射仪上观察并照相。最后采用 SYBR PQPCR检测(SYBR green PCR master mix 购自 Applied Biosystems,USA),RQPCR在96孔聚丙烯反应板上、置于实时PCR仪上进行,每个样品均重复3次。按以下反应体系进行,2×SYBR Green master mix 10 μl, 上游引物0.25 μl,下游引物0.25 μl,模板1 μl,加不含RNA酶的水至反应体系为20 μl,短暂离心后进行扩增,反应条件,50? 2 min,95? 10 min,95? 15 s,60? 1 min后两步共进行50次。反应结束后,进行熔解曲线分析,反应条件为95? 15 s, 60? 20 s,95? 15 s,全部反应结束后,由电脑自动分析并计算结果。 1.4 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件,所有数据均以x?s DOC格式论文,方便您的复制修改删减 表示,采用方差分析比较各组变量的差异。 2 结 果 NogoA基因表达于缺血再灌注1 d时降至假手术组的84%(P0.05),7 d时降至最低点,为假手术组的30%,14,21 d时表达量开始上调,21 d时表达量上调至假手术组的66%(P0.001),但仍明显低于假手术组。见图1。